酶活力檢測方法

❶ sod酶活性測定方法

1、測定方法很多，常見的有化學法、免疫法和等電點聚焦法。其中化學法應用最普遍，化學法的原理主要是利用有些化合物在自氧化過程中會產生有色中間物和O2 -，利用SOD分解而間接推算酶活力。
2、在化學方法中，最常用的有黃嘌呤氧化酶法，鄰苯三酚法，化學發光法，腎上腺素法，NBT-還原法，光化學擴增法，Cyte還原法等。
（1）改良的鄰苯三酚自氧化法簡單易行較為實用。
（2）化學發光法和光化學擴增法不適用於測定Mn-SOD，但對於Cu/Zn-SOD反應極靈敏。（3）Cyte還原法用於Mn-SOD活力測定結果穩定，重復性好。但專一性和靈敏度不夠理想，而且需要特殊儀器，實際應用受到限制。
（4）亞硝酸鹽形成法與CN—抑制劑或SDS處理相結合，應用於Mn-SOD測定，靈敏度比Cyte還原法提高數倍，而且專一性強，重復性好，操作方便，不需要特殊儀器和設備，易於實際應用和推廣，是目前較好的測定方法之一。

❷ 酶活測定方法有哪些原則最好是詳細的答案

一、原則
pH值和溫度
體外測定酶活力時選擇的測定條件應盡可能接近酶在動物體內的消化環境。

干擾成分
側定酶活力時應盡可能的去除干擾成分。

底物
在選擇底物時一定要用純度較高的底物，底物的反應濃度也不應太高。

酶樣的稀釋度
稀釋度要適中，過高，酶活力與產物生成量的關系就會超出線性范圍。

其他因素
酶促反應時間、反應體系的離子強度等因素也可以影 響酶活力的測定結果。因此,在酶活力體外測定時需要對這些 因素進行深人研究。

二、酶活測定方法
還原法
酶與底物在特定的條件下反應,酶可以促使底物釋放出還原性的基團。在此反應體系中添加化學試劑 ,酶促反應的產物可與該化學試劑發生反應,生成有色物質。通過在特定的波長下 比色 ,即可求 出還原產物的含量 ,從而計算出酶活力的大小 。

色原底物法
通過底物與特定的可溶性生色基團物質結合,合成人工底物。該底物與酶發生反應後 ,生色基團可被釋放出來 ,用分光光度法即可測定顏色的深淺,在與已知標准酶所做的曲線比較後 ,即可求出待測酶的活力。

粘度法
該法常用於測定纖維素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶 的活力。木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情況下可形成極高的粘度,當酶作用於粘性底物時木聚糖和β-葡聚糖會被切割成較小的分子使其粘度大 為降低。基 於Poiseuille定律我們知道 ,只要測定一定條件下溶劑和樣品溶液的運動粘度,便可計算特性粘數,並以此來判斷酶的活力。

高壓液相色譜法
酶與其底物在特定的條件下充分反應後 ,在一定的色譜條件下從反應體系中提取溶液進行色譜分析,認真記錄保留時間和色譜圖,測量各個樣的峰高和半峰高,計算出酶促反應生成物的含量 ,從而換算出酶活力的數值。

免疫學方法
常用 於酶活性分析的免疫學方法包括:免疫電泳法 、免疫凝膠擴散法。這兩種方法都是根據酶與其抗體之間可發生特定的沉澱反應 ,通過待測酶和標准酶的比較,最終確定酶活力。免疫學方法檢側度非常靈敏,可檢側出經過極度稀釋後樣品中的酶蛋白,但其缺點是不同廠家生產的酶產品需要有不同特定的抗體發生反應。

瓊脂凝膠擴散法
將酶作用的底物與瓊脂混合熔融後 ,倒入培養皿中或載波片上製成瓊脂平板。用打孔器在瓊脂平面上打出一個約4-5mm半徑 的小孔。在點加酶樣並培養24h以後 ,用染色劑顯色或用展開劑展開顯出水解區,利用水解直徑和酶活力關系測定酶活力。

❸ 測定鹼性蛋白酶活有哪些方法

鹼性蛋白酶酶活力檢測方法

酶活力是指酶催化某些化學反應的能力。酶活力的大小可以用在一定條件下它所催化的某一化學反應的速度來表示。測定酶活力實際就是測定被酶所催化的化學反應的速度。酶促反應的速度可以用單位時間內反應底物的減少量或產物的增加量來表示，為了靈敏起見，通常是測定單位時間內產物的生成量。由於酶促反應速度可隨時間的推移而逐漸降低其增加值，所以，為了正確測得酶活力，就必須測定酶促反應的初速度。

