研究dna時用的什麼散射方法

Ⅰ 什麼叫DNA衍射圖譜

經過學習得知皮毛，與大家分享。
用X射線照射DNA分子，觀察射線在照相底片上產生的點子（衍射花樣），計算點子的分散角度等（每一點子的分散角度代表DNA分子的一個原子的位置或若干原子團的位置）推測分子排列。
最關鍵的第51號圖譜是下圖，1952年5月拍攝。

照片中心X射線反射（使X射線底片變黑）的圖象是交叉的，說明它是螺旋形的，頂部和底部最濃黑的部分，說明嘌呤鹼和嘧啶鹼垂直於螺旋軸，每隔3.4埃規律出現一對。

對A型DNA、B型DNA拍了好多張X射線衍射圖譜，這兩張是截面的，也有絲狀（鏈形態的），可以得到34埃的數據。富蘭克林還發現在翻轉180度之後看起來還是一樣，沃森與克里克在得到這一信息後，意識到兩條鏈是反向的。
在得到51號圖時，還得到的了一些數據。
1953年2月24日富蘭克林經過計算分析得出雙股螺旋的結論，而沃森與克里克則是嘗試以雙螺旋模型與這些數據信息吻合。當時自然雜志同時發表了三篇論文，另二篇是威爾金斯的和富蘭克林與藍道夫的。

解讀DNA晶體X射線衍射圖譜，要用到很復雜的數學計算。

X射線衍射原理： 1912年勞埃等人根據理論預見，並用實驗證實了X射線與晶體相遇時能發生衍射現象，證明了X射線具有電磁波的性質，成為X射線衍射學的第一個里程碑。當一束單色X射線入射到晶體時，由於晶體是由原子規則排列成的晶胞組成，這些規則排列的原子間距離與入射X射線波長有相同數量級，故由不同原子散射的X射線相互干涉，在某些特殊方向上產生強X射線衍射，衍射線在空間分布的方位和強度，與晶體結構密切相關。這就是X射線衍射的基本原理 。

