發光免疫分析技術常用方法

① 標記免疫分析技術的種類，有何區別

免疫標記分析技術主要包括：放射物標記、酶標記、發游標記、熒游標記和金標記方法。
1 放射物標記分析：

用放射物標記抗原或抗體發展的放射免疫分析(radio immunoassay, RIA)是美國科學Yalow

和Berson於1959年創立的一種微量分析法,它是將具有高靈敏度的放射性核素示蹤技術和特異性免疫化學技術相結合而建立的新方法。該技術利用核素標記物的放大效應,改善了待測物的檢測下限,同時以抗體或抗原作為結合試劑,大大提高了檢測方法的特異性。
2 熒游標記分析：

以熒游標記的熒光免疫分析(fluorescein immunoassay, FIA)是由Conn等首創於20世紀40年代的一種標記免疫學技術,其所用標記物是熒光素和熒光染料,是將抗原或抗體標記以熒光物質與相應抗原或抗體結合,在熒光顯微鏡或紫外線照射下,檢測熒光強度和熒光現象的一種檢測方法。熒游標記免疫法靈敏度高,但熒光素常會產生生物學毒性,導致抗體或抗原的靈敏度和選擇性下降
3.酶標記分析技術：
是繼免疫熒光抗體技術和放射免疫分析之後發展起來的一大新型的血清學技術。1966年，Nakane等和Avrameas等分別報道用酶代替熒光素標記抗體，建立了酶標抗體技術(enzyme-labelled antibody technique)，用於生物組織中抗原的定位和鑒定。1971年，Engvall Van Weemen等報道了酶聯免疫吸附試驗，從而建立了酶標抗體的定量檢測技術。20世紀80年代，基於酶標記抗體檢測和鑒定蛋白質分子的免疫轉印技術問世。目前，免疫酶標記技術已成為免疫診斷、檢測和分子生物學研究中應用最廣泛的免疫學方法之一。
4.發游標記分析

20世紀80年代末,國外開始用化學發光試劑來標記抗原或抗體,從而建立了發光免疫分析技術。狹義的發光免疫分析( luminescence immunoassay,LIA )主要是指化學發光免疫分析(chemiluminescence immunoassay, CLIA)。另外,還有酶放大化學發光免疫分析和電化學發光免疫分析( electrochemiluminescence immunoassay , ECLIA)。CLIA是Sohrocler和Halman在20世紀70年代末期建立的,該方法兼有發光分析的高靈敏度和免疫反應的特異性。其基本原理同酶標記分析法,是用化學發光反應的試劑(可以是發光劑或催化劑等)標記抗原或抗體,

標記後的抗原和抗體與待測物經過一系列的免疫反應和理化步驟(如離心分離、洗滌等),最後以測定發光強度形式測定。
5 超順磁微粒標記分析

以磁性粒子標記的磁性免疫分析技術(Magnetic Immuno Chromatofraphic Tes,tMICT)是現代物理學與生物技術結合研發生產的磁性分析檢測技術,最早應用於基礎醫學領域[13,14]。與其它標記技術不同,該技術一個顯著的優點就是用磁性粒子標記不受有色雜質干擾,可用於直接測量血液、食品、污水等有色樣品。其原理是利用超順磁性納米微粒作為標記物,由高靈敏度磁性檢測儀器測定結合在免疫復合物上的磁性微粒所產生的局部磁場效應,從而得出所測分析物的定量結果。

