適用於抗葯性抗體的分析方法

1. 利用基因工程技術進行葯物的研製與開發時，目的基因的鑒定方法有哪些其原理是什麼

目的序列與載體DNA正確連接的效率、重組導入細胞的效率都不是百分之百的，因而最後生長繁殖出來的細胞並不同都帶有目的序列。一般一個載體只攜帶某一段外源DNA，一個細胞只接受一個重組DNA分子。最後培養出來的細胞群中只有一部分、甚至只有很小一部分是含有目的序列的重組體（recombinant）。將目的重組體篩選出來就等於獲得了目的序列的克隆，所以篩選(dcreening)是基因克隆的重要步驟。在構建載體，選擇宿主細胞、設計分子克隆方案時都必須仔細考慮篩選的問題。以下就常用技術的基本原理加以介紹。
一、根據重組載體的標志作篩選
最常見的載體攜帶的標志是抗葯性標志，如抗氨芐青黴素（anpr）、抗四環素(terr)、抗卡那黴素(kanr)等。當培養基中含有抗生素時，只有攜帶相應抗葯性基因載體的細胞才能生存繁殖，這就把凡未能接受載體DNA的細胞全部篩除掉了。如果外源目的序列是插入在載體的抗葯性基因中間使這抗葯性基因失活，這個抗葯性標志就會消失。例如質粒pBR322含有anpr、和terr兩個抗葯基因，若將目的序列插入terr基因序列中，轉化大腸桿菌，讓細菌放在含氨芐青黴素或四環素培養基中，凡未接受質粒DNA的細胞都不能生長；凡在含氨芐青黴素和四環素中都能生長的細菌是含有質粒pBR322的，但其pBR322未插入目的序列，凡在氨芐青黴素中能生長、而在四環素中不能生長的細菌就很可能是含有目的序列的重組質粒。 載體含有lacZ』的藍白篩選法，近年更被廣泛應用。例如將目的序列插入前面述及的質粒pUC19的多克隆位點，轉化大腸桿菌，放入含氨芐青黴素、IPTG、X-gal的培養基中培養，凡能生長並呈白色的菌落，其細菌中就很可能含有插入目的序列的重組質粒，這樣就很容易獲得目的序列的克隆。 根據重組載體的標志來篩選，可以篩選去大量的非目的重組體，但還只是粗篩，例如細菌可能發生變異而引起抗葯性的改變，卻並不代表目的序列的插入，所以需要做進一步細致的篩選。
二、核酸雜交法
利用標記的核酸做探針與轉化細胞的DNA進行分子雜交，可以直接篩選和鑒定目的序列克隆。常用的方法是將轉化後生長的菌落復印到硝酸纖維膜上，用鹼裂菌，菌落釋放的DNA就吸附在膜上，再與標記的核酸探針溫育雜交，核酸探針就結合在含有目的序列的菌落DNA上而不被洗脫。核酸探針可以用放射性核素標記，結合了放射性核酸探針的菌落集團可用放射性自顯影（auroradiography）法指示出來，核酸探針也可以用非放射性物質標記，通常是經顏色呈現指示位置，這樣就可以將含有目的序列的菌落挑選出來。
三、PCR法
PCR技術的出現給克隆的篩選增加了一個新手段。如果已知目的序列的長度和兩端的序列，則可以設計合成一對引物，以轉化細胞所得的DNA為模板進行擴增，若能得到預期長度的PCR產物，則該轉化細胞就可能含有目的的序列。
四、免疫學方
利用特定抗體與目的基因表達產物特異性結合的作用進行篩選。此法不是直接篩選目的基因，而是通過與基因表達產物的反應指示含有目的基因的轉化細胞，因而要求實驗設計要使目的基因進入受體細胞後能夠表達出其編碼產物。抗體可用特定的酶常用過氧化物酶、鹼性磷酸酶等標記，結合酶標抗體處，酶可催化特定的底物分解而呈現顏色，從而指示出含有目的的基因的細胞集落位置。免疫學方法特異性強、靈敏度高，適用於從大量轉化細胞集合體中篩選很少幾個含目的基因的細胞克隆。
五、DNA限制性內切酶圖譜分析
這是在上述篩選後的進一步分析。目的序列插入載體會使載體DNA限制性酶圖譜（restriction map）發生變化，例如一個長600bp的目的序列利用它兩端的EooR I和SalI切後的粘末端連接插入pUC19的多克隆點，則重組質粒就增大為3.3kb，用Eoor I和SalI雙酶切後會出現600bp和-2.7kb兩個DNA片段，提取轉化細菌的質粒DNA作酶切後做電泳觀察其酶切圖譜，就能分析得結果；如插入的目的序列中有其它限制性內切酶位點，也能在酶切電泳圖譜上觀察到。這就可以進一步鑒定重組體是不是所要的目的克隆。
六、核苷酸序列測定
所得到的目的序列或基因的克隆，都要用其核酸序列測定來最後鑒定。已知序列的核酸克隆要經序列測定確證所獲得的克隆準確無誤；未知序列的核酸克隆要測定序列才能確知其結構、推測其功能，用進一步的研究。因此核酸序列測定是分子克隆中必不可少的鑒定步驟。核酸序列測定的原理和方法在實驗教材中有詳細的敘述。