Ⅱ DNA與蛋白質相互作用的研究方法有哪些

研究蛋白質與DNA相互作用的主要方法
一、引言
在許多的細胞生命活動中,例如DNA復制、mRNA轉錄與修飾以及病毒的感染等都涉及到DNA與蛋白質之間的相互作用的問題.
重組DNA技術的發展,人們已分離到了許多重要的基因.現在的關鍵問題是需要揭示環境因子及發育信號究竟是如何控制基因的轉錄活性.為此需要：
a、鑒定分析參與基因表達調控的DNA元件；
b、分離並鑒定這些順式元件特異性結合的蛋白質因子；
這些問題的研究都涉及到DNA與蛋白質之間的相互作用.
研究DNA-蛋白質相互作用的實驗方法主要包括：
a、凝膠阻滯實驗； b、DNase 1 足跡實驗；
c、甲基化干擾實驗； d、體內足跡實驗； f、拉下實驗.
二、凝膠阻滯實驗
1、概念：
凝膠阻滯實驗（Gel retardation assay）,要叫做DNA遷移率變動試驗（DNA mobility shift assay）或條帶阻滯實驗（Band retardation assay）是在八十年代初期出現的用於在體外研究DNA與蛋白質相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術.
2、原理：
在凝膠電泳中,由於電場的作用,裸露的DNA分子向正電極移動距離的大小是同其分子量的對數成反比.如果某種DNA分子結合上一種特殊的蛋白質,那麼由於分子量的加大它在凝膠中的遷移作用便會受到阻滯,於是朝正極移動的距離也就相應的縮短,因而在凝膠中出現滯後的條帶,這就是凝膠阻滯實驗的基本原理.
3、過程:
1)\x09首先制備細胞蛋白質提取物（理論上其中含有某種特殊的轉錄因子）
2)\x09用放射性同位素標記待檢測的DNA片段（含有轉錄因子的結合位點）
3)\x09這種被標記的探針DNA同細胞蛋白質提取物一起進行溫育,於是產生DNA-蛋白質復合物
4)\x09在控制使DNA-蛋白質保持結合狀態的條件下,進行非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳
5)\x09最後進行放射自顯影,分析電泳結果
4、實驗結果的分析：
a、如果有放射性標記的條帶都集中於凝膠的底部,這就表明在細胞提取物中不存在可以同探針DNA相互結合的轉錄因子蛋白質；
b、如果在凝膠的頂部出現放射性標記的條帶,這就表明細胞提取物存在可與探針DNA結合的轉錄因子蛋白質.
5、DNA競爭實驗：
DNA競爭實驗（DNA competitive assay）的具體做法如下：
在DNA-蛋白質結合的反應體系中加入了超量的非標記的競爭DNA（competitor DNA）,如果它同探針DNA結合的是同一種轉錄因子蛋白質,那麼由於競爭DNA與探針DNA相比是極大超量的,這樣絕大部分轉錄因子蛋白質都會被競爭結合掉,而使探針DNA仍然處於自由的非結合狀態,可以在電泳凝膠的放射自顯影圖片上就不會出現阻滯的條帶；
如果反應體系中加入的競爭DNA並不能同探針DNA競爭結合同一種轉錄因子,結果在電泳凝膠中的放射自顯影圖片上就會出現阻滯的條帶.
6、應用：
a、凝膠阻滯實驗可以用於鑒定在特殊類型細胞蛋白質提取物中,是否存在能同某一特定的DNA（含有轉錄因子結合位點）結合的轉錄因子蛋白質；
b、DNA競爭實驗可以用來檢測轉錄因子蛋白質同DNA結合的精確序列部位；
c、通過競爭DNA中轉錄因子結合位點的鹼基突變可以研究此種突變競爭性能及其轉錄因子結合作用的影響；
d、也可以利用DNA同特定轉錄因子的結合作用通過親和層析來分離特定的轉錄因子.
三、足跡實驗
1、定義:
足跡實驗（foot-printing assay）,是一種用來檢測被特定轉錄因子蛋白質特異性結合的DNA序列的位置及其核苷酸序列結構的專門實驗方法.
2、原理：
當DNA分子中的某一區段同特異的轉錄因子結合之後便可以得到保護而免受DNaseI 酶的切割作用,而不會產生出相應的切割分子,結果在凝膠電泳放射性自顯影圖片上便出現了一個空白區,俗稱為「足跡」.
3過程：
將待檢測的雙鏈DNA分子在體外用32P作5『末端標記,並用適當的限制性內切酶切出其中的一個末端,於是便得到了一條單鏈末端標記的雙鏈DNA
在體外同細胞蛋白質提取物（細胞核提取物也可以）混合,形成DNA-蛋白質復合體
在反應混合物中加入少量的DNase I,並控制用量使之達到平均每條DNA鏈,只發生一次磷酸二酯鍵的斷裂：
a、如果蛋白質提取物中不存在與DNA結合的特定蛋白質,使DNase I消化之後,便會產生出距離放射性標記末端1個核苷酸,2個核苷酸,3個核苷酸------等等一系列前後長度均相差一個核苷酸的不間斷的連續的DNA片段梯度群體；
b、如果DNA分子同蛋白質提取物中的某種轉錄因子結合,被結合部位的DNA就可以得到保護免受DNase I酶的降解作用；
除去蛋白,加樣在20%序列膠上進行電泳分離,實驗分兩組:
a、實驗組：DNA+蛋白質混合物
b、對照組：只有DNA,未與蛋白質提取物進行溫育
最後進行放射性自顯影,分析實驗結果.
4、結果判斷:
實驗組凝膠電泳顯示的序列,出現空白的區域表明是轉錄因子蛋白質結合部；與對照組序列比較,便可以得出蛋白質結合部位的DNA區段相應的核苷酸序列.
5、其他的足跡實驗方法：
除了DNase1足跡試驗之外,目前還發展出了若干種其他類型的足跡實驗,例如：
a、\x09自由羥基足跡實驗；b、菲咯啉銅足跡實驗；c、DMS(硫酸二甲酯)足跡實驗
DMS(硫酸二甲酯)足跡實驗的原理
DMS能夠使DNA分子中裸露的鳥嘌呤（G）殘基甲基化,而六氫吡啶又會對甲基化的G殘基作特異性的化學切割.如果DNA分子中某一區段同轉錄因子結合,就可以避免發生G殘基的甲基化而免受六氫吡啶的切割作用.
四、甲基化干擾實驗
1、概念：
