酶聯生物t3檢測試劑盒使用方法

A. 鹼性磷酸酶檢測試劑盒怎麼用，注意事項

鹼性磷酸酶檢測試劑盒(PNP比色法)使用方法（僅供參考）：

1、 配製檢測工作液：

①配製顯色工作液：取出1支pNPP，恢復至室溫後溶解於2mlALPAssaybuffer，混勻，冰上預冷備用。新配製的顯色工作液應在6h內用完。

② 配製標准品工作液。

2、 准備樣品：

① 細胞或組織樣品：取恰當細胞或組織裂解液，如果有必要需進行適當勻漿，低速離心取上清，-80℃凍存，用於鹼性磷酸酯酶的檢測。

②血漿、血清和尿液樣品：血漿、血清按照常規方法制備後可以直接用於本試劑盒的測定，尿液通常也可以直接用於測定，-80℃凍存，但為了消除樣品本身顏色的干擾，需設置加了血漿或血清但不加底物的對照。

③ 高活性樣品：如果樣品中含有較高活性的鹼性磷酸酶，可以使用原有的裂解液或PBS等進行稀釋，也可以採用ALPAssaybuffer稀釋。

3、 加樣：

按照下表設置96孔板空白對照、標准品、待測樣品，溶液應按照順序依次加入，並注意避免產生氣泡。標准品的用量分別為5、10、20、25、40、50μl，待測樣品直接加50μl。如果樣品中的鹼性磷酸酯酶活性過高，可以減少樣品用量或適當稀釋後再進行測定。樣品的檢測最好能設置平行孔。

4、 輕輕混勻孵育。

5、每孔加入StoppingSolution終止反應。

6、檢測405nm處吸光值，如果無法檢測405nm，亦可檢測400～415nm范圍內吸光值，一般應數小時內檢測完畢。

注意事項：

1、 待測樣品中不能含有磷酸酶抑制劑，同時需避免反復凍融。

2、 建議每次測定時都做標准曲線，以使標准更准確，另外標准品需避免反復凍融。

3、 如果沒有酶標儀，也可以使用普通的分光光度計測定，但應考慮根據比色杯的最小檢測體積，盡量採用小體積的比色杯。

4、 所測樣本的值高於標准曲線的上限，應用ALPAssaybuffer稀釋樣品後重新測定。

5、 一支顯色工作液配製後需當日使用完畢，因此請注意適當多准備一些樣品一起檢測。

6、為了您的安全和健康，請穿實驗服並戴一次性手套操作。

B. 求酶聯免疫吸附法(ELISA)核小體測定，具體流程，要具體

操作步驟
1. 標准品的稀釋：本試劑盒提供原倍標准品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。
160U/L 5號標准品 150μl的原倍標准品加入150μl標准品稀釋液
80 U/L 4號標准品 150μl的5號標准品加入150μl標准品稀釋液
40 U/L 3號標准品 150μl的4號標准品加入150μl標准品稀釋液
20 U/L 2號標准品 150μl的3號標准品加入150μl標准品稀釋液
10 U/L 1號標准品 150μl的2號標准品加入150μl標准品稀釋液

2. 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其餘各步操作相同）、標准孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標准品准確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然後再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加於酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
3. 溫育：用封板膜封板後置37℃溫育30分鍾。
4. 配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋後備用
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒後棄去，如此重復5次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。
7. 溫育：操作同3。
8. 洗滌：操作同5。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震盪混勻，37℃避光顯色15分鍾.
10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。
11. 測定：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液後15分鍾以內進行。
操作程序總結：

計算
以標准物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標准曲線，根據樣品的OD值由標准曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標准物的濃度與OD值計算出標准曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。
注意事項
1．試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30分鍾後方可使用，酶標包被板開封後如未用完，板條應裝入密封袋中保存。
2．濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。
3．各步加樣均應使用加樣器，並經常校對其准確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間最好控制在5分鍾內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。
4． 請每次測定的同時做標准曲線，最好做復孔。如標本中待測物質含量過高（樣本OD值大於標准品孔第一孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數（n倍）後再測定，計算時請最後乘以總稀釋倍數（×n×5）。
5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．底物請避光保存。
7．嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為准.
8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
9．本試劑不同批號組分不得混用。
10. 如與英文說明書有異，以英文說明書為准。
保存條件及有效期
1．試劑盒保存：；2-8℃。

