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環境微生物研究方法

發布時間:2023-09-19 06:20:20

⑴ 微生物生長的幾種檢測方法

一、生長量測定法

1.1體積測量法:又稱測菌絲濃度法。

通過測定一定體積培養液中所含菌絲的量來反映微生物的生長狀況。方法是,取一定量的待測培養液(如10毫升)放在有刻度的離心管中,設定一定的離心時間(如5分鍾)和轉速(如5000rpm),離心後,倒出上清夜,測出上清夜體積為v,則菌絲濃度為(10-v)/10。菌絲濃度測定法是大規模工業發酵生產上微生物生長的一個重要監測指標。這種方法比較粗放,簡便,快速,但需要設定一致的處理條件,否則偏差很大,由於離心沉澱物中夾雜有一些固體營養物,結果會有一定偏差。

1.2稱乾重法:

可用離心或過濾法測定。一般乾重為濕重的10-20%。在離心法中,將一定體積待測培養液倒入離心管中,設定一定的離心時間和轉速,進行離心,並用清水離心洗滌1-5次,進行乾燥。乾燥可用烘箱在105℃或100℃下烘乾,或採用紅外線烘乾,也可在80℃或40℃下真空乾燥,乾燥後稱重。如用過濾法,絲狀真菌可用濾紙過濾,細菌可用醋酸纖維膜等濾膜過濾,過濾後用少量水洗滌,在40℃下進行真空乾燥。稱乾重發法較為煩瑣,通常獲取的微生物產品為菌體時,常採用這種方法,如活性乾酵母(activitydryyeast,ADY),一些以微生物菌體為活性物質的飼料和肥料。

1.3比濁法:

微生物的生長引起培養物混濁度的增高。通過紫外分光光度計測定一定波長下的吸光值,判斷微生物的生長狀況。對某一培養物內的菌體生長作定時跟蹤時,可採用一種特製的有側臂的三角燒瓶。將側臂插入光電比色計的比色座孔中,即可隨時測定其生長情況,而不必取菌液。該法主要用於發酵工業菌體生長監測。如我所使用UNICO公司的紫外-可見分光光度計,在波長600nm處用比色管定時測定發酵液的吸光光度值OD600,以此監控E.Coli的生長及誘導時間。

1.4菌絲長度測量法:

對於絲狀真菌和一些放線菌,可以在培養基上測定一定時間內菌絲生長的長度,或是利用一隻一端開口並帶有刻度的細玻璃管,到入合適的培養基,卧放,在開口的一端接種微生物,一段時間後記錄其菌絲生長長度,藉此衡量絲狀微生物的生長

二、微生物計數法

2.1血球計數板法:

血球計數板是一種有特別結構刻度和厚度的厚玻璃片,玻片上有四條溝和兩條嵴,中央有一短橫溝和兩個平台,兩嵴的表比兩平台的表面高0.1mm,每個平台上刻有不同規格的格網,中央0.1mm2面積上刻有400個小方格。通過油鏡觀察,統計一定大格內微生物的數量,即可算出1毫升菌液中所含的菌體數。這種方法簡便,直觀,快捷,但只適宜於單細胞狀態的微生物或絲狀微生物所產生的孢子進行計數,並且所得結果是包括死細胞在內的總菌數。

2.2染色計數法:

為了彌補一些微生物在油鏡下不易觀察計數,而直接用血球計數板法又無法區分死細胞和活細胞的不足,人們發明了染色計數法。藉助不同的染料對菌體進行適當的染色,可以更方便的在顯微鏡下進行活菌計數。如酵母活細胞計數可用美藍染色液,染色後在顯微鏡下觀察,活細胞為無色,而死細胞為藍色。

2.3比例計數法:

將已知顆粒(如黴菌孢子或紅細胞)濃度的液體與一待測細胞濃度的菌液按一定比例均勻混合,在顯微鏡視野中數出各自的數目,即可得未知菌液的細胞濃度。這種計數方法比較粗放。並且需要配製已知顆粒濃度的懸液做標准。

2.4液體稀釋法:

對未知菌樣做連續十倍系列稀釋,根據估計數,從最適宜的三個連續的10倍稀釋液中各取5毫升試樣,接種1毫升到3組共15隻裝培養液的試管中,經培養後記錄每個稀釋度出現生長的試管數,然後查最大或然數表MPN(mostprobablynumber)得出菌樣的含菌數,根據樣品稀釋倍數計算出活菌含量。該法常用於食品中微生物的檢測,例如飲用水和牛奶的微生物限量檢查。

