㈠ 磷酸化蛋白的轉錄情況能用PCR檢測嗎
首先，磷酸化形式的蛋白屬於蛋白質，蛋白質不能用pcr檢測，pcr只能檢測dna；其次，蛋白需要用wb檢測，磷酸化蛋白有專用的wb檢測方法。
㈡ 蛋白磷酸化的位點確定方法，質譜有什麼缺點
質譜中出現的離子有分子離子、同位素離子、碎片離子、重排離子、多電荷離子、亞穩離子、負離子和離子－分子相互作用產生的離子。綜合分析這些離子，可以獲得化合物的分子量、化學結構、裂解規律和由單分子分解形成的某些離子間存在的某種相互關系等信息。
質譜法特別是它與色譜儀及計算機聯用的方法，已廣泛應用在有機化學、生化、葯物代謝、臨床、毒物學、農葯測定、環境保護、石油化學、地球化學、食品化學、植物化學、宇宙化學和國防化學等領域。近年的儀器都具有單離子和多離子檢測的功能，提高了靈敏度及專一性，靈敏度可提高到10(克水平。用質譜計作多離子檢測，可用於定性分析，例如，在葯理生物學研究中能以葯物及其代謝產物在氣相色譜圖上的保留時間和相應質量碎片圖為基礎，確定葯物和代謝產物的存在；也可用於定量分析，用被檢化合物的穩定性同位素異構物作為內標，以取得更准確的結果。
在無機化學和核化學方面，許多揮發性低的物質可採用高頻火花源由質譜法測定。該電離方式需要一根純樣品電極。如果待測樣品呈粉末狀，可和鎳粉混合壓成電極。此法對合金、礦物、原子能和半導體等工藝中高純物質的分析尤其有價值，有可能檢測出含量為億分之一的雜質。
利用存在壽命較長的放射性同位素的衰變來確定物體存在的時間,在考古學和地理學上極有意義。例如,某種放射性礦物中有放射性鈾及其衰變產物鉛的存在，鈾238和鈾235的衰變速率是已知的，則由質譜測出鈾和由於衰變產生的鉛的同位素相對豐度，就可估計該軸礦物生成的年代。
㈢ 如何用western來檢測基因的磷酸化水平
應該是蛋白質的磷酸化水平吧。用特異性識別磷酸化位點的抗體來做western blot，再用普通的不識別磷酸化位點的抗體做一遍，比較一下強度比值即可。但很多磷酸化位點的抗體不好買或者識別效果不好，還有磷酸化水平很低，難以檢測到。這時可能需要先用TiO2等方法富集磷酸化蛋白，再按上面的方法用兩種抗體來做western blot。
㈣ 分子生物學 蛋白質磷酸化分析技術
在所 有 的 翻譯後修飾中，可逆的磷酸化，幾乎調節著生命活動的整個過程，包括細胞的增殖、發育和分化，神
經活動，肌肉收縮，新陳代謝，腫瘤發生等。據統計，哺乳動物細胞內有三分之一以上的蛋白質可以被磷酸化川，蛋白質的可逆磷酸化使得蛋白質組學研究更為復雜。 真核 生 物 細胞蛋白質中主要的磷酸化氨基酸為
絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸，其比例大概為1800:200:11 21。大多數磷酸化蛋白質都有多個磷酸化位點，並且其磷酸化位點是可變的。因此，一種蛋白可能有多種磷酸化形式。雖然對磷酸化蛋白質組學分析已有很大進步，但依然存在多個難點19待解決包括磷酸化蛋白和膚段的富集，可逆性磷酸化位點的鑒定以及磷酸化位點的定量等。1 磷酸化蛋白的識別
磷 酸 化 蛋白在細胞中含量甚微。在質譜分析中，磷酸化肚段的信號往往被非磷酸化膚段的信號所抑制。因而磷酸化蛋白和膚段的富集在提高磷酸化 位點的檢測中佔有非常重要的地位。
1. 1 磷酸化蛋白的富集
過 去 關 於 磷 酸化蛋白富集的方法主要應用針對特 定蛋白的抗體進行免疫沉澱。但該法需要首先對
蛋 白有所了解，且不適合大規模研究。雖然，近來關 於針對磷酸化基團的抗體已經出現，但只有抗磷
酸化酪氨酸的抗體效果較好[41。而抗磷酸化絲氨酸 、蘇氨酸的抗體特異性均不強。近來，商品化的
磷 酸化蛋白提純和富集試劑盒，在酵母中已成功應用，但在其它組織的應用還未見報道川。
1.2 磷酸化蛋白膠染色
檢測 蛋 白 混合物中磷酸化蛋白的經典方法是先
行電泳分離蛋白質，然後用放射自顯影術或針對磷
酸化蛋白的免疫印記方法來檢測。近來，Pro-Q Diaround
磷酸化蛋白膠染色是一項重大的技術突
。破b]。這種特殊的熒光染料可以直接在膠內檢測
針對磷酸化絲氨酸、蘇氮酸和酪氨酸的蛋白，而不