C. 什麼是酶聯免疫試劑盒

酶聯免疫試劑盒
ELISA（酶聯免疫吸附試驗，酶聯免疫試劑盒）
(以下簡稱ELISA（酶聯免疫吸附試驗，酶聯免疫試劑盒）)
：是酶免疫測定技術中應用最廣的技術。其基本方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體
(
聚苯乙烯微量反應板
)
表面，使酶標記的抗原抗體反應在固相表面進行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除。常用的
ELISA(酶聯免疫吸附試驗）法有雙抗體夾心法和間接法，前者用於檢測大分子抗原，後者用於測定特異抗體。
酶聯免疫試劑盒工作原理
促卵泡素（FSH）是動物腦垂體分泌作用於卵巢卵泡生長、發育、分化、成熟和排卵的重要繁殖激素.由於是生物大分子,不能透過細胞膜,FSH必須與靶細胞
膜上的促卵泡素受體（FSHR）結合,經過受體介導將信息傳遞到靶細胞內,才能發揮其生物學功能.所提供的ELISA
Kit是典型的夾心法酶聯免疫吸附測定試劑盒（ELISA）。預先包被的抗體為多克隆抗體。檢測相抗體也為多克隆抗體，經生物素（biotin）標記。樣
品和生物素標記抗體先後加入酶標板孔反應後，PBS或TBS洗滌。隨後加入過氧化物酶標記的親和素反應；經過PBS或TBS的徹底洗滌後用底物TMB顯
色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，並在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的待測因子呈正相關。
酶聯免疫試劑盒工作環境
1．
37℃恆溫箱。
2．
標准規格酶標儀。
3．
自動洗板機。
4．
單通道或多通道可調節移液器以及其吸頭。
5．
蒸餾水，容量瓶等
6．
干凈的試管和Eppendof管
酶聯免疫試劑盒操作步驟
1．
確定本次檢測所需的已包被抗體的酶標板孔數目。
2．
將倍比稀釋的標准品各0.1ml依次加入一排7孔中，1孔只加樣品稀釋液的作為對照。處理後的標本按100ul每孔加入。
3．
酶標板加上蓋，37℃反應90分鍾。
4．
反應後用自動洗板機吸去酶標板內的液體；或甩去酶標板內液體，再對著吸水紙拍幾下。洗滌2次。
5．
將准備好的生物素抗體工作液按每孔0.1ml依次加入。37℃反應60分鍾。
6．
0.01M
TBS或0.01M
PBS洗滌3次，每次浸泡1分鍾左右。
7．
將准備好的ABC工作液按每孔0.1ml依次加入。37℃反應30分鍾。
8．
0.01M
TBS或0.01M
PBS洗滌5次，每次浸泡1-2分鍾左右。
9．
按每孔0.1ml依次加入TMB顯色工作液，37℃避光反應，反應過程中，要經常的觀察，當肉眼可見標准品的前3-4孔有
明顯的梯度藍色，後3-4孔差別不明顯時，即可加入TMB終止液0.1ml/孔。（顯色反應最長不要超過30分鍾）。
10．
用酶標儀在450nm測定O.D.值。
11．
根據樣品的吸光值在坐標上找出對應的濃度。用戶也可以使用各種應用軟體來計算。應記住由於樣品稀釋了N倍，其實際濃度應該×N。

D. 怎麼樣正確的進行ELISA試劑盒的檢測

最全的ELISA試劑盒說明書在這里（通用版）

規格：96T 48T
用途：科研實驗（僅供實驗室研究使用）
保存：2-8℃。
有效期：6個月

結合物的制備
1. 戊二醛交聯法
戊二醛是一種雙功能團試劑，它可以使酶與蛋白質的氨基通過它而聯結。鹼性磷酸一般用此法進行標記。交聯方法一步法、兩步法兩種。在一步法中戊二醛直接加入酶與抗體的混合物中，反應後即得酶標記抗體。
ELISA中常用的酶一般都用此法交聯。它具有操作簡便、有效和重復性好等優點。缺點是交聯反應是隨機的，酶與抗體交聯時分子間的比例不嚴格，結合物的大小也不均一，酶與酶，抗體與抗體之間也有可能交聯，影響效果。在兩步法中，先將酶與戊二醛作用，透析除去多餘的戊二醛後，再與抗體作用而形成酶標抗體。也可先將抗體與戊二醛作用，再與酶聯結。兩步法的產物中絕大部分的酶與蛋白質是以1:1的比例結合的，較一步法的酶結合物更有助於本底的改善以提高敏感度，但其偶聯的有效率較一步法低。
2. 過碘酸鹽氧化法：本法只適用於含糖量較高的酶。辣根過氧化物酶的標記常用此法。反應時，過碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質上的氨基形成Schiff氏鹼而結合。酶標記物按克分子比例聯結，其最佳比例為：酶/抗體=1-2/1。此法簡便有效，一般認為是HRP最可取的標記方法，但也有人認為所有試劑較為強烈，各批實驗結果不易重演。
按以上方法制備的酶結合物一般都混有未結合物的酶和抗體。理論上，結合物中混有的游離酶一般不影響ELISA中最後的酶活性測定，因經過徹底洗滌，游離酶可被除去，並不影響最終的顯色。但游離的抗體則不同，它會與酶標抗體競爭相應的固相抗原，從而減少了結合到固相上的酶標抗體的量。因此制備的酶結合物應予純化，去除游離的酶和抗體後用於檢測，效果更好。純化的方法很多，分離大分子化合物的方法均可應用。硫酸銨鹽析法最為簡便，但效果並不理想，因為此法只能去除留在上清中的游離酶，但相當數量的游離抗體仍與酶結合物一起沉澱而不能分開。用離子交換層析或分子篩分離更為可取，高效液相層析法可將制備的結合物清晰地分成三個部分：游離酶、游離抗體和純結合物而取得最佳的分離效果，但費用較貴。
結合物製得後，在用作ELISA試劑前尚需確定其適當的工作濃度。使用過濃的結合物，既不經濟，又可使本底增高；結合物的濃度過低，則又影響檢測的敏感性。所以必須對結合物的濃度予以選擇。最適的工作濃度就是指結合物稀釋至這一濃度時，能維護一個低的本底，並獲得測定的最佳靈敏度，達到最合適的測定條件和測定費用的節省。就酶標抗體本身而言，它的有效工作濃度是指與其相應抗原包被的載體作試驗時，能得到陽性反應的最高稀釋度。例如某一HRP：抗人IgG制劑標明的工作濃度為1:5000，表示該制劑經1:5000稀釋後，在與人IgG包被的固相作ELISA試驗時，將發生陽性反應。但在用於具體的ELISA檢測中，酶標抗體的最適工作濃度受到固相載體的性質、包被抗原或抗體的純度以及整個檢測系統如標本、反應溫度和時間等的影響，因此必須在實際測定條件下進行"滴配"選擇能達到高敏感度的最大稀釋度作為試劑盒中的工作濃度。
結合物的保存
酶標抗體中的酶和抗體均為生物活性物質，保存不當，極易失活。高濃度的結合物較為穩定，冰凍乾燥後可在普通冰箱中保存一年左右，但凍干過程中引起活力的減低，而且使用時需經復溶，頗為不便。結合物溶液中加入等體積的甘油可在低溫冰箱或普通冰箱的冰格中較長時間保存。早期的ELISA試劑盒中的結合物一般均按以上兩種形式供應，配以稀釋液（見3.2.5）臨用時按標明的稀釋度稀釋成工作液。現在較先進的ELISA試劑盒均已用合適的緩沖液配成工作液，使用時不需再行稀釋，在4-8℃保存期可達6個月。由於蛋白質濃度較低，結合物易失活，需加入蛋白保護劑。另外再加入抗生素（例如慶大黴素）和防腐劑（HRP結合物加硫柳泵，AP結合物可加疊氮鈉），以防止細菌生長。
結合物的稀釋液
用於稀釋高濃度的結合物以配成工作液。為避免結合物在反應中直接吸附在固相載體上，在稀釋緩沖液中常加入高濃度的無關蛋白質（例如1%牛血清白蛋白），通過競爭以抑制結合物的吸附。一般還加入具有抑制蛋白質吸附於塑料表面的非離子型表面活性劑，如吐溫20，0.05%的濃度較為適宜。在間接測定抗體時，血清標本需稀釋後進行測定，也可應用這種稀釋液。
試劑盒組成