2.5平板菌落計數法:

這是一種最常用的活菌計數法。將待測菌液進行梯度稀釋,取一定

體積的稀釋菌液與合適的固體培養基在凝固前均勻混合,或將菌液塗布於已凝固的固體培養基平板上。保溫培養後,用平板上出現的菌落數乘以菌液稀釋度,即可算出原菌液的含菌數。一般以直徑9cm的平板上出現50-500個菌落為宜。但方法比較麻煩,操作者需有熟練的技術。平板菌落計數法不僅可以得出菌液中活菌的含菌數,而且同時將菌液中的細菌進行了一次分離培養,獲得了單克隆。

2.6試劑紙法:

在平板計數法的基礎上,發展了小型商品化產品以供快速計數用。形式有小型厚濾紙片,瓊脂片等。在濾紙和瓊脂片中吸有合適的培養基,其中加入活性指示劑2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC,無色)待蘸取測試菌液後置密封包裝袋中培養。短期培養後在濾紙上出現一定密度的玫瑰色微小菌落與標准紙色板上圖譜比較即可估算出樣品的含菌量。試劑紙法計數快捷准確,相比而言避免了平板計數法的人為操作誤差。

2.7膜過濾法:

用特殊的濾膜過濾一定體積的含菌樣品,經丫叮橙染色,在紫外顯微鏡下觀察細胞的熒光,活細胞會發橙色熒光,而死細胞則發綠色熒光。

2.8生理指標法:

微生物的生長伴隨著一系列生理指標發生變化,例如酸鹼度,發酵液中的含氮量,含糖量,產氣量等,與生長量相平行的'生理指標很多,它們可作為生長測定的相對值。

2.9測定含氮量:

大多數細菌的含氮量為乾重的12.5%,酵母為7.5%,黴菌為6.0%。根據含氮量×6.25,即可測定粗蛋白的含量。含氮量的測定方法有很多,如用硫酸,過氯酸,碘酸,磷酸等消化法和Dumas測N2氣法。Dumas測N2氣法是將樣品與CuO混合,在CO2氣流中加熱後產生氮氣,收集在呼吸計中,用KOH吸去CO2後即可測出N2的量。

2.10測定含碳量:

將少量(乾重0.2-2.0mg)生物材料混入1毫升水或無機緩沖液中,用2毫升2%的K2Cr2O7溶液在1000C下加熱30分鍾後冷卻。加水稀釋至5毫升,在580nm的波長下讀取吸光光度值,即可推算出生長量。需用試劑做空白對照,用標准樣品做標准曲線。

2.11還原糖測定法:

還原糖通常是指單糖或寡糖,可以被微生(轉載於:mHg)的條件下才能生長,他們有完整的呼吸鏈,以分子氧為最終氫受體,具有超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶。

兼性厭氧菌:它是以在有氧條件下的生長為主也可兼在厭氧條件下生長的微生物,有時也稱「兼性好氧菌」。

微好氧菌:只能在嬌滴滴額氧分壓(1.33~3.Pa,正常大氣中的氧分壓為0.2bar)下才能正常生長的微生物。

耐氧菌:耐氧性厭氧菌的簡稱,是一類可在分子氧存在下進行發酵性厭氧生活的厭氧菌。

厭氧菌:有一般厭氧菌與嚴格厭氧菌(專性厭氧菌)之分。

超氧陰離子自由基:活性氧的形式之一,因有奇數電子,故帶負電荷;它既有分子性質,又有離子性質;其性質極不穩定,化學反應力極強,在細胞內可破壞各種重要生物大分子和膜結構,還可形成其他活性氧化物,故對生物體極其有害。

超氧化物歧化酶(SOD):保護好氧菌免受超氧化物陰離子自由基的毒害的酶。按SOD分子中所含金屬輔基的不同分三類:1、含Cu、Zn的SOD,存在於幾乎所有真核生物的細胞質中;2、含Fe的SOD,主要存在原核生物中;3、含Mn的SOD,主要存在於真核生物的線粒體中。SOD除可清除超氧陰離子自由基外,還發現在防治人體衰老、治療自身免疫性疾病、抗癌、防白內障、治療放射病和肺氣腫以及解除苯中毒等方面有一系列療效。