鹼性蛋白酶酶活測定原理 福林法原理

鹼性蛋白酶在鹼性條件下，可以催化酪蛋白水解生成酪氨酸。酪氨酸為含有酚羥基的氨基酸，可與福林試劑（Folin)（磷鎢酸與磷鉬酸的混合物）發生福林酚反應。（福林酚反應：福林試劑在鹼性條件下極其不穩定，容易定量地被酚類化合物還原，生成鎢藍和鉬藍的混合物，而呈現出不同深淺的藍色。）利用比色法即可測定酪氨酸的生成量，用鹼性蛋白酶在單位時間內水解酪蛋白產生的酪氨酸的量來表示酶活力，以此計算其酶活力。

酶活力測定實驗步驟

酶液制備：精確稱取干酶粉1g（±0.001），加入10mL緩沖液（2.2.5），在小燒杯中溶解，並用玻璃棒攪拌，靜置片刻後，將上層液小心傾入容量瓶中，沉渣部分再加入少量緩沖液，如此反復攪拌溶解4次，最後全部移入100mL容量瓶中。用緩沖液定容至刻度，充分搖勻，用四層紗布過濾。吸取濾液5mL，移入100mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，所得液位稀釋2000倍的酶液。（稀釋倍數具體要看待測酶樣品的酶活）

酶活定義

鹼性蛋白酶活力單位的定義：1克鹼性蛋白酶粉在pH10，40℃的條件下，每分鍾水解酪蛋白能產生1微克酪氨酸，定為一個酶活力單位。

酶活力測定注意事項

1、酶反應的溫度、pH和時間對被水解的肽鍵數量有直接的影響，因此必須嚴格控制。

2、用三氯醋酸終止反應後，過濾反應混合物所得的濾液必須是澄清的。

3、因為Folin試劑對酸性環境比較敏感，容易發生變化，因此在測定時有順序的規定，需要先加入碳酸鈉溶液形成一個鹼性環境，之後再加入Folin試劑，使其能正常發揮作用

❹ 什麼是酶活力測定的終點法此法有何優缺點

酶活力測定常用的方法有終點法和動力學方法兩類。
終點法
測定完成一定量反應所需的時間，如α-澱粉酶的活力測定。因為碘對澱粉呈現藍色反應，當澱粉溶液中加入澱粉酶後，碘的藍色反應消失而呈現紅棕色；碘對澱粉顏色反應消失的時間可表示澱粉酶活力的大小。碘對澱粉顏色反應消失花的時間越短，表示酶的活力越高。
動力學方法
測定一定時間內所起的化學反應量。
①比色法 如果酶反應的產物可與特定的化學試劑反應而生成穩定的有色溶液，且生成顏色的深淺與產物的濃度在一定的范圍內有線性關系可用此法。如蛋白酶的活力測定：蛋白酶可水解酪蛋白，產生的酪氨酸可與福林試劑反應生成穩定的藍色化合物，在一定的濃度范圍內，所生成藍色化合物顏色的深淺與酪氨酸的量之間有線性關系，可用於定量測定。
②量氣法 主要用於有氣體產生的酶促反應。如氨基酸脫羧酶、脲酶的活力測定。產生的二氧化碳量可用特製的儀器如瓦氏呼吸儀測定之。根據氣體變化和時間的關系，即可求得酶反應的速度。
③滴定法 如果產物之一是自由的酸性物質可用此法。如脂肪酶催化脂肪水解，脂肪酸的增加量代表脂肪酶的活力。
④分光光度法 利用底物和產物光吸收性質的不同，可直接測定反應混合物中底物的減少量或產物的增加量。幾乎所有的氧化還原酶都使用該法測定。如還原型輔酶Ⅰ(NADH2)和輔酶Ⅱ(NADPH2)在340nm有吸收，而NAD和NADP在該波長下無吸收，脫氫酶類可用該法測定。該法測定迅速簡便，自動掃描分光光度計的使用對酶活力的快速准確的測定提供的極大的方便。
⑤放射測量法 是酶活力測定中較常用的一種方法。一般用放射性同位素標記底物，在反應進行到一定程度時，分離帶放射性同位素標記的產物並進行測定，就可測知反應進行的速度。常用的同位素有3H，14C，32P，35S，131I等。如脲酶，將底物尿素用14C標記，產生的帶放射性的CO2氣體可用標准計數法進行測定。
⑥酶偶聯分析 某些酶本身沒有合適的測定方法，但可偶聯另一個酶反應進行測定。其基本方法為：應用某一高度專一性的工具酶使被測酶反應能繼續進行到某一可直接連續且簡便准確測定階段的方法。如：被測E1反應的產物B是某一脫氫酶(E2)的底物，向反應體系中加入足量的脫氫酶和NAD+或NADPH+，使反應由A經B繼續進行到C，然後測定NADH或NADPH的特徵吸收光譜的變化，即可間接地測定E1的活力大小。如己糖激酶的活力測定即應用這一方法。注意：使用該法要求指示酶必須很純，且具有高度的專一性，以免干擾反應而給測定帶來麻煩。