標本要求
1. 標本採集後盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取後應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放於-20℃保存，但應避免反復凍融
2. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
操作步驟
1. 標准品的稀釋：本試劑盒提供原倍標准品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。

2. 加樣
分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其餘各步操作相同）、標准孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標准品准確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然後再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加於酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
3. 溫育：用封板膜封板後置37℃溫育30分鍾。
4. 配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋後備用
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒後棄去，如此重復5次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。
7. 溫育：操作同3。
8. 洗滌：操作同5。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震盪混勻，37℃避光顯色15分鍾.
10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。
11. 測定：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液後15分鍾以內進行。
操作程序總結：

計算
以標准物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標准曲線，根據樣品的OD值由標准曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標准物的濃度與OD值計算出標准曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。

注意事項
1. 試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30分鍾後方可使用，酶標包被板開封後如未用完，板條應裝入密封袋中保存。
2. 濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。
3. 各步加樣均應使用加樣器，並經常校對其准確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間最好控制在5分鍾內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。
4. 請每次測定的同時做標准曲線，最好做復孔。如標本中待測物質含量過高（樣本OD值大於標准品孔第一孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數（n倍）後再測定，計算時請最後乘以總稀釋倍數（×n×5）。
5. 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6. 底物請避光保存。
7. 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為准.
8. 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
9. 本試劑不同批號組分不得混用。
洗滌液
在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸緩沖鹽水。
酶反應終止液
常用的HRP反應終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式ELISA中一般採用2mol/L。
陽性對照品和陰性對照品
陽性對照品和陰性對照品是檢驗試驗有效性的控製品，同時也作為判斷結果的對照，因此對照品，特別是陽性對照品的基本組成應盡量與檢測標本的組成相一致。以人血清為標本的測定，對照品最好也為人血清，因為正常人血清在各種ELISA模式中可產生不同程度的本底。由於大量正常人血甭較難得到，國外試劑盒中的對照品多以復鈣人血漿為原料，即在血漿中加入鈣離子，使其中的纖維蛋白質凝固，除去凝塊後所得的液體，其組成與血清相似。陰性對照品須先行檢測，確定其中不含待測物質。例如HBsAg檢測的陰性對照品中不可含HBsAg，最好抗HBs也是陰性。陽性對照品多以含蛋白保護劑的緩沖液為基質，其中加入一定量的待檢物質，此量最好在試劑說明書中標明。加入的量應與試劑的敏感度相稱，在測定中得到的吸光值與受檢標本吸光值比較，可對標本中受檢物質的量有一個粗略的估計。國外檢測HBsAg的ELISA試劑盒檢測敏感度約為0.5ng/ml，陽性對照品中含量約為10ng/ml。在對照品中一般加入抗生素和防腐劑，以利保存。
包被用抗體
包被固相載體的抗體應具有高親和力和高特異性，可取材於抗血清或含單克隆抗體的腹水或培養液。如免疫用抗原中含有雜質（即便是極微量的），在抗血清中將出現雜抗體，必須除去（可用吸收法）後才能用於ELISA，以保證試驗的特異性。抗血清不能直接用於包被，應先提取IgG，通常採用硫酸銨鹽析和Sephadex凝膠過濾法。一般經硫酸銨鹽析粗提的IgG已可用於包被，高度純化的IgG性質不穩定。如需用高親和力的抗體包被以提高試驗的敏感性，則可採用親和層析法以除去抗血清中含量較多的非特異性IgG。腹水中單抗的濃度較高，特異性亦較強，因此不需要作吸收和親和層析處理，一般可將腹水作適當稀釋後直接包被，必要時也可用純化的IgG。應用單抗包被時應注意，一種單抗僅針對一種抗原決定簇，在某些情況下，用多種單抗混合包被，可取得更好的效果。
包被的條件
包被用抗原或抗體的濃度，包被的溫度和時間，包被液的pH等應根據試驗的特點和材料的性質而選定。抗體和蛋白質抗原一般採用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液，也有用pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL緩沖液作為稀釋液的。通常在ELISA板孔中加入包被液後，在4-8℃冰箱中放置過夜，37℃中保溫2小時被認為具有同等的包被效果。包被的最適當濃度隨載體和包被物的性質可有很大的變化，每批材料需通過實驗與酶結合物的濃度協調選定。一般蛋白質的包被濃度為100ng/ml-20ug/ml。
包被的方式
將抗原或抗體固定在過程稱為包被。換言之，包被即是抗原或抗體結合到固相載體表面的過程。蛋白質與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結合的，靠的是蛋白質分子結構上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的作用於。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質的分子量、等電點、濃度等的影響。載體對不同蛋白質的吸附能力是不相同的，大分子蛋白質較小分子蛋白質通常含有更多的疏水基團，故更易吸附到固相載體表面。 IgG對聚苯乙烯等固相具有較強的吸附力，其聯結多發生在Fc段上，抗體結合點暴露於外，因此抗體的包被一般均採用直接吸附法。蛋白質抗原大多也可採用與抗體相似的方法包被。當抗原決定簇存在於或鄰近於疏水區域時，抗原與固相載體的直接吸附可使抗原決定簇不能充分暴露，在這種情況下，直接包被效果不佳，可以採用間接的捕獲包被法，即先將針對該抗原的特異抗體作預包被，其後通過抗原抗體反應使抗原固相化。此間接結合在固相上的抗原遠離載體表面，其抗原決定簇也得以充分暴露。間接包被的抗原經固相抗體的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質較多的抗原也可採用捕獲包被法，試驗的特異性、敏感性均由此得以改善，重復性亦佳。間接包被的另一優點是抗原用量少，僅為直接包被的1/10乃至於/100。不易吸附在聚苯乙烯載體上的非蛋白質抗原可採用特殊的包被方式。例如，在檢測抗DNA抗體時，需用DNA作為包被抗原，而普遍的固相載體一般不能直接與核酸結合。可將聚苯乙烯板先經紫外線照射，以增加其吸附性能。固相載體先用鹼性蛋白質，如聚賴氨酸、魚精蛋白等作預包被，也可提高核酸的結合力。也可用親和素生物素系統作間接包被，即用親和素先包被載體，然後加入生物素化的DNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴大應用於各種抗原物質的定量測定。
脂類物質無法與固相載體結合，可將其在有機溶劑中溶解後加入ELISA板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風吹乾，待酒精揮發後，讓脂質自然干固在固相表面。抗心磷脂抗體的ELISA試劑一般採用這種包被方式。
洗板方法：
1. 手工洗板方法：吸去或甩掉酶標板內的液體；在實驗台上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內，浸泡1-2分鍾，根據需要，重復此過程數次。
2. 自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用後再用到正式實驗過程中。待檢樣本：體液、血清、血漿、細胞培養上清液、尿液、組織勻漿、心房水標本等