2. 酶聯免疫吸附分析法主要有哪三種

雙抗體夾心法

雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，操作步驟如下：

雙抗體夾心法

一、將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結合的抗體及雜質。

二、加受檢標本：使之與固相抗體接觸反應一段時間，讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結合，形成固相抗原復合物。洗滌除去其他未結合的物質。

三、加酶標抗體：使固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質的量正相關。

四、加底物：夾心式復合物中的酶催化底物成為有色產物。根據顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量。

根據同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標抗原結合物，即可用雙抗原夾心法測定標本中的抗體。

在臨床檢驗中，此法適用於檢驗各種蛋白質等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用於包被固相載體和制備酶結合物而建立此法。如抗體的來源為抗血清，包被和酶標用的抗體最好分別取自不同種屬的動物。如應用單克隆抗體，一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗，分別用於包被固相載體和制備酶結合物。這種雙位點夾心法具有很高的特異性，而且可以將受檢標本和酶標抗體一起保溫反應，作一步法檢測。

在一步法測定中，當標本中受檢抗原的含量很高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成"夾心復合物"。類同於沉澱反應中抗原過剩的後帶現象，此時反應後顯色的吸光值（位於抗原過剩帶上）與標准曲線（位於抗體過剩帶上）某一抗原濃度的吸光值相同，如按常法測讀，所得結果將低於實際的含量，這種現象被稱為鉤狀效應（hook effect），因為標准曲線到達高峰後呈鉤狀彎落。鉤狀效應嚴重時，反應甚至可不顯色而出現假陰性結果。因此在使用一步法試劑測定標本中含量可異常增高的物質（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）時，應注意可測范圍的最高值。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應。

假使在被測分子的不同位點上含有多個相同的決定簇，例如HBsAg的a決定簇，也可用針對此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結合物。但在HBsAg的檢測中應注意亞型問題，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4個亞型，顯然每種亞型均有相同的a決定簇的反應性，這也是用單抗作夾心法應注意的問題。

雙抗體夾心法測抗原的另一注意點是類風濕因子（RF）的干擾。RF是一種自身抗體，多為IgM型，能和多種動物IgG的Fc段結合。用作雙抗體夾心法檢測的血清標本中如含有RF，它可充當抗原成份，同時與固相抗體和酶標抗體結合，表現出假陽性反應。採用F（ab'）或Fab片段作酶結合物的試劑，由於去除了Fc段，從而可消除RF的干擾。雙抗體夾心法ELISA試劑是否受RF的影響，已被列為這類試劑的一項考核指標（參見6.2）。

雙抗體夾心法適用於測定二價或二價以上的大分子抗原，但不適用於測定半抗原及小分子單價抗原，因其不能形成兩位點夾心。

雙抗原夾心法測抗體

反應模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進行包被和制備酶結合物，以檢測相應的抗體。與間接法測抗體的不同之處為以酶標抗原代替酶標抗抗體。此法中受檢標本不需稀釋，可直接用於測定，因此其敏感度相對高於間接法。乙肝標志物中抗HBs的檢測常採用本法。本法關鍵在於酶標抗原的制備，應根據抗原結構的不同，尋找合適的標記方法。

雙位點一步法

在雙抗體夾心法測定抗原時，如應用針對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標抗體，則在測定時可使標本的加入和酶標抗體的加入兩步並作一步。這種雙位點一步不但簡化了操作，縮短了反應時間，如應用高親和力的單克隆抗體，測定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應用使測定抗原的ELISA提高到新水平。

在一步法測定中，應注意鉤狀效應（hookeffect），類同於沉澱反應中抗原過剩的後帶現象。當標本中待測抗原濃度相當高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成夾心復合物，所得結果將低於實際含量。鉤狀效應嚴重時甚至可出現假陰性結果。

間接法測抗體

間接法

間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標記的抗體以檢測已與固相結合的受檢抗體，故稱為間接法。操作步驟如下：

⑴將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原：洗滌除去未結合的抗原及雜質。

⑵加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結合，形成固相抗原抗體復合物。經洗滌後，固相載體上只留下特異性抗體。其他抗體及血清中的雜質由於不能與固相抗原結合，在洗滌過程中被洗去。

⑶加酶標抗抗體：與固相復合物中的抗體結合，從而使該抗體間接地標記上酶。洗滌後，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。例如欲測人對某種疾病的抗體，可用酶標羊抗人IgG抗體。

⑷加底物顯色：顏色深度代表標本中受檢抗體的量。

本法主要用於對病原體抗體的檢測而進行傳染病的診斷。間接法的優點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。

間接法成功的關鍵在於抗原的純度。雖然有時用粗提抗原包被也能取得實際有效的結果，但應盡可能予以純化，以提高試驗的特異性。特別應注意除去能與一般健康人血清發生反應的雜質，例如以E.Coli為工程酶的重組抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能與受過E.Coli感染者血清中的抗E.Coli抗體發生反應。抗原中也不能含有與酶標抗人Ig反應的物質，例如來自人血漿或人體組織的抗原，如不將其中的Ig去除，試驗中也發生假陽性反應。另外如抗原中含有無關蛋白，也會因競爭吸附而影響包被效果。

間接法中另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性抗體。病人血清中受檢的特異性IgG只佔總IgG中的一小部分。IgG的吸附性很強，非特異IgG可直接吸附到固相載體上，有時也可吸附到包被抗原的表面。因此在間接法中，抗原包被後一般用無關蛋白質（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封閉（blocking）固相上的空餘間隙。另外，在檢測過程中標本須先行稀釋（1:40~1:200），以避免過高的陰性本底影響結果的判斷。