甲基化干擾實驗（Methylation interference assay）是根據DMS（硫酸二甲酯）能夠使DNA分子中裸露的鳥嘌呤（G）殘基甲基化,而六氫吡啶又會對甲基化的G殘基作特異性的化學切割這一原理設計的另一種研究蛋白質同DNA相互作用的實驗方法.
應用這種技術可以檢測靶DNA中G殘基的優先甲基化,對爾後的蛋白質結合作用究竟會有什麼效應,從而更加詳細的揭示出DNA與蛋白質相互作用的模式.
2、實驗步驟：
用DMS處理靶DNA使之局部甲基化（平均每條DNA只發生一個G鹼基甲基化作用）
同細胞蛋白質提取物一起進行溫育,促進使DNA與蛋白質的結合
進行凝膠電泳形成兩種靶DNA條帶：
a、\x09其一沒有同蛋白質結合的DNA正常電泳條帶
b、其二同特異蛋白質結合而呈現滯後的DNA電泳條帶
將這兩種DNA電泳條帶分別從凝膠中切出,並用六氫吡啶進行切割,結果為：
a、甲基化的G殘基被切割:因為轉錄因子蛋白質只能夠同未發生甲基化的正常的結合位點結合,所以在轉錄因子DNA結合位點序列中的G殘基如果被DMS甲基化之後,轉錄因子就無法同其結合位點（順式元件）發生結合作用,從而使得結合位點中的G殘基同樣也要被六氫吡啶切割；
b、不具有甲基化G殘基的靶DNA 序列則不會被切割
將結合蛋白質的DNA條帶和不結合蛋白質的DNA條帶,經六氫吡啶切割作用之後,再進行凝膠電泳
作放射自顯影,讀片並分析結果
3、結果判斷：
a、同轉錄因子蛋白質結合的靶DNA序列,經六氫吡啶切割之後,電泳分離呈現兩條帶,有一個空白區
b、不同轉錄因子蛋白質結合的靶DNA序列,經六氫吡啶切割後,電泳分離呈現三條帶,沒有空白區域的出現.
4、應用：
a、甲基化干擾實驗可以用來研究轉錄因子與DNA結合位點中的G殘基之間的聯系；
b、是足跡實驗的一種有效的補充手段,可以鑒定足跡實驗中DNA與蛋白質相互作用的精確位置
5、缺點：
DMS只能使DNA序列中的G和A殘基甲基化,而不能使T和C殘基甲基化.
五、體內足跡實驗
上面討論的三種研究轉錄因子與DNA相互作用的方法,有一個共同的不足之處在於它們是在體外進行的實驗,因此人們就會考慮這些實驗結果是否能夠反映細胞內發生的真實生命過程,即細胞內發生的真實的DNA與蛋白質的相互作用情況.
為了解答這個問題,科學家就設計出了一種體內足跡試驗（in vivo foot-printing assay）,該方法可以看做是體外DMS足跡實驗的一個變種.
1、原理：
體內足跡試驗的原理原則上同體外DMS足跡實驗無本質差別,即
a、DMS能夠使G殘基甲基化；
b、六氫吡啶能特異的切割甲基化的G殘基；
c、同特異轉錄因子蛋白質結合的識別序列中的G殘基由於受到蛋白質的保護而不會被DMS甲基化,於是不會被六氫吡啶切割；
d、同對照的裸露的DNA形成的序列梯作比較,就會發現活細胞DNA形成的序列梯中缺少G殘基沒有被切割的相應條帶.
2、過程：
用有限數量的化學試劑DMS處理完整的游離細胞,使滲透到胞內的DMS濃度恰好導致天然染色體DNA的G殘基發生甲基化
對這些經過DMS處理的細胞提取DNA,並在體外加入六氫吡啶作消化反應
PCR擴增後作凝膠電泳分析,因為在體外實驗中用的是克隆的DNA片段其數量足夠,而在體內足跡實驗中用的是從染色體DNA中分離獲得的任何一種特異的DNA,其數量是微不足道的,所以需要經PCR擴增以獲得足夠數量的特異DNA
放射自顯影,讀片並記錄讀片的結果
3、結果判斷：
a、能夠同轉錄因子蛋白質結合的DNA區段其中G殘基受到保護因而不會被DMS甲基化避免了六氫吡啶的切割作用；
b、體外裸露的DNA分子上,G殘基被DMS甲基化而被六氫吡啶切割.
六、拉下實驗（Pull-down assay）
拉下實驗又叫做蛋白質體外結合實驗（binding assay in vitro）,是一種在試管中檢測蛋白質之間相互作用的方法.其基本原理是將某種小肽（例如生物素、6-His標簽以及谷胱甘肽轉移酶等）的編碼基因與誘餌蛋白的編碼基因重組,表達為融合蛋白.分離純化融合蛋白並與磁珠結合,使之固相化之後,再與表達目的蛋白的細胞提取物混合保溫適當時間,例如在4℃下保溫過夜,使目標蛋白同已經固定在磁珠表面的融合蛋白中的誘餌蛋白充分的結合.離心收集與固定化的融合蛋白（即與磁珠相互結合的融合蛋白）中的誘餌蛋白相結合的目的蛋白,經過煮沸處理使目的蛋白與誘餌蛋白相脫離從而從固相支持物（例如磁珠）上脫離下來,收集樣品,再與目標蛋白的抗體作Western blotting分析,以檢測出與誘餌蛋白的目標的目標蛋白.
染色質免疫共沉澱技術（ChIP） 真核生物的基因組DNA以染色質的形式存在.因此,研究蛋白質與DNA在染色質環境下的相互作用是闡明真核生物基因表達機制的基本途徑.染色質免疫沉澱技術（chromatin immunoprecipitation assay, CHIP）是目前唯一研究體內DNA與蛋白質相互作用的方法.它的基本原理是在活細胞狀態下固定蛋白質－DNA復合物,並將其隨機切斷為一定長度范圍內的染色質小片段,然後通過免疫學方法沉澱此復合體,特異性地富集目的蛋白結合的DNA片段,通過對目的片斷的純化與檢測,從而獲得蛋白質與DNA相互作用的信息.CHIP不僅可以檢測體內反式因子與DNA的動態作用,還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達的關系.而且,CHIP與其他方法的結合,擴大了其應用范圍：CHIP與基因晶元相結合建立的CHIP-on-chip方法已廣泛用於特定反式因子靶基因的高通量篩選；CHIP與體內足跡法相結合,用於尋找反式因子的體內結合位點；RNA-CHIP用於研究RNA在基因表達調控中的作用.由此可見,隨著CHIP的進一步完善,它必將會在基因表達調控研究中發揮越來越重要的作用. 