E. 酶聯免疫法的檢測方法

雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，操作步驟如下：
一、將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結合的抗體及雜質。
二、加受檢標本：使之與固相抗體接觸反應一段時間，讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結合，形成固相抗原復合物。洗滌除去其他未結合的物質。
三、加酶標抗體：使固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質的量正相關。
四、加底物：夾心式復合物中的酶催化底物成為有色產物。根據顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量。
根據同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標抗原結合物，即可用雙抗原夾心法測定標本中的抗體。
在臨床檢驗中，此法適用於檢驗各種蛋白質等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用於包被固相載體和制備酶結合物而建立此法。如抗體的來源為抗血清，包被和酶標用的抗體最好分別取自不同種屬的動物。如應用單克隆抗體，一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗，分別用於包被固相載體和制備酶結合物。這種雙位點夾心法具有很高的特異性，而且可以將受檢標本和酶標抗體一起保溫反應，作一步法檢測。
在一步法測定中，當標本中受檢抗原的含量很高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成夾心復合物。類同於沉澱反應中抗原過剩的後帶現象，此時反應後顯色的吸光值（位於抗原過剩帶上）與標准曲線（位於抗體過剩帶上）某一抗原濃度的吸光值相同，如按常法測讀，所得結果將低於實際的含量，這種現象被稱為鉤狀效應（hook effect），因為標准曲線到達高峰後呈鉤狀彎落。鉤狀效應嚴重時，反應甚至可不顯色而出現假陰性結果。因此在使用一步法試劑測定標本中含量可異常增高的物質（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）時，應注意可測范圍的最高值。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應。
假使在被測分子的不同位點上含有多個相同的決定簇，例如HBsAg的a決定簇，也可用針對此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結合物。但在HBsAg的檢測中應注意亞型問題，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4個亞型，顯然每種亞型均有相同的a決定簇的反應性，這也是用單抗作夾心法應注意的問題。
雙抗體夾心法測抗原的另一注意點是類風濕因子（RF）的干擾。RF是一種自身抗體，多為IgM型，能和多種動物IgG的Fc段結合。用作雙抗體夾心法檢測的血清標本中如含有RF，它可充當抗原成份，同時與固相抗體和酶標抗體結合，表現出假陽性反應。採用F（ab'）或Fab片段作酶結合物的試劑，由於去除了Fc段，從而可消除RF的干擾。雙抗體夾心法ELISA試劑是否受RF的影響，已被列為這類試劑的一項考核指標（參見6.2）。
雙抗體夾心法適用於測定二價或二價以上的大分子抗原，但不適用於測定半抗原及小分子單價抗原，因其不能形成兩位點夾心。
雙抗原夾心法測抗體
反應模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進行包被和制備酶結合物，以檢測相應的抗體。與間接法測抗體的不同之處為以酶標抗原代替酶標抗抗體。此法中受檢標本不需稀釋，可直接用於測定，因此其敏感度相對高於間接法。乙肝標志物中抗HBs的檢測常採用本法。本法關鍵在於酶標抗原的制備，應根據抗原結構的不同，尋找合適的標記方法。 在雙抗體夾心法測定抗原時，如應用針對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標抗體，則在測定時可使標本的加入和酶標抗體的加入兩步並作一步。這種雙位點一步不但簡化了操作，縮短了反應時間，如應用高親和力的單克隆抗體，測定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應用使測定抗原的ELISA提高到新水平。
在一步法測定中，應注意鉤狀效應（hookeffect），類同於沉澱反應中抗原過剩的後帶現象。當標本中待測抗原濃度相當高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成夾心復合物，所得結果將低於實際含量。鉤狀效應嚴重時甚至可出現假陰性結果。 間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標記的抗體以檢測已與固相結合的受檢抗體，故稱為間接法。操作步驟如下：
⑴將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原：洗滌除去未結合的抗原及雜質。
⑵加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結合，形成固相抗原抗體復合物。經洗滌後，固相載體上只留下特異性抗體。其他抗體及血清中的雜質由於不能與固相抗原結合，在洗滌過程中被洗去。
⑶加酶標抗抗體：與固相復合物中的抗體結合，從而使該抗體間接地標記上酶。洗滌後，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。例如欲測人對某種疾病的抗體，可用酶標羊抗人IgG抗體。
⑷加底物顯色：顏色深度代表標本中受檢抗體的量。
本法主要用於對病原體抗體的檢測而進行傳染病的診斷。間接法的優點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。