競爭法

競爭法可用於測定抗原，也可用於測定抗體。以測定抗原為例，受檢抗原和酶標抗原競爭與固相抗體結合，因此結合於固相的酶標抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下：

⑴將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體。洗滌。

⑵待測管中加受檢標本和一定量酶標抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應。如受檢標本中無抗原，則酶標抗原能順利地與固相抗體結合。如受檢標本中含有抗原，則與酶標抗原以同樣的機會與固相抗體結合，競爭性地佔去了酶標抗原與固相載體結合的機會，使酶標抗原與固相載體的結合量減少。參考管中只加酶標抗原，保溫後，酶標抗原與固相抗體的結合可達最充分的量。洗滌。

⑶加底物顯色：參考管中由於結合的酶標抗原最多，故顏色最深。參考管顏色深度與待測管顏色深度之差，代表受檢標本抗原的量。待測管顏色越淡，表示標本中抗原含量越多。一般情況，是通過方波伏安法，檢測培養體系的峰電流，通過峰電流與抗原抗體的線性關系來最終確定體系的最終檢測目標的濃度。

當抗原材料中的干擾物質不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。其原理為標本中的抗體和一定量的酶標抗體競爭與固相抗原結合。標本中抗體量越多，結合在固相上的酶標抗體愈少，因此陽性反應呈色淺於陰性反應。如抗原為高純度的，可直接包被固相。如抗原中會有干擾物質，直接包被不易成功，可採用捕獲包被法，即先包被與固相抗原相應的抗體，然後加入抗原，形成固相抗原。洗滌除去抗原中的雜質，然後再加標本和酶標抗體進行競爭結合反應。競爭法測抗體有多種模式，可將標本和酶標抗體與固相抗原競爭結合，抗HBc ELISA一般採用此法。另一種模式為將標本與抗原一起加入到固相抗體中進行競爭結合，洗滌後再加入酶標抗體，與結合在固相上的抗原反應。抗HBe的檢測一般採用此法。

捕獲法

血清中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時存在，後者會干擾IgM抗體的測定。因此測定IgM抗體多用捕獲法，先將所有血清IgM（包括異性IgM和非特異性IgM）固定在固相上，在去除IgG後再測定特異性IgM。操作步驟如下：

⑴將抗人IgM抗體連接在固相載體上，形成固相抗人IgM。洗滌。

⑵加入稀釋的血清標本：保溫反應後血清中的IgM抗體被固相抗體捕獲。洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質成分。