需特殊的抗體或同位素標記。這種染色適用於
SDS-聚丙烯酸胺凝膠和二維聚丙烯酞胺凝膠，並旦
這種染色和後續的質譜鑒定是完全兼容的。SYPRO
Ruby染色是針對總蛋白的染色。通過每條泳帶或
每個點的Pro-Q Diamond染色和SYPRO Ruby染色
的比值，可以了解磷酸化蛋白在總蛋白中的比值。
兩種蛋白染色結合使用，可以將高豐度蛋白的低磷
酸化狀態與低豐度蛋白的高磷酸化狀態區分開
2 磷酸化膚段的富集
磷酸 化 位 點的檢測往往不是直接從蛋白水平檢
測，而是從膚段水平檢測。但由於L述提到的抑制
現象的存在，在分析之前應首先對磷酸化膚段進行
富集。
2.1 固定金屬親和色譜
目前 使 用 最廣泛的分離和富集磷酸化肚段的方
法是固定金屬親合色譜(immobilized metal affinity
chromatography, IMAC)。此方法中，鍵合在鰲合
底物上的金屬離子(如Fe3. , Gas. , Cue'等)選
擇性地與磷酸化臉中的磷酸基團結合，在高pH值
或磷酸鹽緩沖液中磷酸化膚可以釋放出來。洗脫下
來的溶液經脫鹽處理後可直接用於質譜分析。
IMAC通常可富集到磷酸化的酪氨酸、絲氮酸和蘇
氨酸殘基。但這種方法的局限性在於:可熊會丟失
掉一些低豐度的沒有結合到IMAC柱上的磷酸化膚
段;具有多磷酸化位點的膚由於其較強的親和力很
難被洗脫下來;某些酸性基團(如天冬氨酸和谷氨
酸)、電子供體文如組氨酸)也會結合到柱上·，造
成非磷酸化膚的污染。所以用IMAC方法富集磷酸
化膚的效果如何，絕大部分依賴於所選擇的金屬離
子、填充柱的材料、及洗脫的程序。最近，Ficarro
等[C1在IMAC富集以前，將膚的酸性殘基進行酷化
處理，使其特異性大大提高，預期對大范圍磷酸化
分析具有廣闊的前景。
2.2 磷酸化肚段的化學修飾
近來 ， O da等[1-1將膚或蛋白混合物置於鹼性硫
代二乙醇溶液中，通過P2消除從磷酸化絲氨酸或
蘇氨酸中去掉磷酸基團H3P0 ,，形成的雙鍵受到硫
代二乙醇的作用，琉基取代磷酸根。生物素與琉基
相連，被標記的膚或蛋白質上樣於固定有親和素的
層析柱，通過生物素與親和素的高親和力作用而達
到磷酸化膚或蛋白質富集的目的。這一方法的主要
缺點在於它不能富集酪氨酸磷酸化的蛋白質和膚。
Zhou等I〕用另外一種方法修飾磷酸化骯，用碳二
亞胺濃縮反應將半朧氨酸加在磷酸鹽部分，修飾過
的膚段以共價鍵與碘乙酞胺樹脂結合，酸洗滌釋
放。此方法既可用於富集磷酸化酪氨酸也可用於富
集磷酸化絲氨酸和磷酸化蘇氨酸，但需要許多步化
學反應和柱純化過程。
㈤ 想檢測磷酸化的蛋白，這個磷酸的位點，怎麼選擇
每個蛋白質磷酸化的位點各異，有的不止有一個磷酸化位點，有的在不同位點磷酸化以後獲得的功能也會不同。樓主要選擇的，大概是檢測時所用的抗體能夠識別哪個磷酸化位點的epitope。如果有相關文獻表示某個磷酸化位點同樓主所感興趣的該蛋白功能相關的話，可以據此選擇。如果這些信息仍然未知，樓主只好使用較為常見的抗體。
㈥ 蛋白質的檢測方法及原理
1
磷酸化檢測可以用二級質譜啊，在正離子模式下，經過collision
cell後中性丟失了98dalton（ser和thr）或216dalton（tyr）的肽段就可能是含一個磷酸化位點的磷酸化肽段。
2
基本原理就是設計個t將目的蛋白留在柱子上或沉澱下來。
㈦ 如何用western來檢測基因的磷酸化水平
那個不是去磷酸化的，是總的蛋白，包括磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白。因為普遍意義上認為，蛋白的磷酸化激活是體內磷酸化蛋白佔有總的該蛋白的百分比上升，所以在做WB時，通常除了做一個磷酸化蛋白的含量表達變化外，還做一個總的蛋白，用以說明，這個磷酸化蛋白的改變並不是因為總的該蛋白表達的變化而引起的，而是因為激酶對它活化，磷酸化蛋白百分比增加而引起的
㈧ 如何檢測蛋白是否發生磷酸化
做對比檢測實驗
例如
AKT蛋白磷酸化後P-AKT
做western blot檢測，看看AKT和p-AKT表達量又沒有相關性。
或者做elisa實驗，毛細管電泳或者HPLC也可檢測相關性。