染色體免疫共沉澱（Chromatin Immunoprecipitation,ChIP）是基於體內分析發展起來的方法,也稱結合位點分析法,在過去十年已經成為表觀遺傳信息研究的主要方法.這項技術幫助研究者判斷在細胞核中基因組的某一特定位置會出現何種組蛋白修飾.ChIP不僅可以檢測體內反式因子與DNA的動態作用,還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達的關系.近年來,這種技術得到不斷的發展和完善.採用結合微陣列技術在染色體基因表達調控區域檢查染色體活性,是深入分析癌症、心血管疾病以及中央神經系統紊亂等疾病的主要代謝通路的一種非常有效的工具. 它的原理是在保持組蛋白和DNA聯合的同時,通過運用對應於一個特定組蛋白標記的生物抗體,染色質被切成很小的片斷,並沉澱下來.IP是利用抗原蛋白質和抗體的特異性結合以及細菌蛋白質的「prorein A」特異性地結合到免疫球蛋白的FC片段的現象活用開發出來的方法.目前多用精製的prorein A預先結合固化在argarose的beads上,使之與含有抗原的溶液及抗體反應後,beads上的prorein A就能吸附抗原達到精製的目的.實驗最需要注意點就是抗體的性質.抗體不同和抗原結合能力也不同,免染能結合未必能用在IP反應.建議仔細檢查抗體的說明書.特別是多抗的特異性是問題.其次,要注意溶解抗原的緩沖液的性質.多數的抗原是細胞構成的蛋白,特別是骨架蛋白,緩沖液必須要使其溶解.為此,必須使用含有強界面活性劑的緩沖液,盡管它有可能影響一部分抗原抗體的結合.另一面,如用弱界面活性劑溶解細胞,就不能充分溶解細胞蛋白.即便溶解也產生與其它的蛋白結合的結果,抗原決定族被封閉,影響與抗體的結合,即使IP成功,也是很多蛋白與抗體共沉的悲慘結果.再次,為防止蛋白的分解,修飾,溶解抗原的緩沖液必須加蛋白每抑制劑,低溫下進行實驗.每次實驗之前,首先考慮抗體/緩沖液的比例.抗體過少就不能檢出抗原,過多則就不能沉降在beads上,殘存在上清.緩沖劑太少則不能溶解抗原,過多則抗原被稀釋. ChIP的一般流程： 甲醛處理細胞---收集細胞,超聲破碎---加入目的蛋白的抗體,與靶蛋白-DNA復合物相互結合---加入ProteinA,結合抗體-靶蛋白-DNA復合物,並沉澱---對沉澱下來的復合物進行清洗,除去一些非特異性結合---洗脫,得到富集的靶蛋白-DNA復合物---解交聯,純化富集的DNA-片斷---PCR分析. 在PCR分析這一塊,比較傳統的做法是半定量-PCR.但是現在隨著熒光定量PCR的普及,大家也越來越傾向於Q-PCR了.此外還有一些由ChIP衍生出來的方法.例如RIP（其實就是用ChIP的方法研究細胞內蛋白與RNA的相互結合,具體方法和ChIP差不多,只是實驗過程中要注意防止RNase,最後分析的時候需要先將RNA逆轉錄成為cDNA）；還有ChIP-chip（其實就是ChIP富集得到的DNA-片段,拿去做晶元分析,做法在ChIP的基礎上有所改變,不同的公司有不同的做法,要根據公司的要求來准備樣品）.
GST沉澱實驗（GST-pull down實驗）（細胞外蛋白質相互作用）5-11
上面提到,用酵母雙雜交方法篩選到的蛋白需要作進一步的鑒定.鑒定方法之一就是 GST
沉澱實驗.GST 沉澱實驗主要是用來證明蛋白質胞外的相互作用.蛋白質在胞外的相互作用排除了酵母細胞內復雜體系的干擾,比較直接地檢驗蛋白質分子之間存在的物理的相互作用.同酵母雙雜交實驗一樣,運用此法也可以證明相互作用的蛋白分子中是否有參與調節作用的結構域或 motif.GST\x09沉澱實驗原理就是,把你要研究的蛋白基因亞克隆到帶有GST（谷胱甘肽轉移酶）基因的原核表達載體中,並在細菌中表達 GST 融合蛋白（GST-X）.把 GST 融合蛋白掛到帶有 GST 地物的 Sepharose beads 上,然後把另一種蛋（Y）白加入其中.由於蛋白質之間的結合作用,形成了這樣的復合物：GST-X----Y.這一復合物與固體支持物（Sepharose beads）又
結合在一起,可以被沉澱下來.此法又有在不同情況下的具體應用,以下一一作介紹.
（1）\x09GST 融合蛋白與重組蛋白的相互作用
GST 融合蛋白是在原核表達的,所以沒有經過過多的象真核細胞內具有的蛋白修飾作用.
所以另一種用來檢驗相互作用的蛋白也可以用原核表達出來,也就是所謂的重組蛋白.當 GST融合蛋白把重組蛋白沉澱下來,然後用重組蛋白的抗體作 Western blotting 檢測.
（2） GST 融合蛋白與體外 TNT 系統合成的多肽或蛋白的相互作用
用來檢驗與GST融合蛋白相互作用的蛋白或多肽也可以用TNT體外蛋白合成體系進行合
成,並且還可以在要合成的蛋白或多肽N端或C端加上便於檢測的標簽.GST融合蛋白沉澱下來的蛋白或多肽可以用該蛋白或多肽的抗體或標簽抗體進行Western blotting檢測.如果蛋白之間結合力非常弱,用Western blotting檢測方法難以檢測到,你可以在TNT體外合成時給蛋白進行同位素（S32）標記.這樣沉澱下來的蛋白進行放射自顯影,檢測靈敏度將極大提高.
（3） GST 融合蛋白與細胞內源性蛋白質的相互作用
GST融合蛋白還可以把細胞提取物中有相互作用的內源性蛋白質沉澱下來.如果內源性蛋
白含量低或結合力弱,可以採用脈沖法使細胞在某一段時間內合成的所有蛋白質都標記上放射性同位素（S32）,然後提取細胞總蛋白與GST融合蛋白溫育.GST融合蛋白沉澱下的帶有放射性標記的蛋白跑電泳,進行放射自顯影.
（4） GST 融合蛋白與細胞內瞬時表達的蛋白質的相互作用
當內源性蛋白質含量低,並且有可能影響蛋白質的相互作用,也可以把該蛋白的基因轉染
到靶細胞內進行過表達,然後檢驗蛋白質相互作用.