PRAS培養基:用嚴格厭氧方法配置、分裝、滅菌後的厭氧菌培養基,稱為預還原無氧滅菌培養基,即PRAS培養基。

厭氧罐:培養厭氧菌的裝置。

亨蓋特滾管技術:一種集制備高純氮、以氮驅氧和全過程實現無氧操作、無氧培養、無氧檢測於一體,用於研究嚴格厭氧菌的技術和裝置。

厭氧手套箱:一種用於無氧操作和培養嚴格厭氧菌的箱形密閉裝置。

搖瓶培養:一般將三角瓶內培養液的瓶口用8層紗布包紮,以利通氣和防止雜菌污染,同時減少瓶內裝液量,把它放在往復式或旋轉式搖床上作有節奏的震盪,以達到提高溶氧量的目的。

曲:是一類用麩皮、米糠等疏鬆的固體營養料接種、培養微生物而製成的含氧活菌產品。

曲法培養:將麩皮、碎麥或豆餅等固態基質經蒸煮和自然接種後,薄薄地鋪在培養容器表面,使微生物即可獲得充足的氧氣,又有利於散發熱量,對真菌來說,還有利於產生大量孢子。

通風曲:一種機械化程度和生產效率都較高的現代大規模製曲技術,在我國醬油釀造業中廣泛應用。

污染:有害微生物通過氣流、水流、接觸和人工接種等方式,傳播到合適的基質或生物對象上而造成種種危害。

巴氏消毒法:有發過微生物學家巴斯德用於果酒消毒,故名。這是一種專用於牛奶、啤酒、果酒或醬油等不宜進行高溫滅菌的也太風味食品或調料的低溫消毒方法(一般在60-85度下處理30min至15s)。有兩種方法:1、低溫維持法;2、高溫瞬時法。

間歇滅菌法:適用於不耐熱的培養基滅菌。方法是:講帶滅菌的培養基放在80-100度下蒸煮15-60min,以殺滅其中所有的微生物營養體,然後放至室溫37度下保溫過

夜,誘使其中殘存的芽孢發芽,第二天再以同樣方法蒸煮和保溫過夜,如此重復3天即可在較低的滅菌溫度下同樣達到徹底滅菌的效果。

連續加壓蒸氣滅菌法:讓培養基在管道的流動過程中快速升溫、維持和冷卻,然後流進發酵罐。

梅拉特反應:高溫滅菌時,培養基中得氨基化合物(氨基酸、肽、蛋白質)的游離氨基與羧基化合物(糖類)的羰基間發生復雜的化學反應,導致培養基褐變同時,還降低了有關營養物成分,故應設法避免。

石炭酸系數:一定時期內,被試葯劑能殺死全部供試菌的最高稀釋度與達到同效果的石炭酸的最高稀釋度之比。

抗生素:一類有微生物或其他生物生命活動過程中合成的此生代謝產物或其人工衍生物,他們在很低濃度時就能一直或干擾他種生物的生命活力,因而可用作有兩的化學治療劑。

抗代謝葯物:一類在化學結構上與細胞內必要代謝物的結構相似,並可干擾正常代謝活動的化學物質。3種作用:1、與正常代謝物一起共同競爭酶的活性中心,從而使微生物正常代謝所需要的重要物質無法正常合成,例如磺胺類;2、「假冒」正常代謝物,使微生物合成出無法正常生理活動的假產物,如8-重氮鳥嘌呤取代鳥嘌呤而合成的核苷酸就會產生無正常功能的RNA;3、某些抗代謝葯物與某一生化合成途徑的終產物結構類似,可通過反饋調節破壞正常代謝調節機制,例如,6-巰基腺嘌呤可抑制腺嘌呤核苷酸的合成。

選擇毒力:大於病原菌具高度毒力而對其宿主基本無毒的化學物質來抑制宿主體內病源微生物的生長繁殖,藉以達到治療該宿主傳染病的一種措施。

⑵ 微生物學的研究方法和技術有哪些

  1. 微生物學的研究方法和技術有:

    顯微技術,純種培養技術,無菌技術,純種分離純化技術和微生物保藏技術。

  2. 顯微技術(micros):顯微技術是利用光學系統或電子光學系統設備,觀察肉眼所不能分辨的微小物體形態結構及其特性的技術。包括:①各種顯微鏡的基本原理、操作和應用的技術;②顯微鏡樣品的制備技術;③觀察結果的記錄、分析和處理的技術。

  3. 純培養:純培養最重要的是在於微生物的生理研究,方法是依靠滅菌和分離,是由巴斯德(L.Pasteur)和柯赫(R.Koch)建立起來的。在自然界中,有的培養條件很困難,特別是具有密切共生關系的生物及進行寄生性營養的生物;也有一些在理論上不可能進行純粹培養的生物。純培養(pure culture)——微生物學中把從一個細胞或一群相同的細胞經過培養繁殖而得到的後代,稱純培養。