間接法成功的關鍵在於抗原的純度。雖然有時用粗提抗原包被也能取得實際有效的結果，但應盡可能予以純化，以提高試驗的特異性。特別應注意除去能與一般健康人血清發生反應的雜質，例如以E.Coli為工程酶的重組抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能與受過E.Coli感染者血清中的抗E.Coli抗體發生反應。抗原中也不能含有與酶標抗人Ig反應的物質，例如來自人血漿或人體組織的抗原，如不將其中的Ig去除，試驗中也發生假陽性反應。另外如抗原中含有無關蛋白，也會因競爭吸附而影響包被效果。
間接法中另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性抗體。病人血清中受檢的特異性IgG只佔總IgG中的一小部分。IgG的吸附性很強，非特異IgG可直接吸附到固相載體上，有時也可吸附到包被抗原的表面。因此在間接法中，抗原包被後一般用無關蛋白質（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封閉（blocking）固相上的空餘間隙。另外，在檢測過程中標本須先行稀釋（1:40~1:200），以避免過高的陰性本底影響結果的判斷。 競爭法可用於測定抗原，也可用於測定抗體。以測定抗原為例，受檢抗原和酶標抗原競爭與固相抗體結合，因此結合於固相的酶標抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下：
⑴將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體。洗滌。
⑵待測管中加受檢標本和一定量酶標抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應。如受檢標本中無抗原，則酶標抗原能順利地與固相抗體結合。如受檢標本中含有抗原，則與酶標抗原以同樣的機會與固相抗體結合，競爭性地佔去了酶標抗原與固相載體結合的機會，使酶標抗原與固相載體的結合量減少。參考管中只加酶標抗原，保溫後，酶標抗原與固相抗體的結合可達最充分的量。洗滌。
⑶加底物顯色：參考管中由於結合的酶標抗原最多，故顏色最深。參考管顏色深度與待測管顏色深度之差，代表受檢標本抗原的量。待測管顏色越淡，表示標本中抗原含量越多。一般情況，是通過方波伏安法，檢測培養體系的峰電流，通過峰電流與抗原抗體的線性關系來最終確定體系的最終檢測目標的濃度。
當抗原材料中的干擾物質不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。其原理為標本中的抗體和一定量的酶標抗體競爭與固相抗原結合。標本中抗體量越多，結合在固相上的酶標抗體愈少，因此陽性反應呈色淺於陰性反應。如抗原為高純度的，可直接包被固相。如抗原中會有干擾物質，直接包被不易成功，可採用捕獲包被法，即先包被與固相抗原相應的抗體，然後加入抗原，形成固相抗原。洗滌除去抗原中的雜質，然後再加標本和酶標抗體進行競爭結合反應。競爭法測抗體有多種模式，可將標本和酶標抗體與固相抗原競爭結合，抗HBc ELISA一般採用此法。另一種模式為將標本與抗原一起加入到固相抗體中進行競爭結合，洗滌後再加入酶標抗體，與結合在固相上的抗原反應。抗HBe的檢測一般採用此法。 血清中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時存在，後者會干擾IgM抗體的測定。因此測定IgM抗體多用捕獲法，先將所有血清IgM（包括異性IgM和非特異性IgM）固定在固相上，在去除IgG後再測定特異性IgM。操作步驟如下：
⑴將抗人IgM抗體連接在固相載體上，形成固相抗人IgM。洗滌。
⑵加入稀釋的血清標本：保溫反應後血清中的IgM抗體被固相抗體捕獲。洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質成分。
⑶加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性IgM結合。洗滌。
⑷加入針對特異性的酶標抗體：使之與結合在固相上的抗原反應結合。洗滌。
⑸加底物顯色：如有顏色顯示，則表示血清標本中的特異性IgM抗體存在，是為陽性反應。 親和素是一種糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每個分子由4個亞基組成，可以和4個生物素分子親密結合。維生素H，分子量244.31，存在於蛋黃中。用化學方法製成的衍生物，生物素－羥基琥珀亞胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可與蛋白質、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產物。親和素與生物素的結合，雖不屬免疫反應，但特異性強，親和力大，兩者一經結合就極為穩定。由於1個親和素分子有4個生物素分子的結合位置，可以連接更多的生物素化的分子，形成一種類似晶格的復合體。因此把親和素和生物素與ELISA偶聯起來，就可大提高ELISA的敏感度。
親和素－生物素系統在ELISA中的應用有多種形式，可用於間接包被，亦可用於終反應放大。可以在固相上先預包被親和素，原用吸附法包被固相的抗體或抗原與生物素結合，通過親和素－生物素反應而使生物素化的抗體或抗在相化。這種包被法不僅可增加吸附的抗體或抗原量，而且使其結合點充分暴露。另外，在常規ELISA中的酶標抗體也可用生物素化的抗體替代，然後連接親和素－酶結合物，以放大反應信號。 在臨床檢驗中一般採用商品試劑盒進行測定。ELISA中有三個必要的試劑：免疫吸附劑、結合物和酶的底物等。完整的ELISA試劑盒包含以下各組分：
⑴已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；⑵酶標記的抗原或抗體（結合物）；
⑶酶的底物；
⑷陰性對照品和陽性對照品（定性測定中），參考標准品和控制血清（定量測定中）；
⑸酶聯物（結合物）及標本的稀釋液；
⑹洗滌液；
⑺酶反應終止液。