❺ SOD酶的活力的測定

SOD酶的活力的測定方法如下：
1.直接法 原理是根據O2 或產生O2 的物質本身的性質測定O2 的歧化量，從而確定SOD的活性。經典的直接法包括：脈沖輻射分解法、電子順磁共振波法（EPR）、核磁共振法。由於所需的儀器設備價格昂貴，一般較少應用。

2.一般化學法 這些方法的共同特點是要有一個O2 的產生體系和一個被O2 還原或氧化的可檢測體系。在SOD存在下，一部分O2 被SOD歧化，因而O2 還原或氧化檢測體系的反應受到抑制。根據反應受抑製程度，測定SOD的活性。一般化學法有鄰苯三酚自氧化法、細胞色素C還原法、羥胺法、黃嘌呤氧化酶-NBT法、腎上腺素法、沒食子酸法、6-羥多巴胺法、亞硝酸鹽形成法和鹼性二甲亞碸法。

❻ 酶活力的測定方法及原理

酶活力的測定方法：有兩種主要方法即終止反應法和連續反應法。
終止反應法：是在恆溫反應系統中，每隔一定時間，取出一定體積的反應液，用強酸強鹼或SDS以及加熱等使反應立即停止，然後用化學法放射性化學法或酶偶聯法分析產物的形成量或底物的消耗量。這是最經典的酶活力測定方法，幾乎所有的酶都可以根據這一原理設計出具體的測定方法。
連續反應法：無須終止反應，而是在酶反應過程中用光化學儀器或電化學儀器等來監測反應的進行情況，對記錄結果進行分析，然後計算出酶活力。
酶活性測定的原理：
1. 超氧物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）
活性的測定 SOD採用氮藍四唑（nitro-blue tetrazolium，NBT）法（Beauchamp和Fridovich，1971）。反應步驟為：取200μl粗提液，加入3.7 ml NBT反應液50mmol/LpH7.8的磷酸緩沖液（PBS）配製的含77.12μmol/L氮藍四唑, 100μmol/LEDTA－Na2和13.37mmol/L甲硫氨酸溶液〕，在30℃下保溫2分鍾後加入100μl核黃素溶液（pH7.8的50mmol/L磷酸緩沖液中含80.2μmol/L 核黃素和100μmol/LEDTA－Na2），在4000Lx日光下反應20min。然後迅速測定A560。以不照光的管做空白。用酶標儀進行測定時按比例調整為總反應體積為400μL。酶活性按以下公式計算：以抑制NBT光化還原的50％為一個SOD活性單位，結果以U/mg蛋白表示。以加緩沖液代替酶液的作為對照。
SOD總活性＝(Ack－AE)×V/(Ack×0.5×W×Vt) 式中， Ack為照光對照管的吸光度；AE為樣品管的吸光度；V為樣品液總體積（ml）；Vt為測定時樣品用量（ml）；W為樣品鮮重（g）或蛋白質含量（mg）。
2. 過氧化氫酶（Catalase，CAT）
活性測定 CAT 活性參照Aebi (1984)[7]的方法進行測定。用酶標儀進行測定時按比例調整為總反應體積為400μL 。400 μL反應液含50 mmol/L的PBS (pH 7.0)，30 mmol/L的H2O2和50 µL粗酶液。反應從加入過氧化氫開始計時，連續測定在240 nm吸光度的降低值。酶活性定義為：一個過氧化氫酶單位相當於在規定條件下於溫度25℃，pH7.0條件下1分鍾分解1μmol過氧化氫所需酶量，結果以U/mg蛋白或U/g鮮重表示。
3. 多酚氧化酶（Polyphenoloxidase，PPO）
活性的測定 PPO活性測定採用鄰苯二酚法（Aquino-Bolaños和Mercado-Silva，2004）。用酶標儀進行測定時按比例調整為總反應體積為400μL。350µL反應液（用50mmol/L，pH6.4的PBS配製，內含100µmol/L鄰苯二酚）中加入50 µL的粗酶液，平衡1分鍾後連續測定398nm吸光度的變化。以1分鍾內398nm吸光度上升0.01為一個酶活性單位，結果以U/mg蛋白或U/g鮮重表示。
4. 過氧化物酶（Peroxidase，POD）
活性測定POD活性測定採用愈創木酚法（Lurie等，1997)。用酶標儀進行測定時按比例調整為總反應體積為400μL。反應體系為30μL粗酶液，290 µL 0.3%愈創木酚（用50 mmol/L的PBS配製，pH 6.4）和 80µL0.3%H2O2（用50 mmol/L的PBS配製，pH 6.4）。反應在加入H2O2 後開始准確記時。連續吸光度在470 nm的上升值。酶活性以每分鍾上升0.01為一個單位，結果以U/mg蛋白或U/g鮮重表示。