（5） GST 融合蛋白與待測蛋白的相互作用有可能與待測蛋白的磷酸化狀態有關在進行 GST 沉澱實驗時,有時也會遇到比較復雜的情況,具體情況具體分析,分別對待.比如,兩個蛋白質之間發生相互作用時有可能與蛋白磷酸化狀態有關.或者蛋白首先被磷酸化後方能產生相互作用,或者磷酸化的蛋白必需脫磷酸化後才能產生相互作用.如果你確實在你
的實驗中發現了其中一種情況,這將是一個非常有意義的結果.
3,\x09免疫共沉澱（co-immunoprecipitation ）（細胞內蛋白質相互作用）9-16
免疫共沉澱技術用來證明蛋白質在胞內是否有相互作用.一般來說,兩種蛋白在細胞內發
生相互作用時會形成兩種蛋白的復合物,這樣就可以先用一種蛋白的抗體把免疫復合物沉澱下來,然後用另一種蛋白的抗體進行 Western blotting 檢測,看兩種蛋白之間是否確實形成免疫復合物,並能與 protein A/G agarose 一起沉澱下來.免疫共沉澱原理簡單,但技術極為復雜.因為細胞內蛋白種類繁多,制約因素多.如果兩種蛋白之間可以發生相互作用,並不是這兩種蛋白所有分子都參與結合作用,也可能只有極少部分蛋白分子結合在一起（足以滿足細胞功能需要）.在提取細胞蛋白時,如果條件不當就會破壞兩種相互作用蛋白形成的復合物的穩定性,使得免疫共沉澱實驗失敗.如果兩種蛋白在細胞內的結合力確實非常弱,那麼免疫共沉澱也難以成功.如果知道發生相互作用的兩個蛋白都是胞核蛋白,那麼可以通過提取核蛋白,再進行免疫共沉澱實驗,這樣會大大減低背景的干擾.關於兩種蛋白質之間胞內的相互作用,有時確實無法用免疫共沉澱實驗證明.
（1） 細胞內過表達蛋白的免疫共沉澱
證明蛋白質胞內相互作用時,可以選擇一個高效瞬時過表達系統（至於這一系統是否有內
源性靶蛋白無關緊要）.一般採取 COS 細胞作為真核表達株.把兩種蛋白基因共轉染到 COS 細胞內進行表達.由於人為進行大量表達,所以在胞內兩種蛋白形成相互作用的復合物的量也相應增多.如果你手頭沒有這兩種蛋白的抗體,可以把這兩種蛋白的一端分別加上標簽以融合蛋白形式表達,然後用商業化的抗標簽抗體進行免疫共沉澱和 Western blotting 檢測.
（2） 細胞內源性蛋白的免疫共沉澱
把兩種蛋白共轉染到 COS 細胞內進行過表達,進行免疫共沉澱實驗,相對容易成功,但是
這一結果畢竟具有人工性,不能代表生理條件下真實的蛋白質相互作用.要想克服這一弱點,
可以做內源性的免疫共沉澱實驗.這一技術要求極高,難度極大,但也最有說服力.因為細胞內內源性蛋白含量低,結合在一起形成復合物的量更低,難以檢測.首先要證明所選擇的細胞系是否具有這兩種內源性的蛋白.另外,用於免疫沉澱和 Western blotting 檢測的抗體要好.細胞裂解、收集以及免疫沉澱時時條件要溫和,以保持蛋白復合物的天然結構.
（3） 組織內蛋白的免疫共沉澱
在體外可以大量培養細胞,然後制備細胞提取物,做內源性免疫共沉澱.由此可以推廣到做
組織內免疫共沉澱.取動物組織（腦、肝、脾等）,切碎,勻漿,提取組織蛋白,進行免疫共沉澱實驗.這一結果代表活體中蛋白質相互作用.
4,\x09蛋白質細胞內定位實驗17-22
另一種經常用來檢驗蛋白質相互作用的方法是蛋白質細胞內定位技術.此法較為直觀,可
以看到兩種有相互作用的蛋白質在細胞內的分布（膜上、胞漿、胞核或其它細胞器等等）以及共定位的部位（在膜上共定位、在胞漿中某一部位或核內共定位等等）.有時相互作用的蛋白由於細胞內某種功能的需要結合在一起時,使得兩種蛋白的分布發生變化.比如,某種蛋白也許在核內,當它與另一種具有穿梭功能的蛋白結合時,有可能被轉運到胞漿中.這種情況的共定位則較為典型.在進行蛋白質共定位
（1） 利用有色熒光蛋白標記技術進行蛋白定位研究
此法也可稱為活細胞定位.把兩種具有相互作用的蛋白分別克隆到帶有兩種不同顏色熒光
蛋白（綠色熒光蛋白或紅色熒光蛋白）的載體中,共轉染到功能細胞中（一般選用 COS7 細胞）表達帶有熒光的融合蛋白.這樣,相互作用的兩種蛋白就被標上不同的熒光,可以在細胞內用熒光顯微鏡直接觀測.在進行精確細胞定位或共定位時,必須用共聚焦熒光顯微鏡觀測.因為共聚焦熒光顯微鏡（相當於醫院給病人診斷的 CT）觀測的是細胞內一個切面上的顏色.如果在一個切面上在同一區域看到兩種顏色,就提示這兩種蛋白在該區域內有相互作用.普通熒光顯微鏡看到的是一個立體圖象,無法確定蛋白質共定位現象.在進行定位或共定位同時,也可以對細胞核進行染色.這樣,在細胞中就有三種顏色.細胞核的顯色幫助你確定共定位發生的位置.上面介紹的活細胞定位,其優點是表達的熒光蛋白熒光強,沒有背景,觀測方便.但缺點
是相互作用的蛋白由於標上熒光蛋白,實際上是兩個融合蛋白.融合蛋白的定位結果或共定位結果是否與天然蛋白分布一致,有待於進一步確定.而利用免疫熒游標記技術可以避免這一缺點.
（2） 利用雙色或多色染色的免疫熒光技術進行蛋白定位研究
免疫熒光的原理是,首先把細胞進行固定,然後用待檢測靶蛋白的抗體（一抗）與細胞內
靶蛋白進行免疫反應,再用熒光素（如 FITC 和 TRITC 等）標記的二抗與一抗進行反應.這樣就在細胞內形成免疫復合物（靶蛋白----一抗---二抗）,結果靶蛋白被標上顏色,然後可用共聚焦熒光顯微鏡觀測定位與共定位結果.
免疫熒光技術最大優點就是可用來檢測細胞內源性蛋白的定位及相互作用.當然也可以對
靶細胞進行轉染表達目的蛋白,然後標記目的蛋白進行觀測.免疫熒光技術的缺點是熒光相對較弱並且背景較高,結果受到干擾,所以這項技術不好掌握.為了結果的可靠性,要求嚴格設計陽性對照與陰性對照.
（3） 細胞內蛋白動態定位
有時細胞在正常狀態下,有相互作用的蛋白在胞內可能暫時分開,沒有共定位現象發生.
但是在某一個特定情況下,如細胞受到外界刺激時,細胞本身會產生應急反應,這時暫時分離的蛋白有可能發生相互作用,並產生共定位現象.所以在進行共定位研究時,可根據具體情況具體分析,必要時觀測細胞內蛋白動態定位結果.