② 化學發光免疫分析技術的類型

化學發光免疫分析法以標記方法的不同而分為兩種:
(1)化學發游標記免疫分析法;
(2)酶標記、以化學發光底物作信號試劑的化學發光酶免疫分析法 從標記免疫分析角度, 化學發光酶免疫分析( chem ilum inescen t enzym e imm unoassay,
CL E IA ) , 應屬酶免疫分析, 只是酶反應的底物是發光劑, 操作步驟與酶免分析完全相同[ 5 ]: 以酶標記生物活性物質(如酶標記的抗原或抗體) 進行免疫反應, 免疫反應復合物上的酶再作用於發光底物, 在信號試劑作用下發光, 用發光信號測定儀進行發光測定。目前常用的標記酶為辣根過氧化物酶(HRP) 和鹼性磷酸酶(AL P) , 它們有各自的發光底物。 常用的底物為魯米諾(32氨基鄰苯二甲醯肼,lum ino l) , 或其衍生物如異魯米諾(42氨基鄰苯二甲醯肼) , 是一類重要的發光試劑。魯米諾的氧化反應在鹼性緩沖液中進行, 在過氧化物酶及活性氧[ 過氧化陰離子(O 2- ) , 單線態氧(1O 2 ) , 羥自由基(OH·) , 過氧化氫(H2O 2) ]存在下,生成激發態中間體, 當其回到基態時發光, 其波長為425nm。
早期用魯米諾直接標記抗原(或抗體) , 但標記後發光強度降低而使靈敏度受到影響。近來用過氧化物酶標記抗體, 進行免疫反應後利用魯米諾作為發光底物, 在過氧化物酶和起動發光試劑(N aOH2H2O 2) 作用下, 魯米諾發光, 發光強度依賴於酶免疫反應物中酶的濃度。Kodak Am erliteTM 半自動分析系統就是利用這一體系專門設計的。 (enhanced lum ines2cence enzym e imm unoassay, ELEIA )
在發光系統中加入增強發光劑, 如對2碘苯酚等, 以增強發光信號, 並在較長時間內保持穩定, 便於重復測量, 從而提高分析靈敏度和准確性。在全自動分析儀上, 還可通過計算機嚴密控制, 進行自動操作, 如加試劑, 混合, 溫育, 洗滌, 加發光試劑, 發光計數, 數據處理, 繪制標准曲線, 直至完成病人血清樣品的分析並列印出結果。Am erliteTM 發光增強酶免分析系統用熒光素、噻唑等增強劑, 其發光時間可持續長達20m in, 試劑盒有甲狀腺功能檢測的
促甲狀腺素、三碘甲腺原氨酸、甲狀腺素、甲狀腺素結合球蛋白、游離甲狀腺素, 與性激素有關的有促黃體激素、促卵泡激素、人絨毛膜促性腺激素、甲胎蛋白、雌二醇、睾酮, 以及其他方面的如癌胚抗原、鐵蛋白、地高辛等。 所用底物為環1, 22二氧乙烷衍生物, 這是一類很有前途的發光底物 , 用於化學發光酶免分析底物而設計的分子結構中包含起穩定作用的基團——金剛烷基, 其分子中發光基團為芳香基團和酶作用的基團, 在酶及起動發光試劑作用下引起化學發光。最常使用的底物是AM PPD [ 32(2』2 sp iroadam an2tane ) 42m ethoxy242( 3』2 pho spho ryloxy) 2phenyl21,22dioxetane ], 中文名為: 32(2』2 螺金剛烷) 242甲氧基242(3』2 磷醯氧基) 2苯基21, 22環二氧乙烷)。在鹼性磷酸酶(AL P) 作用下, 磷酸酯基發生水解而脫去一個磷酸基, 得到一個中等穩定的中間體AM PD (半壽期為2～ 30m in) , 此中間體經分子內電子轉移裂解為一分子的金剛烷酮和一分子處於激發態的間氧苯甲酸甲酯陰離子, 當其回到基態時產生470nm 的光, 可持續幾十分鍾(如圖5)。AM PPD 為磷酸酯酶的直接化學發光底物, 可用來檢測鹼性磷酸酯酶或酶和抗體、核酸探針及其它配基的結合物。可檢測到鹼性磷酸酯酶的濃度為10- 15mo l?L 。
美國DPC 公司的Imm u lite 全自動酶放大發光免疫分析儀, 以鹼性磷酸酶為標記物, 以金剛烷作發光底物, 測定靈敏度相當於10- 21mo l?mL 的酶, 採用聚苯乙烯珠作載體, 其檢測水平已能達到10- 12g?mL。

③ 化學發光免疫分析法有哪三類

1、直接化學發光，標記物為吖啶酯（雅培）或者ABEI（新產業）

2、酶促化學發光，標記物為鹼性磷酸酶（廈門波生）或者辣根過氧化物酶（強生）

3、電化學發光，標記物為三聯吡啶釕（羅氏）

註：括弧內為代表廠家。

④ 化學發光免疫分析法的原理

1、直接化學發光，標記物為吖啶酯（雅培）或者abei（新產業）
2、酶促化學發光，標記物為鹼性磷酸酶（廈門波生）或者辣根過氧化物酶（強生）
3、電化學發光，標記物為三聯吡啶釕（羅氏）
括弧內為代表廠家