⑶加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性IgM結合。洗滌。

⑷加入針對特異性的酶標抗體：使之與結合在固相上的抗原反應結合。洗滌。

⑸加底物顯色：如有顏色顯示，則表示血清標本中的特異性IgM抗體存在，是為陽性反應。

3. 體內葯物分析常用的分析方法有

葯學專業知識（一）第六章生物葯劑學，是研究葯物吸收、分布、代謝與排泄過程，闡明葯物制劑劑型因素，生物因素與葯效關系。下面小編總結了葯物在體內的各過程：

體內過程示意圖
了解完葯物在體內的過程示意圖，接著我們來掌握執業葯師考試中涉及的相關考點：

1. 需要掌握的幾個概念

2. 葯物的跨膜轉運

【相關考題】

1.大部分口服葯物的胃腸道中最主要的吸收部分是

A.胃

B.小腸

C.盲腸

D.結腸

E.直腸

2.藉助載體或酶促系統，消耗機體能量，從膜的低濃度一側向高濃度一側轉運的方式是

A.濾過

B.簡單擴散

C.易化擴散

D.主動轉運

E.膜動轉運

答案：B D

4. 多肽和蛋白質類葯物的分析方法

1.1生物檢定法
由於蛋白多肽類葯物多為有生物活性的物質,且生物活性不僅取決於葯物的一級結構，與二 、三級結構亦密切相關，故生物檢定法是研究該類葯物動力學獨特而必需的方法。生物檢定 法 有兩個目的，直接測定體液中葯物濃度及鑒定標記葯物的生物活性。其方法主要可分為兩大 類。
1.1.1在體分析常規的有胰島素的小鼠血糖法等，另外還有根據各 類蛋白多肽的生物活性 不同而建立的各異的方法，如根據IL-8可將大量中性粒細胞從骨中動員出的性質[1] 而建立 的IL-8動員中性粒細胞家兔體內實驗。這類方法最直觀地反映生物活性，但涉及整體動物 ，費時費力，靈敏度不高，變異較大。
1.1.2離體組織（細胞）分析如NGF刺激雞背根神經節增長，縮宮素 的大鼠離體子宮法等。 隨著分子生物學的發展，許多特異性強，靈敏度高的依賴細胞株被建立，細胞培養已是最常 用的方法。根據蛋白多肽與細胞相互作用的機理不同，具體的操作亦有多種。如細胞增殖法 （Proliferation assays）,快速靈敏,但特異性稍差; 抑制增殖法(Antiproliferation as s ays),檢測系統簡單,靈敏而專一; 減少細胞損傷法(Cytopathic effect rection assays ) [2],則是依據具有抗病毒活性的葯物如干擾素，保護細胞不受病毒損傷, 方法直觀 靈敏, 但 可能會受到多肽亞型的干擾。以上的方法都是以細胞數目的增減為量效指標，計數方法有直 接計數法和間接計數法，後者包括MTT法，同位素（3H,14C）摻入法 等。此外，還有根據蛋 白多肽與細胞間接作用進行檢測，如與免疫檢測聯用的抗體誘導法[3]，結合酶反 應的酶誘 導分解法[4]等。總的說來，細胞培養法多具有靈敏特異，客觀可靠的優點，但其 不足也顯 而易見。首先，生物檢定法無法定量失去活性的小代謝物，無法示蹤它們的體內動態；其次 ，樣品多存在於人或動物血清中，血清中內源物質的干擾以及可能存在的內源因子的交叉反 應，影響了方法的專屬性；再者，啟動生物過程常需閾量細胞因子從而降低了方法的靈敏度 ；依賴株細胞長期培養易發生變異而影響檢測的特異性。
1.2免疫學方法
免疫學方法是利用蛋白多肽葯物抗原決定簇部位的單克隆或多克隆抗體特異地識別被檢葯物 ，再以放射計數，比色等方法予以定量，即將特異的抗原抗體反應配以靈敏檢測的方法。常 用的方法有三種。
1.2.1放射免疫法（Radioimmunoassays RIA）該法是被測葯物（Ag ）,標記葯物（多為125I-Ag）與抗體（Ab）的競爭性結合反應，方法的特異性 取決於抗原抗體的親和力及標記葯 物的純度，與生物檢定法相比，有簡明，易於控制的優點。
1.2.2免疫放射定量法（Immunoradiometrec assays IRMA）該法中 被測葯物依然是Ag，它 先與固定相上的Ab形成Ab∶Ag復合物，再與標記抗體125I-Ab結合，形成Ab∶Ag ∶125I-Ab夾心 狀。由於Ag需有兩個Ab來識別，這就大大增加了方法的特異性，是一靈敏而低變異的方法， 只是對標記抗體的純度要求很高。
1.2.3酶聯免疫法（Enzyme-linked immunosorbent assays ELISA）ELISA的原理與IRMA相 似，只是第二個抗體不是用碘標，而是用可以與底物發生顯色反應的酶如HRP來標記，與上 述兩法相比，ELISA具有使用壽命長，重復性好，無輻射源的優點，並且已有不少實驗證明 ，它與生物檢定法具有一定的量效關系[4]及相關性[5]，提示它可部分地 反映葯物的生物活性。
免疫學方法的缺點在於它測定的是蛋白多肽的免疫活性而不是生物活性；不能同時測定代謝 物，且具有抗原決定簇的代謝片段可能增加結果誤差；不同來源的抗體與相同的蛋白多肽反 應可能有較大的差別；還可能受到內源物質的干擾。但免疫法畢竟是一種迅速，靈敏，適於批處理的方法，已有數十種蛋白多肽被開發成能滿足葯物動力學研究的商品葯盒。臨床 葯動學領域，免疫法已逐漸取代生物檢定法。
1.3同位素標記示蹤法
放射性同位素標記技術是研究蛋白多肽在生物體內處置的一種最常用的方法。所使用的同位 素有125I, 99mTc, 3H,14C, 35S 等，其中125I因比放射性高，半衰期適宜，標記制備簡單 而最為常用。標記方法有兩種，一是內標法，即把含有同位素的氨基酸加入生長細胞或合成 體系，該法對生物活性地影響可能較小，但由於制備復雜而限制了其廣泛應用；二是外標法 ，常用化學方法如氯胺T或Iodogen法將125I連接於大分子上，因相對簡單而被首 選。