❼ 酶活力測定的方式方法有哪些

測定酶活力，可用物理法，化學法或酶分析法等方法。常用的方法有：第一，在適當的條件下，把酶和底物混合，測定生成一定量產物所需的時間，此即終點法。第二，將酶和底物混合後隔一定時間，間斷地或連續地測定反應的連續變化，如吸收度的增加或減少。
第三，將酶與底物混合後，讓其反應一定時間，然後停止反應，定量測定底物減少或產物生成的量。後兩種方法稱為動力學法或反應速率法：按取樣及檢測的方式可稱為取樣測定法或連續測定法。
（1）定時法：（兩點法）

通過測定酶反應開始後某一時間段內（t1到t2）產物或底物濃度的總變化量來求取酶反應初速度的方法。其中t1往往取反應開始的時間。

酶與底物在一定溫度下作用一段固定的時間，通過加入強酸、強鹼、蛋白醫學教育網整理沉澱劑等，使反應完全停止（也叫中止反應法）。加入試劑進入化學反應呈色測出底物和產物的變化。

該法最基本的一點是停止反應後才測定底物或物的變化。

優點：簡單易行，對試劑要求不高。

缺點：難保證測定結果的真實性。

難以確定反應時間段酶促反應是否處於線性期。隨著保溫時間的延續，酶變性失活加速。

（2）連續監測法：

又稱為動力學法或速率法、連續反應法。

在酶反應過程中，用儀器監測某一反應產物或底物濃度隨時間的變化所發生的改變，通過計算求出酶反應初速度。

連續監測法根據連續測得的數據，可選擇線性期的底物或產物變化速率用於計算酶活力。

因此連續監測法測定酶活性比定時法更准確。

實際工作中，採用工具酶的酶偶聯法已經成為醫學教育網整理應用最廣、最頻繁測酶活性濃度的方法。

（3）平衡法：

通過測定酶反應開始至反應達到平衡時產物或底物濃度總變化量來求出酶活力的方法，又叫終點法。

❽ 酶活力的常用測定方法

常用的測定方法有取樣法和連續法。

1、取樣法

在酶反應開始後不同的時間，從反應系統中取出一定量的反應液，並用適當方法停止其反應，再根據產物和底物在化學性質上的差別進行分析，求得單位時間內酶促反應的變化量。

2、連續法

基於底物和產物在物理化學性質上的不同，在反應過程中對反應系統添加酶的變性劑以終止反應，常用的連續測定法是光吸收測定法，即根據產物和底物在某一波長或波段上有明顯的特徵吸收差別而建立起來的連續觀測方法，幾乎所有的氧化還原酶都可用此法測定。

此外如熒光法、旋光法、電化學法也是常用的連續測定方法。對不易直接測定的反應，可使用酶偶聯分析法，即用過量、專一的「偶聯工具酶」，使被測反應繼續進行到某一可直接測定的階段。近年來，酶活性的測定工作正向兩個方向發展，超微量酶活的靈敏測定，實現測定過程的自動化控制。

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酶活力的大小可以用在一定條件下，它所催化的某一化學反應的轉化速率來表示，即酶催化的轉化速率越快，酶的活力就越高；反之，速率越慢，酶的活力就越低。所以，測定酶的活力就是測定酶促轉化速率。酶轉化速率可以用單位時間內單位體積中底物的減少量或產物的增加量來表示。

酶活力的測定既可以通過定量測定酶反應的產物或底物數量隨反應時間的變化，也可以通過定量測定酶反應底物中某一性質的變化，如黏度變化來測定。通常是在酶的最適PH 值和離子強度以及指定的溫度下測定酶活力。