F. 酶聯免疫吸附測定的方法類型和操作步驟

ELISA可用於測定抗原，也可用於測定抗體。該法適於測定細胞培養上清、血清、血漿及組織液中的樣本，干擾小可以測到每毫升納克水平的細胞因子（或受體）的水平。在這種測定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體，②酶標記的抗原或抗體，③酶作用的底物。根據試劑的來源和標本的性狀以及檢測的具備條件，可設計出各種不同類型的檢測方法。 雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，操作步驟如下：
（1）將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結合的抗體及雜質。
（2）用脫脂奶粉或BSA進行封閉。洗滌除去多餘的脫脂奶粉或BSA。
（3）加受檢標本：使之與固相抗體接觸反應一段時間，讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結合，形成固相抗原復合物。洗滌除去其他未結合的物質。
（4）加酶標抗體：使固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質的量正相關。
（5）加底物：夾心式復合物中的酶催化底物成為有色產物。根據顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量。
根據同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標抗原結合物，即可用雙抗原夾心法測定標本中的抗體。 在雙抗體夾心法測定抗原時，如應用針對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標抗體，則在測定時可使標本的加入和酶標抗體的加入兩步並作一步（圖15-5）。這種雙位點一步不但簡化了操作，縮短了反應時間，如應用高親和力的單克隆抗體，測定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應用使測定抗原的ELISA提高到新水平。
在一步法測定中，應注意鉤狀效應（hookeffect），類同於沉澱反應中抗原過剩的後帶現象。當標本中待測抗原濃度相當高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成夾心復合物，所得結果將低於實際含量。鉤狀效應嚴重時甚至可出現假陰性結果。 間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標記的抗抗體以檢測已與固相結合的受檢抗體，故稱為間接法。操作步驟如下：
（1）將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原：洗滌除去未結合的抗原及雜質。
（2）加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結合，形成固相抗原抗體復合物。經洗滌後，固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及血清中的雜質由於不能與固相抗原結合，在洗滌過程中被洗去。
（3）加酶標抗抗體：與固相復合物中的抗體結合，從而使該抗體間接地標記上酶。洗滌後，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。例如欲測人對某種疾病的抗體，可用酶標羊抗人IgG抗體。
（4）加底物顯色：顏色深度代表標本中受檢抗體的量。
本法只要更換不同的固相抗原，可以用一種酶標抗抗體檢測各種與抗原相應的抗體。 競爭法可用於測定抗原，也可用於測定抗體。以測定抗原為例，受檢抗原和酶標抗原競爭與固相抗體結合，因此結合於固相的酶標抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下：
（1）將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體。洗滌。
（2）待測管中加受檢標本和一定量酶標抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應。如受檢標本中無抗原，則酶標抗原能順利地與固相抗體結合。如受檢標本中含有抗原，則與酶標抗原以同樣的機會與固相抗體結合，競爭性地佔去了酶標抗原與固相載體結合的機會，使酶標抗原與固相載體的結合量減少。參考管中只加酶標抗原，保溫後，酶標抗原與固相抗體的結合可達最充分的量。洗滌。 （3）加底物顯色：參考管中由於結合的酶標抗原最多，故顏色最深。參考管顏色深度與待測管顏色深度之差，代表受檢標本抗原的量。待測管顏色越淡，表示標本中抗原含量越多。 血清中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時存在，後者會干擾IgM抗體的測定。因此測定IgM抗本多用捕獲法，先將所有血清IgM（包括異性IgM和非特異性IgM）固定在固相上，在去除IgG後再測定特異性IgM。操作步驟如下：
（1）將抗人IgM抗體連接在固相載體上，形成固相抗人IgM。洗滌。
（2）加入稀釋的血清標本：保溫反應後血清中的IgM抗體被固相抗體捕獲。洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質成分。
（3）加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性IgM結合。洗滌。
（4）加入針對特異性的酶標抗體：使之與結合在固相上的抗原反應結合。洗滌。
（5）加底物顯色：如有顏色顯示，則表示血清標本中的特異性IgM抗體存在，是為陽性反應。 親和素是一種糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每個分子由4個亞基組成，可以和4個生物素分子親密結合。現在使用更多的是從鏈黴菌中提取的鏈霉和素（strepavidin）。生物素（biotin）又稱維生素H，分子量244.31，存在於蛋黃中。用化學方法製成的衍生物，生物素－羥基琥珀亞胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可與蛋白質、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產物。親和素與生物素的結合，雖不屬免疫反應，但特異性強，親和力大，兩者一經結合就極為穩定。由於1個親和素分子有4個生物素分子的結合位置，可以連接更多的生物素化的分子，形成一種類似晶格的復合體。因此把親和素和生物素與ELISA偶聯起來，就可大提高ELISA的敏感度。
親和素－生物素系統在ELISA中的應用有多種形式，可用於間接包被，亦可用於終反應放大。可以在固相上先預包被親和素，原用吸附法包被固相的抗體或抗原與生物素結合，通過親和素－生物素反應而使生物素化的抗體或抗在相化。這種包被法不僅可增加吸附的抗體或抗原量，而且使其結合點充分暴露。另外，在常規ELISA中的酶標抗體也可用生物素化的抗體替代，然後連接親和素－酶結合物，以放大反應信號。
ELISA 普遍用作非放射性同位素的成鍵化驗. 在這種方法中, 通常標准配體是固定的, 通過加入溶液相受體或蛋白質來使之成鍵. 通過加入與受體特異性反應的抗體來定量成鍵的受體, 而且最初抗體的量以加入第二種能顯色的抗體測量. 第二種抗體能識別抗體的末端, 在其末端的鹼性磷酸酯或過氧化物酶等與酶發生反應, 從而使溶液顯色.