同位素法具有簡便直觀，檢測迅速的優點，尤其適用於蛋白多肽葯物的組織分布研究，但其 缺點亦顯而易見。首先，它不能進行人體葯物動力學研究；其次，同位素標記後是否會引起 葯物的生物活性及其在生物體內的代謝行為發生變化，一直存在爭議．前者可通過調整反應 條件和生物檢定法加以改善和驗證，基本上可使生物活性無明顯變化；後者因葯而異則復雜 的多，已有報道認為[6]，放射性標記法可干擾表皮生長因子與細胞的相互作用， 從而導致 其體內清除的紊亂；最後，由於蛋白多肽進入體內會被降解代謝，或與其它蛋白質結合，總 的放射性不能代表葯物動力學過程，因此如何鑒別樣品的原葯，降解物及結合物是該法中需 解決的關鍵問題，常用的方法有兩種。
1.3.1SDS-PAGE法根據葯物Mr的大小選擇不同濃度的凝膠電 泳，通過控制電流等條件使得原 葯與其它產物分開，然後通過切割膠條放射計數或放射自顯影的方法，來檢測電泳放射性圖 譜。該法具有較高的解析度和靈敏度，但電泳過程中，125I-小肽和游離 125I可能擴散至空白凝膠或電解液中，從而使結果可能偏高。
1.3.2HPLC法高效反相色譜（RHPLC），高效排阻液相色譜（SEHPLC ）[7]，高效離子交換液相色 譜（IEHPLC）分別根據保留時間與蛋白多肽的疏水-親水性特徵，Mr大小，極性的 關系 來分離樣品中的物質。它們共同的優點是特異性高，解析度好，可同時測定原葯和降解物， 其中SEHPLC亦可得到結合物的信息，而RHPLC用於蛋白多肽的分離有獨特的優越性。但因受 注入樣品量的限制，靈敏度，重現性都受影響，且設備昂貴，成本較高。
1.3.3 HPLC-RAD法
高效液相偶聯同位素在線檢測系統。這種方法將HPLC的高度分析分離行為和同位素的高靈敏度檢測結合在一起。使得葯物的分析分離更加直觀和方便。特別在蛋白質多肽類葯物葯動學方面體現了其獨特的優點。
1.4色譜法
1.4.1HPLC在進行普通葯物動力學研究中，HPLC是技術成熟，應用廣 泛的分析手段。在蛋 白多肽葯物的實驗研究或產業化中，HPLC都是主要的分離純化工具。但鑒於蛋白多肽葯物結 構的特殊性，除了一些小分子多肽，如peptichemio[8]，加壓素的八肽拮抗劑（oc tapeptid e antagonist of vasopressin）[9]可分別直接或經選擇性柱反應後,單獨 用帶熒光檢測 器的HPLC進行葯動學研究外，HPLC常需進一步改進或與其它更靈敏的檢測技術聯用方能滿足 葯動學的需要。除了上述提及的與同位素的聯用，還有許多與免疫學方法的聯用，如Philli ps[10]採用免疫親和色譜技術分析人三種不同體液中粒細胞集落刺激因子的濃度； Partilla [11]等認為HPLC與RIA聯用可以檢測人體液中的神經肽。此外，令人矚目的還有液 /質在線聯用（LC-MS）。
LC-MS將高分離能力，適用范圍廣泛的色譜分離技術與高靈敏、專屬及通用,在研究蛋 白多肽的結構中具有重要價值的質譜法聯用起來，成為強有力的分離分析方法。多年來限制 LC-MS技術發展的決定因素是介面問題，由傳送帶介面（Moving-belt interface），熱噴 霧 介面（Thermospray），到最近的電噴霧離子化介面（Electrosptay ionization ESI），聯 用技術日趨成熟，尤其適用於生物樣品中低濃度（pg/ml）葯物及代謝物的測定[12] ，而蛋 白多肽類葯物恰有在體內代謝快，濃度低的特點。國外已將用LC-MS於該類葯物，葯物代 謝 物[13，14]的動力學研究，國內尚處於起步階段，除了儀器本身價格昂 貴，技術上亦存在 一些問題，如它對樣品的純度要求很高如何將葯物從生物體液，尤其是血漿中提取純化以 減少干擾；如何選擇合適的內標以減少系統誤差；在將LC-MS用於檢測體育禁用肽(HCG,HGH ,EPO,ACTH等)時發現，糖肽難用於質譜分析，因為在質譜條件下，同樣的氨基酸序列可產生 多種不同質量的多糖鏈，而每條鏈及整個分子都有可以產生質譜信號，這就大大降低了質譜 信號的專屬性。盡管LC-MS在蛋白多肽葯物的體內葯物代謝動力學研究中還存在一 定的難度，但其作為實用性強，前景好的領域已引起人們的廣泛關注。
1.4.2高效毛細管電泳（HPCE）HPCE是離子或荷電粒子以電場為驅動 力，在毛細管中按其 濃度和分配系數不同進行高效，快速分離的新技術，它以高解析度，高靈敏度，分析時間短 ，樣品量少及操作簡單等諸多優點而成為蛋白多肽生物分子分離分析的重要手段。在臨床 上 ，生物體液中低濃度蛋白多肽的分析面臨的問題有：蛋白多肽與毛細管壁的相互作用所引起 的遷移時間的改變，這可以通過塗層CE加以改善；由於毛細管很細，管內容積很小，進樣量 的不易控制給實驗的重復性帶來影響，而且很可能無法對低濃度的樣品提供足夠的靈敏度。 國外根據樣品的性質採用不同的預處理，大體上可分為非特異性和高親和性兩種， 將樣品加以濃縮，取得了滿意的效果[15]。HPCE在檢測上的迅速發展與HPLC已有並 駕齊驅之 勢，況且鑒於HPCE在樣品微量分析的優越性，已有人在葯物動力學研究、體內分析中，將微 透析連續采樣與之聯用[16]，這在整個葯動學研究中都不失為一有希望的方向。 2結語
由以上可知，現代科學技術的發展給蛋白多肽類葯物的研究提供了多樣的分析手段，但鑒於 該類葯物的特殊性，尚無一種方法能完全滿足動力學研究的要求。根據人用葯物注冊國 際協調會議（ICH）對生物葯物臨床前安全性評價「在科學基礎上的靈活性和具體情節個別 處理」的總則，人們通常將幾種方法聯合應用，互相補充，才能得到比較可靠的結果。