⑤ 化學發光免疫分析法有哪三類

1、直接化學發光，標記物為吖啶酯（雅培）或者ABEI（新產業）

2、酶促化學發光，標記物為鹼性磷酸酶（廈門波生）或者辣根過氧化物酶（強生）

3、電化學發光，標記物為三聯吡啶釕（羅氏）

註：括弧內為代表廠家。

⑥ 免疫學檢驗常用技術有哪些

以下是幾種常用的免疫學技術：
1．免疫熒光技術
免疫熒光技術是利用熒光素標記的抗體（或抗原）檢測組織、細胞或血清 中的相應抗原（或抗體）的方法。由於熒光抗體具有安全、靈敏的特點，因此已 廣泛應用在免疫熒光檢測和流式細胞計數領域。根據熒光素標記的方式不同，可 分為直標熒光抗體和間標熒光抗體。間標熒光抗體中一抗並不直接連接熒光素， 而是先將一抗結合到蛋白，然後帶有熒光素的二抗再結合至一抗。通過二抗的結 合，能將信號進行放大，因此能在一定程度上提高檢測的靈敏度，但是隨之帶來 的高背景也降低了檢測的特異性。近年來，隨著熒光素和熒光檢測技術的不斷進 步，熒光檢測的靈敏度已經接近同位素檢測的水平，直接標記的熒光抗體逐漸取 代間接標記抗體。這些標記了熒光素的抗體直接結合至抗原，大大提高了檢測的 特異性，使檢測的結果更加准確可靠。熒光檢測技術的發展，使得免疫熒光技術 在傳染病診斷上有廣泛的用途，如在細菌、病毒、螺旋體感染的疾病，檢查IgM 抗體，做為近期接觸抗原的標志。利用單克隆熒光直接標記抗體鑒定淋巴細胞的 亞類。通過流式細胞儀，針對細胞表面不同抗原，可以同時使用多種不同的熒光 抗體，對同一細胞進行多標記染色。
2．放射免疫檢測
放射免疫檢測技術是目前靈敏度最高的檢測技術，利用放射性同素標記抗 原（或抗體），與相應抗體（或抗原）結合後，通過測定抗原抗體結合物的放射 性檢測結果。放射性同位素具有pg 級的靈敏度，且利用反復曝光的方法可對痕 量物質進行定量檢測。但放射性同位素對人體的損傷也限制了該方法的使用。

3．酶聯免疫吸附試驗（ELISA）
酶聯免疫檢測是目前應用最廣泛的免疫檢測方法。該方法是將二抗標記上 酶，抗原抗體反應的特異性與酶催化底物的作用結合起來，根據酶作用底物後的 顯色顏色變化來判斷試驗結果，其敏感度可達ng 水平。常見用於標記的酶有辣 根過氧化物酶(HRP)、鹼性磷酸酶（AP）等。由於酶聯免疫法無需特殊的儀器， 檢測簡單，因此被廣泛應用於疾病檢測。常用的方法有間接法、夾心法以及BAS －ELISA。間接法是先將待測的蛋白抱被在孔板內，然後依次加入一抗、標記了 酶的二抗和底物顯色，通過儀器（例如酶標儀）定量檢測抗原。這種方法操作簡 單但由於高背景而特異性較差。目前已逐漸被夾心法取代。夾心法利用二種一抗 對目標抗原進行捕獲和固定，在確保靈敏度的同時大大提高了反應的特異性。近 年來，抗原的定量檢測技術也不斷推陳出新。近年來，在夾心法ELISA 的基礎上， 開發了多抗原檢測試劑盒，能同時檢測微量液相樣本中多個抗原含量。這項技術 的應用大大縮短了診斷的時間，提高診斷的可靠性和及時性。
4．免疫金膠體技術
膠體金技術經過30 多年的發展到現在已日趨成熟，該方法是將二抗標記上 膠體金顆粒，利用抗原抗體間的特異性反應，最終將膠體金標記的二抗吸附於滲 濾膜上，此方法簡單，快速，廣泛應用於臨床篩查。