Ⅲ DNA實驗室常用的DNA提取方法有哪些

提取DNA主要有SDS和CTAB法，其實提取效果的好壞主要看提取的對象是什麼樣的材料，在提取之前一定要好好分析材料的特性，然後在設計實驗步驟。
一）CTAB法
CTAB是一種去污劑，可溶解細胞膜，它能與核酸形成復合物，在高鹽溶液中（0.7
mol/L
NaCl）是可溶的，當降低溶液鹽濃度到一定程度（0.3
mol/L
NaCl）時，從溶液中沉澱，通過離心就可將CTAB與核酸的復合物同蛋白質、多糖類物質分開，然後將CTAB與核酸的復合物沉澱溶解於高鹽溶液，再加入乙醇使核酸沉澱，CTAB能溶解於乙醇。
（二）SDS法
利用高濃度的SDS，在較高溫度（55—65℃）條件下裂解細胞，使染色體離析，蛋白質變性，釋放出核酸，然後採用提高鹽濃度及降低溫度的做法使蛋白質及多糖雜質沉澱（最常用的是加入5M的KAc於冰上保溫，在低溫條件下KAc與蛋白質及多糖結合成不溶物），離心除去沉澱後，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反復抽提後用乙醇沉澱水相中的DNA。
以下是在提取熱帶水果DNA時設計的兩種不同方法步驟，對比起來CTAB法好，在禾本科植物效果差不多！
1、
CTAB法
1）
在所需量的CTAB抽提液中加入2－巰基乙醇，使終濃度達2％（v/v）。將此溶液預熱至65℃。
對於每克新鮮的葉組織大約需要4ml的2－ME/CTAB抽提液。
2）
用液氮（－196℃）或乾冰（－78℃）冷卻粉碎器/勻漿器，將0.5
g植物組織粉碎成細粉，然後將組織轉移到2.0
ml離心管。
3）
加入800
µl預熱的2－Me/CTAB，混合使之充分濕潤，於65℃溫育20
min，不時顛倒混勻。
4）
待冷至室溫後，加入800
µl氯仿/異戊醇（24：1），顛倒混勻至溶液呈乳濁狀----但不要振盪。25℃，10000
rpm離心10
min。
5）
上清（~700
µl）轉移至另一干凈的離心管中，加入5
µl
RNaseA貯液，37℃溫育30
min。
6）
加入700
µl氯仿/異戊醇，顛倒混勻，25℃，10000
rpm離心10
min。
7）
上清（~600
µl）轉移至另一干凈的1.5
ml離心管中，加入600
µl異丙醇，顛倒混勻，室溫或-20℃放置20
min。
8）
25℃，12000
rpm，離心10
min，收集沉澱。
9）
去上清，加1
ml70%乙醇洗滌沉澱兩次。（25℃，12000
rpm，離心10
min）
10）涼干DNA，溶於50
µl
ddH2O，4℃保存備用。
2、
SDS法
①
將0.3
g植物材料於液氮速凍，然後在研缽中將其磨碎，將粉末轉至2
ml離心管中。
②
加入1.2
ml預熱至65℃的提取緩沖液（其中加入3
μl
β—巰基乙醇，增加DNA的穩定性），置65℃水浴中放置30分鍾，不時顛倒混勻。。
③
加入0.45
ml
5M的醋酸鉀，混勻，冰浴20分鍾，在10000
rpm離心20
min。需要的話，Miracloth紗布過濾除去沉澱，上清液轉入另一離心管中。
④
加入等體積氯仿：異戊醇（24：1），輕輕顛倒混勻，12000
rpm離心15
min。
⑤
轉移上清液到另一新離心管中，加5
μl
RNaseA貯液，37℃溫育30
min。
⑥
加入等體積氯仿：異戊醇（24：1），輕輕顛倒混勻，12000
rpm離心15
min。
⑦
轉移上清液到另一新離心管中，加入0.7V異丙醇，輕輕顛倒混勻，-20℃放置30分鍾沉澱核酸。
⑧
25℃，12000
rpm，離心10
min，收集沉澱。
⑨
棄上清，70％乙醇洗兩次。
⑩
涼干DNA，溶於50
µl
ddH2O，4℃保存備用。

Ⅳ DNA衍射圖譜的衍射

衍射的結果是產生明暗相間的衍射花紋，代表著衍射方向（角度）和強度。根據衍射花紋可以反過來推測光源和光珊的情況。 為了使光能產生明顯的偏向，必須使「光柵間隔」具有與光的波長相同的數量級。用於可見光譜的光柵每毫米要刻有約500到500條線 。 1913年，勞厄想到，如果晶體中的原子排列是有規則的，那麼晶體可以當作是X射線的三維衍射光柵。X射線波長的數量級是10-8cm ,這與固體中的原子間距大致相同。果然試驗取得了成功，這就是最早的X射線衍射。 顯然，在X射線一定的情況下，根據衍射的花樣可以分析晶體的性質。但為此必須事先建立X射線衍射的方向和強度與晶體結構之間的對應關系X射線纖維衍射技術 生物大分子中的螺旋分子,如角蛋白、膠原及遺傳物質 DNA（脫氧核糖核酸）等大多難以結晶（寡聚核苷酸例外），但能聚集成為纖維。平行排列這些纖維也能使 X射線發生衍射。這些螺旋分子的外形相似於彈簧，有可測量的螺距和半徑。每圈螺旋包含數目相同的單元。因此它們的長軸方向具有周期結構的性質。它們的衍射花樣呈X形,且在水平方向衍射點按層線排列。由X形的斜度及層線的間距可以計算螺距和半徑。由中心至垂直最遠衍射弧的距離可以計算單元間沿螺軸方向的距離。由於這些大分子的徑向側鏈處於無序狀態,它們對X射線僅產生背景散射。因此纖維衍射技術無法測定大分子中原子的空間位置。但是如果結合考慮這些大分子的化學組份及立體化學等性質，也可由衍射花樣推斷該分子的結構模型。DNA分子的右手雙螺旋模型(圖3)的建立是個典型的例子。這是由美國生物學家J.D.沃森和英國物理學家F.H.C.克里克於1953年提出來的。當時已知 DNA分子由多聚脫氧核苷酸鏈組成，並已知它是一種遺傳物質。他們由纖維衍射的強度和花樣（圖4）推斷該分子為雙螺旋結構，並算出它的螺距為34埃，每圈螺旋包含10個由氫鍵連接的嘌呤－嘧啶鹼基對，螺旋半徑為10埃。這個模型很好地解釋了 DNA分子作為遺傳物質的自我復制機制。