G. 什麼是酶聯免疫法酶聯免疫試劑盒如何使用

酶聯免疫試劑的基本原理 酶聯免疫試劑 http://www.cusabio.cn/ 測定法，簡稱酶聯免疫法，或者ELISA法。 它的中心就是讓抗體與酶復合物結合，然後通過顯色來檢測。 ①使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，並保持其免疫活性。 ②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開，最後結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底物後，底物被酶催化變為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據顏色反應的深淺來進行定性或定量分析。由於酶的催化頻率很高，故可極大地放大反應效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。 ELISA可用於測定抗原，也可用於測定抗體。在這種測定方法中有3種必要的試劑： ①固相的抗原或抗體 ②酶標記的抗原或抗體 ③酶作用的底物。根據試劑的來源和標本的性狀以及檢測的具備條件，可設計出各種不同類型的檢測方法。

H. 酶聯免疫吸附測定實驗（ELISA）的操作流程，謝謝大家

Elisa 操作流程（以人IL-4 ELISA KIT為例）：
檢測原理:
本實驗採用雙抗體夾心ELISA法。抗人IL-4單抗包被於酶標板上，標本和標准品中的IL-4會 與單抗結合，游離的成分被洗去。加入生物素化的抗人IL-4抗體和辣根過氧化物酶標記的親 和素。生物素與親和素特異性結合；抗人IL-4抗體與結合在單抗上的人IL-4結合而形成免疫 復合物，游離的成分被洗去。加入顯色底物，若反應孔中有IL-4，辣根過氧化物酶會使無色 的顯色劑現藍色，加終止液變黃。在450nm處測OD值，IL-4濃度與OD450值之間呈正比，可 通過繪制標准曲線求出標本中IL-4的濃度。
試劑盒組成：
1．抗體預包被酶標板（8×12 或 8×6）
2．凍干標准品（2 / 1 支；0.5ng/支）
3．標准品和標本稀釋液（橙蓋瓶）（1 瓶；20ml/12ml）
4．濃縮生物素化抗體（紫蓋瓶）（1 支）
5．生物素化抗體稀釋液（藍蓋瓶）（1 瓶；16ml/10ml）
6．濃縮酶結合物（棕蓋瓶）（1 支）
7．酶結合物稀釋液（紫蓋瓶）（1 瓶；16ml/10ml）
8．濃縮洗滌液 20× （白蓋瓶）（1 瓶；50ml/25ml）
9．顯色底物（TMB）（棕蓋瓶）（1 瓶；12ml/6ml）
10．反應終止液（紅蓋瓶）（1 瓶；12ml/6ml）
11．封板膠紙（6/3 張）
12．產品說明書（1 份）
標本收集:
1. 收集血液的試管應為一次性的無熱原，無內毒素試管。
2. 血漿抗凝劑推薦使用EDTA。避免使用溶血，高血脂標本。
3. 標本應清澈透明，懸浮物應離心去除。
4. 標本收集後若不及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存於-20℃，-70℃電冰箱內，避免反復凍融，3-6月內檢測。
5. 如果您的樣本中檢測物濃度高於標准品最高值，請根據實際情況，做適當倍數稀釋(建 議做預實驗，以確定稀釋倍數)。
注意事項:
1. 試劑盒使用前請保存在2-8℃。復溶後的標准品應分裝後，將其放在-20～-70℃貯存。
2. 濃縮生物素化抗體，濃縮酶結合物體積小，運輸中顛簸和可能的倒置，會使液體沾到管壁 或瓶蓋。因此使用前請用手甩幾下或1000轉/分離心1分鍾，以使附著管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。取用前，請用移液器小心吹打4-5次使溶液混勻。
3. 從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結晶,屬於正常現象，微加熱至40℃使結晶完全溶解後 再配製洗滌液。（加熱溫度不要超過50℃）使用時洗滌液應為室溫。
4. 若需要分次使用標准品應按照每一次用量分裝，將其放在-20～-70℃貯存。避免反復凍 融。
5. 不同批號的試劑盒組份不能混用（洗滌液和反應終止液除外）。
6. 充分輕微混勻對反應結果尤為重要，最好使用微量振盪器(使用最低頻率)，如無微量振盪器，可在反應前手工輕輕敲擊酶標板框混勻。
7. 在試驗中標准品和樣本檢測時建議作雙孔檢測。
8. 試驗中所用的試管和吸頭均為一次性使用，嚴禁在不同的液體之間混用！否則將影響試 驗結果。
9. 試驗中請穿著試驗服並帶乳膠手套做好防護工作。特別是檢測血液或者其他體液標本時， 請按國家生物試驗室安全防護條列執行。
檢測前准備工作:
1. 請提前20分鍾從冰箱中取出試劑盒，以平衡至室溫。
2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:20)。未用完的放回4℃。
3. 標准品: 加入標准品/標本稀釋液0.5ml至凍干標准品中，靜置15分鍾，待其充分溶解後，輕輕混勻(濃度為1000 pg/ml)。然後根據需要進行稀釋。(建議標准曲線使用以下濃度： 1000、500、250、125、62.5、31.25、15.6、0 pg/ml)。復溶標准品原液（1000 pg/ml）若未用完請分裝後放入-20℃以下電冰箱內保存，保存兩個月。已稀釋的標准品請廢棄。
4. 生物素化抗體工作液：按當次試驗所需要得用量，使用前20分鍾，以生物素化抗體稀釋液稀釋濃縮生物素化抗體(1:30)成工作濃度。當日使用。若實驗次數過多導致生物素化 抗體量不足，可向我們公司單獨購買生物素化抗體。（須提供抗體批號）
5. 酶結合物工作液：按當次試驗所需要得用量，使用前20分鍾，以酶結合物稀釋液稀釋濃 縮酶結合物(1:30) 成工作濃度。當日使用。若實驗次數過多導致濃縮酶結合物量不足， 可向我們公司單獨購買濃縮酶結合物。（須提供酶結合物批號）
洗滌方法:
1. 自動洗板機：要求注入的洗滌液為350ul，注入與吸出間隔15－30秒。洗板5次。
2. 手工洗板：甩盡孔內液體，在潔凈的吸水紙上拍干，每孔加洗滌液350ul，靜置30秒後甩盡液體，在厚迭吸水紙上拍干。洗板5次。