5. 怎樣監測病原物抗葯性

因為大多數植物病原菌的致病階段處於單倍體時期，且繁殖系數大、周期短，所以植物病原菌抗葯性是發生速度最快、為害最嚴重的農業有害生物。同時，病原菌抗葯性不容易被農民肉眼識別，必須通過實驗室精密測定才能鑒別和診斷，因此，世界各國投入殺菌劑抗性監測研究的人力和財力也最多。

病原物抗葯性監測是指測定自然界病原物群體對使用葯劑敏感性的變化。包括在各地定點連年系統測定和對有抗葯性懷疑的地方臨時採集標本測定。最常用的監測方法是測定病原物生長量與葯劑的效應關系。常見方法有菌落直徑法，即在含有系列濃度殺菌劑培養基上測量葯劑對菌落線性增長速率的抑制效應。採用乾重法測量在含葯的液體培養基中培養的菌體乾重增長速率與葯劑的效應，更能夠准確反映殺菌劑對菌體生長的抑製作用。不過這種方法比較繁瑣，工作量大。當病菌以孢子繁殖生長時，亦可採用濁度法測定細胞生長量與葯劑的效應。

採用臨界劑量或鑒別劑量是檢測和測量抗葯性廣度的常用方法。如在含有完全能抑制野生敏感菌生長的殺菌劑濃度的培養基平板上，塗抹病原物混合孢子或其他繁殖體，進行適當培養後，檢查病菌的生長情況，計算抗葯性菌株的出現頻率。

採用孢子萌發法也可測定葯劑對不同菌株孢子萌發的抑制來鑒別抗葯性。但是，許多內吸性殺菌劑並不阻止孢子萌發，這時應該考慮對芽管形態和菌體發育的作用。

活體測定法是指把病菌接種到經殺菌劑處理過的植株或部分組織上，評估葯劑處理劑量與發病程度間的效應關系。這種活體測定方法不僅是測定專性寄生菌抗葯性的唯一方法，而且是驗證病菌在培養基上對葯劑敏感性差異是否與在寄主上的反應差異一致必不可少的方法。例如，麥角甾醇生物合成抑制劑和二甲醯亞胺類殺菌劑在離體條件下，很容易引起真菌的抗性突變，但是，這些突變體對寄主的致病性也常隨之降低。此外，在培養基上能對葉枯唑表現抗葯性的稻白葉枯病菌，則失去了致病能力，而在經葉枯唑、敵枯唑等處理的水稻上表現抗性的菌株，在培養基上反而不表現抗性。

已知有些殺菌劑對菌體的呼吸作用或生物合成過程等生命過程有顯著抑製作用，可以用生化測定法，測定不同殺菌劑濃度對這些過程影響程度的差異來比較不同菌株的敏感性。或者基於靶標蛋白三維結構變化而喪失與葯劑的親和性抗葯性機制，制備和利用單克隆抗體進行免疫檢測。最近，也有根據單核苷酸變異而產生抗葯性的機制使用DNA探針雜交和PCR指紋圖譜等分子生物技術進行病原物抗葯性監測的成功例子。定量PCR檢測技術的開發和應用，使病原菌的抗葯性早期監測和預警成為可能。

一種病原物對某一農葯的敏感性還常隨著個體的遺傳差異、培養基組分、瓊脂的質量、溫度、pH、測試環境和方法的不一致而有變化。如在含乙磷鋁的PDA培養基上，疫霉的生長不受影響，但是在不含磷酸鹽的合成培養基上，這種真菌對葯劑則變得敏感。因此，某種葯劑—病原物組合的抗葯性測定，不但要選用適當的方法和條件進行，而且被懷疑有抗葯性的菌株也必須用測得敏感基線同樣的方法和條件進行各種測試，最好在所有抗葯性測定中均包含有一個已知敏感的參考系。

在測定某種病原物各個個體對農葯不同濃度的效應後，如何進一步鑒別和評估它們的抗葯性，常用的標准有3種：第一種是用同一濃度測定各個體對葯劑的反應；第二種是測定最低抑制濃度；第三種是測定產生相同效應的濃度，如抑制菌體生長發育或致病50%的有效濃度（EC50）。

第一種標准常會過高地評估抗葯性水平或抗性程度。因為病菌對同一劑量的效應有時差異很大。第二種標准也有缺陷。因為有的菌株抗葯性水平很高，如灰黴菌（Botrytiscinerea）對多菌靈的抗葯性，難以用最低抑制濃度來評估抗葯性水平，有些殺菌劑即使在很高濃度下也不能完全抑制菌體生長，同樣不能採用這種分析標准。但灰霉野生敏感菌株對多菌靈特別敏感，亦可用最低抑制濃度作為鑒別抗性和敏感菌株的標准。採用第三種分析標准，根據殺菌劑的劑量與抑制菌體生長發育的效應關系，得出劑量與生長抑制率之間的回歸方程，然後根據對測定菌株和標准野生敏感菌株的相同抑制生長發育百分率的葯劑濃度的比較，鑒別抗性菌株並分析抗性水平。有些病菌對某些葯劑的敏感性是由多個微效基因決定的，表現出數量遺傳性狀，雖很難評估某一菌株的抗性水平，但可以通過測定某地區用葯前病原群體（一般需測100個菌株）對葯劑的敏感性分布，用葯後再測定病原群體的敏感性，由此可根據平均EC50之比來評估某一地區病原群體的抗性水平。

6. 什麼是耐葯性與耐受性有什麼區別

耐葯性一般指微生物、寄生蟲以及腫瘤細胞對於化療葯物作用的耐受性，的是對葯物的治療反應比較差，就是治療沒有效果，一般是指抗生素類葯物。

耐葯性和耐受性的區別：

1、對象不同

耐葯性，是針對病原體而言的。在治療細菌性感染或寄生蟲病的過程中，長期使用某種葯物，往往會導致某種病菌或寄生蟲的基因變異，使該葯不能殺滅或抑制這種病原體；耐受性，是針對人體而言，指人體對葯物反應的一種適應性狀態和結果。