Ⅳ 研究DNA結構與功能的方法有哪些

生命科學與化學有著密不可分的聯系，我甚至認為生命科學就是用化學來解釋生命。然而，僅僅知道一種物質的化學成分是遠遠不夠的，結構才是其功能的基礎。我們知道，構成元素相同的物質，由於結構不同，可能在功能上就相去甚遠：左、右旋光物質的不同生理作用就是一個很好的例子。但是，我們不能孤立地來闡述生命科學與結構化學的關系，也就是說不能把生命科學看成一塊，再把結構化學看成另一塊，然後再說明他們間千絲萬縷的聯系；我認為，結構化學與生命科學是揉合在一起的，很多結構化學家在生命科學領域就有不凡的建樹。鮑林就是以化學向生物學滲透的先驅者，他不僅進行了大分子研究，還對鐮刀形細胞貧血分子病和大腦化學進行了大量的研究。然而我認為，最能體現結構化學與生命科學揉合一體的歷史故事，就是鮑林與沃森和克里克關於DNA結構之爭。在這個過程中，我們無法定義他們到底是化學家還是生物學家。而且，結構化學的知識不僅為他們建立模型提供了理論支持，而且在幫助他們判別真理與謬誤、為他們的結論提供事實支持等方面起到了至關重要的作用。從這個故事中我們不僅可以看出，解決DNA結構這個世界性的生命科學課題，是許多化學家、物理學家、晶體學家、生化學家共同努力的結果，而且能受到許多在科學研究上的啟發。在多學科交叉滲透的今天，我們更不能僅僅只重視專業課的學習，必須同時汲取其他學科的知識，為將來的研究打下基礎。

在一九二四年以前，沒有一個人真正懂得DNA的重要性。但就在那一年，科學家羅伯特·福爾根發現了一種方法能將DNA染成淡紫色。在這種方法的幫助下，科學家們發現DNA僅存在於細胞核中。到了一九三一年，科學家喬基姆·哈默林用實驗證明了植物長成什麼樣子完全取決於細胞核。隨後的一切實驗事實都表明，發出遺傳信息的正是細胞核里的DNA。

於是，在美洲和歐、亞、非三洲各試驗室里的人們都開始研究這個問題。在美國，著名的化學家萊納斯·鮑林開始了對DNA的研究。在劍橋大學的卡文迪斯實驗室里，英國人弗朗西斯·克里克和美國人詹姆斯·沃森也著手進行對奇異的DNA結構的探索。這是一場用結構化學來解釋生命科學的競賽，也是「一個遠方傳奇大力士被兩個無名小卒砍倒的故事」。雖然我們已經知道了這場競賽的結果，但我認為，這一探索的過程更讓人留下深刻的印象。我將雙方的研究進行了一些對比，確實從中學到了一些東西，希望和大家一起探討。

一、雙方的開端：

當時的鮑林已經是化學界的「權威」，他致力於蛋白質的研究。1951年夏天，鮑林開始深入研究有關DNA的材料，並常常找人討論。他認為，與蛋白質相比，弄清DNA的結構不會很難，「這算不上一個最為緊迫的問題」。DNA在重量上是染色體的一種重要成分，但蛋白質也一樣。大多數學者認為，蛋白質部分最有可能包含著遺傳的信息。相對而言，DNA似乎就比較簡單了，它很可能只是一種結構性的成分，只是用來幫助染色體折疊和打開的。鮑林就這樣認為。在1952年初，幾乎所有重要的遺傳學學者都持這一種觀點。我們可以看看後來鮑林自己的話：「我以前就知道DNA是一種遺傳物質的論點，然而我沒有接受這一論點。你們知道，那時我正熱衷於蛋白質的研究，我認為蛋白質最有可能是遺傳物質，不可能是核酸 當然，核酸也有作用。在我著述的有關核酸的文字材料中，我總會提到核蛋白的概念。當時，我考慮得更多的是蛋白質，而不是核酸。」雖然如此，鮑林還是著手研究DNA的結構。此時，他需要清晰的DNA X光照片，他曾先後寫信給相片持有者物理學家威爾金斯（英國）及其上司，但均遭拒絕。1951年11月，《美國化學學會學報》上刊登了一篇論述DNA結構的文章。鮑林據其深厚的結構化學基礎，一下子就看出這篇文章的結果是錯的；同時，此事刺激了他開始思考DNA是如何構築起來的問題。鮑林設想，如果鹼基朝外，那麼螺旋的內核就應當是由磷酸堆積起來的。磷酸聚集在中間，鹼基朝外，這與X射線的資料是「吻合」的。在鮑林的頭腦中，DNA結構的問題就已經轉化為如何將磷酸堆積在一起的問題了。我們現在知道，鮑林的這一開端是錯的，並最終使他敗給了沃森和克里克。另外還必須一提的是，鮑林對DNA研究總是被各種事務打斷，使他曾多次中斷自己的思路。是否是因為鮑林沒能看到威爾金斯的相片而導致他的失敗呢？暫且不回答這個問題，我們先來看看沃森和克里克是如何開始的。
在戰爭期間，克里克原來是從事武器方面研究的。後來他決定研究生物。於是他到劍橋大學學習分子學。至於沃森，他本來就一直在研究DNA。他到劍橋大學是為了對此作進一步的研究。他們都是熱心探索的人。「沃·克組合」相對於鮑林的地位可以說是「一個在天，一個在地」，他們並沒有引起人們多大的重視，也沒有引起鮑林的注意。他們就憑著一股勁和對目標的執著追求開始了他們的研究。還必須提到的是另外兩位對他們的成功起著至關重要的作用的人：一位是上文提到的物理學家威爾金斯，另一位是青年女晶體學家羅莎琳德·富蘭克林。他們拍出了非常漂亮的DNA X光照片，不僅啟發了沃森和克里克，而且為他們的發現提供了佐證。
鮑林頗為自信，感到自己有能力解開DNA之謎。唯一的問題是，會不會有人搶先取得勝果，但是，他不會把這一點真正放在心上。他認為威爾金斯和富蘭克林兩人(更不用說沃森和克里克了)，沒有誰有足夠的化學基礎對鮑林產生嚴重的威脅。