⑦ 簡介免疫分析技術

免疫技術為20世紀90年代優先研究、開發和利用的農葯殘留分析技術，世界糧農組織(FAO)已向許多國家推薦此項技術。免疫分析法(immunoassay，IA)是將免疫反應與現代測試手段相結合而建立的超微量測定技術。免疫分析法是生物酶技術、熒光光譜技術、輻射技術、免疫分析技術應用於農葯殘留分析領域的一門新技術，是基於抗原和抗體之間的特異性識別和結合反應為基礎的一種微量分析方法。免疫是機體識別和排除進人體內的抗原性異物的保護性應答反應。較大分子的農葯可以直接作為抗原進入脊椎動物的體內產生免疫應答，從而得到可以和該農葯分子特異性結合的抗體；小分子量的農葯(相對分子質量<2500)一般不具備免疫原性，不能刺激動物產生免疫反應，但有與相應抗體在體外發生吸附反應的能力，即有反應原性，這類小分子物質在免疫學上稱為半抗原。農葯是半抗原，一般不具備抗原性，不能刺激動物產生免疫反應，需要首先將該小分子通過與一定碳鏈長度、大分子的載體蛋白質(通常使用牛血清白蛋白、人血清白蛋白、兔血清白蛋白、鑰孔血藍蛋白、卵清蛋白)以共價鍵偶聯制備成人工抗原，使動物產生免疫反應，產生識別該農葯並與之特異性結合的抗體。以共價鍵偶聯成人工抗原使動物產生免疫反應從而產生識別該農葯並與之相結合的抗體(多克隆抗體)，通過對半抗原或抗體進行標記(酶、熒光物質、放射性同位素等)，利用標記物的生物、物理、化學放大作用，對樣品中的特定的農葯殘留進行定性或定量檢測。通過對半抗原或抗體進行標記(放射性核素、酶、熒光素標記等)，利用標記物的生物或物理或化學放大作用來進行工作，它集測定的高靈敏性和抗體反應的強特異性於一體。它的開發過程需要投入較多資金和較長時間，但具有簡單、快速、靈敏度高、特異性強、價廉、樣品所需量少等優點。目前多用於單一農葯殘留檢測，不適合應用於多殘留檢測。1971年Ercegovich[塢。]最先討論了農葯DDT、馬拉硫磷及氨三唑(amino—triazole)的免疫測定。隨後，大量研究免疫分析法在農葯殘留中的應用。Kun等報道了利用免疫分析測定對硫磷殺蟲劑農葯殘留，最低檢測限達到26ng／mL，相對標准偏差小於10
9／6。Laura等[塢0]報道利用化學發光免疫分析(cL—IA)測定農葯殘留。Anne等報道用非同位素免疫分析法(cMIA)測定氯麥隆殺蟲劑，採用傅里葉變換紅外光譜(FTIR)作為檢測器，極大提高靈敏度。農葯殘留的免疫學技術檢測食品的范圍很廣，包括水果、蔬菜、飲料、啤酒、葡萄酒、乳、肉、動植物油、蜂蜜、豆類、穀物等。一些商品化的試劑盒也相繼開發出來。國家農業部環保所李治祥和黃土忠於1990年研製了農葯殘毒速測箱，其原理就是有機磷和氨基甲酸酯類農葯對動物和昆蟲的致毒作用是通過特異性抑制膽鹼酯酶(chE)來實現的。將chE與樣品提取液反應，若chE受到抑制，表明樣品提取液中含有OPS和氨基甲酸酯類農葯，這時基質不能水解，就不能變色；否則ChE不受到抑制，基質水解產生藍色。另外，國外還推出了多種酶標試劑盒應用於常規分析及田間檢測的快速篩選，作為儀器分析的輔助方法發揮了一定的作用。免疫分析法作為農葯殘留快速篩選檢測方法受到重視。 更多相關資訊/技術資料，請參考國家標准物質網www.rmhot.com.

⑧ 體內葯物分析常用的分析方法有

葯學專業知識（一）第六章生物葯劑學，是研究葯物吸收、分布、代謝與排泄過程，闡明葯物制劑劑型因素，生物因素與葯效關系。下面小編總結了葯物在體內的各過程：

體內過程示意圖
了解完葯物在體內的過程示意圖，接著我們來掌握執業葯師考試中涉及的相關考點：

1. 需要掌握的幾個概念

2. 葯物的跨膜轉運

【相關考題】

1.大部分口服葯物的胃腸道中最主要的吸收部分是

A.胃

B.小腸

C.盲腸

D.結腸

E.直腸

2.藉助載體或酶促系統，消耗機體能量，從膜的低濃度一側向高濃度一側轉運的方式是

A.濾過

B.簡單擴散

C.易化擴散

D.主動轉運

E.膜動轉運

答案：B D

⑨ 化學發光免疫分析技術的其他發光免疫分析技術

3. 1微粒體發光免疫分析(m icropart icle lum ines2cence enzym e imm unoassay,MLEIA )
3. 2電化學發光免疫分析(elect rochem ilum inesc2ence imm unoassay, ECLIA )
3. 3時間分辨熒光免疫分析( t im e2reso lved f luo2rescen t imm unoassay, TrFIA )
3. 4激光免疫分析( laser imm unoassay,LIA )