  4. 無菌技術:無菌技術是在醫療護理操作過程中,保持無菌物品、無菌區域不被污染、防止病原微生物 侵入人體的一系列操作技術。無菌技術(aseptic technique) 是指在執行醫療、護理技術過程中,防止一切微生物侵入機體和保持無菌物品及無菌區域不被污染的操作技術和管理方法。

  5. 純化:純化是將多糖混合物分離為單一多糖的過程。在進行菌種鑒定時,所用的微生物一般均要求為純的培養物。得到純培養的過程稱為分離純化。

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⑶ 空氣微生物采樣研究的方法~

空氣浮游微生物采樣器是根據顆粒撞擊原理和等速采樣理論設計。被采樣的帶有微生物的空氣在抽氣泵作用下,高速噴射並撞擊到裝有培養基的培養皿上,經培養後形成菌落予以計數。

對固體撞擊式采樣法與平板沉降法進行初步實驗。結果表明,使用固體撞擊式采樣法測定空氣微生物的含量總數與平板沉降法采獲的總數結果差異有顯著性,平板沉降法只能收集到較大顆粒的微生物,不能作精確的定量計數,它可作為一般衛生學的檢驗手段。固體撞擊式采樣法對懸浮於空氣中小顆粒微生物捕獲率高於沉降法,並能較准確地表達出空氣中細菌的實際含量,是一種較理想的的采樣方法。

⑷ 檢測不同環境中的細菌和真菌實驗步驟

細菌和真菌的分布
作為自然界中微生物的細菌和真菌是我們肉眼看不見的,必須藉助於一定的器械(顯微鏡),但是它們又是無處不在的。未了弄清楚它們的分布情況,特進行探究:
1、實驗中要選取五套培養皿進行實驗,一個做為對比,另外四個用來培養不同環境中的細菌,並且是在不同的環境中培養,以便得出細菌和真菌的生存條件。
2、實驗所使用的培養皿要經過高溫滅菌(讓學生想一想是為什麼),並且每一組的培養皿要在相同的環境條件下培養。也即是說要准備至少5套培養皿(每一個小組)。因為對比不同環境中的細菌與真菌的存在情況,是屬於單因素比較,所以除了采樣地點是變數外,進行微生物培養的條件等也要保持一致(溫度、濕度等)。
3、經過高溫處理後可以將培養皿上、培養基內混有的細菌或真菌的孢子等殺死(經過嚴格的高溫滅菌的環境中是不可能有細菌和真菌存在的),這樣就排除了實驗外其他環境的污染。因此,在實驗前不要盲目的打開培養皿,以防止細菌或真菌的孢子等落在培養基上,實驗中用無菌棉棒的目的同樣是為了防止棉棒上的微生物污染培養基。也就是說在接種的時候要注意污染。
4、在不同的環境中細菌的分布是不相同的,因此在採集菌種的時候要注意選擇環境,做到要有一定的代表性。
5、接種好的培養基要放在特定的環境條件下進行培養。
(將對照組放在一定的環境中培養,將另外四組放在四個不同的環境中進行培養,以便研究細菌和真菌的生存條件,同時也可以思考我們在生活中用什麼方法來防止細菌和真菌的污染;尤其是醫院又以什麼為標准來判斷。)
6、在檢測不同環境中的細菌和真菌時,每一個小組的成員要作好分工,以保證在規定的時間內做好觀察與記錄。同時也便於小組成員間的相互討論以及小組之間的討論。(分析細菌和真菌的生存環境,分布范圍,多少等等)。

⑸ 環境微生物學的研究內容

環境介質中(包括水、土壤、空氣等)微生物的分布、種類、特性等。更深一步的研究方向一般與其他學科交叉,如環境微生物與健康、環境微生物與能源利用、環境微生物與污染治理等等方向。

⑹ 微生物群落結構的研究方法有哪些

分離培養技術在土壤微生物的研究中有很大的局限性,因為土壤中的微生物大部分還處於不能被分離培養狀態.隨著微生物研究技術的發展尤其是分子生物學技術的發展,一系列不依賴於培養的技術在土壤微生物研究中得到廣泛應用.本文介紹了生物標志物法、SCSU、DNA復性分析、DGGE、TGGE、ARDRA、T-RFLP、SSCP、PAPD和ERIC-PCR圖譜分析等方法在土壤微生物群落結構研究中的應用.

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