操作步驟:
1．從已平衡至室溫的密封袋中取出試驗所需板條，未用的板條和乾燥劑請放回鋁箔袋內壓 實自封條，密封口袋，放回4℃。
2．空白孔加標准品和標本稀釋液，其餘相應孔中加標本或不同濃度標准品(100ul/孔)，用封板膠紙封住反應孔，36℃孵箱孵育90分鍾。
3．提前20分鍾准備生物素化抗體工作液。
4．洗板5次。
5．空白孔加生物素化抗體稀釋液，其餘孔加入生物素化抗體工作液(100ul/孔)。用新封板膠紙封住反應孔，36℃孵箱孵育60分鍾。
6．提前20分鍾准備酶結合物工作液。避光室溫(22-25 ) ℃ 放置。
7．洗板5次。
8．空白孔加酶結合物稀釋液，其餘孔加入酶結合物工作液(100ul/孔)。用新封板膠紙封住反應孔，36℃孵箱，避光孵育30分鍾。
9．打開酶標儀電源，預熱儀器，設置好檢測程序。
10．洗板5次。
11．加入顯色底物(TMB)100ul/孔，避光36℃孵箱，避光孵育15分鍾。
12．加入終止液100ul/孔, 混勻後即刻測量OD450值(3分鍾內)。在儀器保存讀數結果並列印一份紙質結果。
13．實驗完畢後將未用完的試劑按規定的保存溫度放回電冰箱保存至有效期結束。
建議保存酶標板框，以備下次或者今後試驗使用。

結果判斷:
1. 每個標准品和標本的OD值應減去空白孔的OD值。
2. 手工繪制標准曲線。以標准品濃度作橫坐標，OD值作縱坐標，以平滑線連接各標准品的坐標點。通過標本的OD值可在標准曲線上查出其濃度。
3. 若標本OD值高於標准曲線上限，應適當稀釋後重測，計算濃度時應乘以稀釋倍數。

靈敏度、特異性和重復性:
● 靈敏度：最小可測人IL-4達7pg/ml。
● 特異性：不與IL－1,2,3,5,6,8,10,12,IFN,TNF及sTNF-RII等反應。
● 重復性：板內，板間變異系數均<10%。

I. 酶聯免疫檢測的幾種方法及其原理

（1）酶聯免疫吸附試驗（enzyme
linked
immunosorbent
assay,ELISA）：是將抗原或抗體吸附在固相載體表面。使抗原抗體反應在固相載體表面進行。可用間接法、雙抗體夾心法或競爭法測定抗原或抗體。
（2）夾心法（sandwich
assay）:將已知的特異抗體包裝在固相載體（塑料板凹孔或紙片上），加入待檢標本，標本中的抗原即可與載體上的抗原結合，洗去未結合的材料後加入該抗原的酶標記抗體，洗去未結合的酶標抗體，加底物顯色，用酶免疫檢測儀測量顏色的光密度，可定量測定抗原。
間接法（indirecr
ELISA）常用於檢查特異抗體。先將已知特異抗原包被固相載體，加入待檢標本（可能含有相應抗體），再加入酶標抗Ig的抗全（即第二抗體），經加底物顯色後，根據顏色的光密度計算出標本中抗體的含量。
（3）BAS-ELISA：近年來對酶免設分析法的改進是使用生物素-親合素-過氧化物酶復合物作為指示劑，組成一新的生物放大系統進一步提高檢測的敏感度。可用來檢測多種抗原抗體系統如細菌、病毒、腫瘤細胞表面抗原等。一個親合素（avidin）分子可以結合4個生物素分子（biotin）。結合非常穩定。親合素和生物素都可與抗全、酶、熒光素等分子結合，而不影響後者的生物活性。一個抗體分子可偶聯90個生物素分子，通過生物素又可連接多個親合素。因此大提高檢測的敏感度。目前應用生物-酶標親合素系統（biotinavidin
system-
ELISA,BAS-ELISA），它是通過生物素標記抗體連接免疫反應系統，同時藉助生物素化酶或酶標親合素引入酶與底物反應系統。

J. 結核感染T細胞檢測試劑盒（免疫斑點法）怎麼用

結核感染T細胞檢測試劑盒（免疫斑點法）怎麼用
免疫細胞功能試驗包括體內和體外試驗.免疫細胞功能體外試驗主要根據免疫細胞的增殖活性、分泌活殺傷活性等特性而進行實驗設計.具體免疫細胞功能檢測內容包括：①淋巴細胞功能檢測,包括T細胞增殖試驗、T細胞分泌功能測定、T細胞介導的細胞毒試驗以及體內試驗；B細胞增殖試驗、溶血空斑試驗、酶聯免疫斑點法以及體內試驗；NK細胞活性檢測方法：酶釋放法、放射性核素釋放法、化學發光法、流式細胞術法等.②吞噬細胞功能檢測,方法有趨化功能檢測、吞噬和殺菌功能測定等.