2、應對方式不同

產生耐受性後，停止用葯一段時間後，其耐受性可以逐漸消失；產生耐葯性後，需要加大葯物劑量，有時加大葯物劑量也不能再殺死這些耐葯病菌。

3、產生原因不同

耐葯性產生的原因主要來自於病原體或腫瘤細胞自身發生基因突變；耐受性產生的原因有先天的因素和後天的因素，後天原因主要是受體發生自我調節。

參考資料來源：網路-耐受性

參考資料來源：網路-耐葯性

7. 可用於elisa的抗體有哪些類型

• ELISA的類型
  ELISA可用於測定抗原，也可用於測定抗體。在這種測定方法中有三個必要的試劑：
  （1）固相的抗菌素原或抗體，即"免疫吸附劑"（immunosorbent）；（2）酶標記的抗原
  或抗體，稱為"結合物"（conjugate）；（3）酶反應的底物。根據試劑的來源和標本的情
  況以及檢測的具體條件，可設計出各種不同類型的檢測方法。用於臨床檢驗的ELISA主要
  有以下幾種類型：

• 2.2.1 雙抗體夾心法測抗原

• 雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，操作步驟如下：
  1） 將特異性抗體與固相載體聯結，形成固相抗體。洗滌除去未結合的抗體及雜質。
  2） 加受檢標本，保溫反應。標本中的抗原與固相抗體結合，形成固相抗原抗體復合物。
  洗滌除去其他未結合物質。
  3） 加酶標抗體，保溫反應。固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合
  的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢抗原的量相關。
  4） 加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產物。通過比色，測知標本中抗原的量。
  在臨床檢驗中，此法適用於檢驗各種蛋白質等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、
  AFP、hCG等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用於包被固相載體和制備酶結合
  物而建立此法。如抗體的來源為抗血清，包被和酶標用的抗體最好分別取自不同種屬的動
  物。如應用單克隆抗體，一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗，分別用於包被固相
  載體和制備酶結合物。這種雙位點夾心法具有很高的特異性，而且可以將受檢標本和酶標
  抗體一起保溫反應，作一步檢測。
  在一步法測定中，當標本中受檢抗原的含量很高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標
  抗體結合，而不再形成"夾心復合物"。類同於沉澱反應中抗原過剩的後帶現象，此時反應
  後顯色的吸光值（位於抗原過剩帶上）與標准曲線（位於抗體過剩帶上）某一抗原濃度的
  吸光值相同（參見1.3.2，圖1-4），如按常法測讀，所得結果將低於實際的含量，這種現
  象被稱為鉤狀效應（hook effect），因為標准曲線到達高峰後呈鉤狀彎落。鉤狀效應嚴重
  時，反應甚至可不顯色而出現假陰性結果。因此在使用一步法試劑測定標本中含量可異常
  增高的物質（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）時，應注意可測范圍的最高值。用
  高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應。
  假使在被測分子的不同位點上含有多個相同的決定簇，例如HBsAg的a決定簇，也可
  用針對此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結合物。但在HBsAg的檢測中應注意亞型
  問題，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4個亞型，雖然每種亞型均有相同的a決定簇的反應
  性，這也是用單抗作夾心法應注意的問題。
  雙抗體夾心法測抗原的另一注意點是類風濕因子（RF）的干擾。RF是一種自身抗
  體，多為IgM型，能和多種動物IgG的Fc段結合。用作雙抗體夾心法檢測的血清標本中如含
  有RF，它可充當抗原成份，同時與固相抗體和酶標抗體結合，表現出假陽性反應。採用
  F（ab"）或Fab片段作酶結合物的試劑，由於去除了Fc段，從而消除RF的干擾。雙抗體
  夾心法ELISA試劑是否受RF的影響，已被列為這類試劑的一項考核指標（參見6.2）。
  雙抗體夾心法適用於測定二價或二價以上的大分子抗原，但不適用於測定半抗原及小
  分子單價抗原，因其不能形成兩位點夾心。

• 2.2.2 雙抗原夾心法測抗體
  反應模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進行包被和制備酶結合物，以檢測相應
  的抗體。與間接法測抗體的不同之處為以酶標抗原代替酶標抗抗體。此法中受檢標本不需
  稀釋，可直接用於測定，因此其敏感度相對高於間接法。乙肝標志物中抗HBs的檢測常采
  用本法。本法關鍵在於酶標抗原的制備，應根據抗原結構的不同，尋找合適的標記方法。

• 2.2.3 間接法測抗體

• 間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗
  體）以檢測與固相抗原結合的受檢抗體，故稱為間接法（見圖2-3）。操作步驟如下：
  1）將特異性抗原與固相載體聯結，形成固相抗原。洗滌除去未結合的抗原及雜質。
  2）加稀釋的受檢血清，保溫反應。血清中的特異抗體與固相抗原結合，形成固相抗原抗
  體復合物。經洗滌後，固相載體上只留下特異性抗體，血清中的其他成份在洗滌過程
  中被洗去。
  3）加酶標抗抗體。可用酶標抗人Ig以檢測總抗體，但一般多用酶標抗人IgG檢測IgG抗
  體。固相免疫復合物中的抗體與酶標抗體抗體結合，從而間接地標記上酶。洗滌後，
  固相載體上的酶量與標本中受檢抗體的量正相關。
  4）加底物顯色
  本法主要用於對病原體抗體的檢測而進行傳染病的診斷。間接法的優點是只要變換包
  被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。
  間接法成功的關鍵在於抗原的純度。雖然有時用粗提抗原包被也能取得實際有效的結
  果，但應盡可能予以純化，以提高試驗的特異性。特別應注意除去能與一般健康人血清發
  生反應的雜質，例如以E.Coli為工程酶的重組抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能與受過
  E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗體發生反應。抗原中也不能含有與酶標抗人Ig反應的物
  質，例如來自人血漿或人體組織的抗原，如不將其中的Ig去除，試驗中也發生假陽性反
  應。另外如抗原中含有無關蛋白，也會因竟爭吸附而影響包被效果。
  間接法中另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性。病人血清中受檢的
  特異性IgG只佔總IgG中的一小部分。IgG的吸附性很強，非特異IgG可直接吸附到固相載體
  上，有時也可吸附到包被抗原的表面。因此在間接法中，抗原包被後一般用無關蛋白質
  （例如牛血清蛋白）再包被一次，以封閉（blocking）固相上的空餘間隙。另外，在檢
  測過程中標本須先行稀釋（1:40~1:200），以避免過高的陰性本底影響結果的判斷。

• 2.2.4 競爭法測抗體

• 當抗原材料中的干擾物質不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特
  異性抗體。其原理為標本中的抗體和一定量的酶標抗體競爭與固相抗原結合。標本中抗體
  量越多，結合在固相上的酶標抗體愈少，因此陽性反應呈色淺於陰性反應。如抗原為高純
  度的，可直接包被固相。如抗原中會有干擾物質，直接包被不易成功，可採用捕獲包被
  法，即先包被與固相抗原相應的抗體，然後加入抗原，形成固相抗原。洗滌除去抗原中的
  雜質，然後再加標本和酶標抗體進行競爭結合反應。競爭法測抗體有多種模式，可將標本
  和酶標抗體與固相抗原競爭結合，抗HBc ELISA一般採用此法。另一種模式為將標本
  與抗原一起加入到固相抗體中進行競爭結合，洗滌後再加入酶標抗體，與結合在固相上的
  抗原反應。抗HBe的檢測一般採用此法。

• 2.2.5 競爭法測抗原
  小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的位點，因此不能用雙抗體夾心法
  進行測定，可以採用競爭法模式。其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相
  抗體結合。標本中抗原量含量愈多，結合在固相上的酶標抗原愈少，最後的顯色也愈淺。
  小分子激素、葯物等ELISA測定多用此法。

• 2.2.6 捕獲包被法測抗體

• IgM抗體的檢測用於傳染病的早期診斷(early diagnosis)中。間接法ELISA一般僅適用於檢測總抗體或
  IgG抗體。如用抗原包被的間接法直接測定IgM抗體，因標本中一般同時存在較高濃度的
  IgG抗體，後者將競爭結合固相抗原而使一部份IgM抗體不能結合到固相上。因此如用抗人
  IgM作為二抗，間接測定IgM抗體，必須先將標本用A蛋白或抗IgG抗體處理，以除去IgG的
  干擾。在臨床檢驗中測定抗體IgM時多採用捕獲包被法。先用抗人IgM抗體包被固相，以捕
  獲血清標本中的IgM（其中包括針對抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM）。然後加入
  抗原，此抗原僅與特異性IgM相結合。繼而加酶標記針對抗原的特異性抗體。再與底物作
  用，呈色即與標本中的IgM成正相關。此法常用於病毒性感染的早期診斷(early diagnosis)。甲型肝炎病毒
  （HAV）抗體的檢測模式見圖2-7。
  類風濕因子（RF）同樣能幹擾捕獲包被法測定IgM抗體，導致假陽性反應。因此中和
  IgG的間接法近來頗受青睞，用這類試劑檢測抗CMV IgGM和抗弓形蟲IgM抗體已獲成功。

• 2.2.7 ABS-ELISA法
  ABS為親和素(avidin)生物素(biotin)系統(system)的略語。親和素是一種糖蛋白，分子
  量60000，每個分子由4個能和生物素結合的亞基組成。生物素為小分子化合物，分子量
  244。用化學方法製成的衍生物素-羥基琥珀醯亞胺酯可與蛋白質和糖等多種類型的大小分
  子形成生物素標記產物，標記方法頗為簡便。生物素與親和素的結合具有很強的特異性，
  其親和力較抗原抗體反應大得多，兩者一經結合就極為穩定。由於一個親和素可與4個生
  物素分子結合，因此如把ABS與ELISA法可分為酶標記親和素-生物素（LAB）法和橋聯親
  和素-生物素（ABC）法兩種類型。兩者均以生物素標記的抗體（或抗原）代替原ELISA系
  統中的酶標抗體（抗原）。在LAB中，固相生物素先與不標記的親和素反應，然後再加酶
  標記的生物素以進一步提高敏感度。在早期，親和素從蛋清中提取，這種卵親和素為鹼性
  糖蛋白，與聚苯乙烯載體的吸附性很強，用於ELISA中可使本底增高。從鏈黴菌中提取的
  鏈霉親和素則無此缺點，在ELISA應用中有替代前者的趨勢。由於ABS-ELISA較普通
  ELISA多用了兩種試劑，增加了操作步驟，在臨床檢驗中ABS-ELISA應用不多。