二、對對手的不同看法：

鮑林是自負的，他不相信有人能夠在他之前發現DNA的結構，特別是他認為沒有人有他那樣深厚的化學功底。他「知道」， 沃森是一個好學生，但因成績還不夠突出，因而他到加州理工學院當研究生的申請未被批准。克里克已經三十五六歲了，還在讀研究生，年齡是大了一些。況且，卡迪文斯實驗室的科學家們至今尚未在任何競賽中打敗過鮑林。甚至有人認為，沃森和克里克看上去就像是一對「雜耍演員」。
而沃森和克里克則不同。對於年方19的沃森來說，鮑林是一位值得仿效的榜樣。在盧瓦蒙會議上，沃森就是圍聚在鮑林身邊的人之一，他十分用心地聽了鮑林的講話。克里克開始並不是鮑林的崇拜者，他是鮑林的競爭對手，因為鮑林曾用阿爾法螺旋表明他們的一篇關於蛋白質結構的論文漏洞百出，讓克里克承受了由此而來的屈辱。從此，克里克借鑒了鮑林的研究方法。說實話，他們對鮑林這位怪傑都極為佩服。更重要的是，他們兩人都互相傾慕，他們可謂是天生一對。相對於鮑林來說，沃森和克里克謙遜多了。

三、研究方法及進程：

鮑林首先想到DNA的結構可能是螺旋型，因為其他構型與他所看到和掌握的照片資料不相符合。但他認為，DNA是由三條鏈互相纏繞在一起，磷酸處於中央的位置。之後，他的工作重點就聚焦於找出磷酸分子在中央合理的排列方法。雖然他知道自己提出的構型不能完美地符合實驗測算得出的數據和X光衍射照片，但他認為這些都只是細枝末節的東西，就像他發現蛋白質阿爾法螺旋一樣 開始的時候也有難以解釋的數據，他大膽地將之忽略，而其後的事實證明了他這種策略是明智的。另外，鮑林有些急於求成，他希望能夠盡快地發表相關文章，搶在其他科學家之前，宣布自己再次成功地解決了又一世界性的難題。於是，他很快地發表了他「發現」的DNA結構。
鮑林將自己的論文也寄給了沃森和克里克。他們兩人虛驚了一場，因為他們發現，鮑林設想的這種構型是他們最初設想的結果，當時他們將這一結果給晶體學家富蘭克林看的時候，被她以充足的論據否認，因為水容量問題與這種構型嚴重不符。也正是因為這次錯誤，他們兩人被認為不適合研究DNA構型問題，被拆散到不同的課題組，從事別的研究。但沃森和克里克並沒有就此放棄，他們仍然私下堅持不懈地進行研究和探索。他們在研究方法上一直就有共識：與其推導出復雜的數學模型，直接而又明確地解釋X光的衍射結果，還不如藉助化學常識構築結構的一個模型。正如沃森所說，他們決定「仿效鮑林，並在他本人發起的這場競賽中將他擊敗」。富蘭克林的批評已經促使他們將磷酸放到了分子的外側；又受到奧地利生物化學家切加夫的啟示，得知內側各對鹼基之間存在著一一對應的關系。他們開始設想，在螺旋中，嘌呤和嘧啶以某種方式挨次排列在分子中心下部。之後，他們看到了富蘭克林最新的DNA照片，不僅使他們確認了DNA是一種螺旋，而且他們得到了幾個主要參數。由此，他們開始著手製造模型，通過不懈的努力，最終獲得了成功。

可以看出，不論是成功者還是失敗者，他們都用了一種結構化學中重要的研究方法 建模。同時，沃森和克里克不僅受到了多學科領域的科學家的啟示和幫助，而且他們自己都承認，他們的研究方法來源於偉大的化學家 鮑林。由此可見，生命科學是集多學科，特別是化學的大成所在，他與化學，乃至物理、數學的揉合可見一斑。

為什麼鮑林會失敗？

鮑林有著深厚的化學知識作為自己研究的基礎。照常理而言，成功的應該是他，但他為什麼輸給了沃森和克里克呢？鮑林輸在浮躁和自負上。他急於求成，因為DNA是當時最大的課題，他要去搶占這一高地。他沒有把研究的准備工作做好就想碰碰自己的運氣了。同時，他順利解決阿爾法螺旋給他套上了成功的光環，他的確是世界上解決巨分子結構的最佳人選，但他也從此染上了自負的惡習，他以為自己不再需要做別人需要做的那些研究的准備工作了。他過於相信自己的直覺和運氣，結果輸掉了這場大比拼。

沃森和克里克為什麼會成功？

其實這個問題的答案從前面的敘述中都可以看出，但我覺得最重要的一點是不懈的思索與踏實的努力。克里克不就是在因頭疼而不得不休息，卻又忍不住開始計算時找到了有關DNA結構的答案嗎？他們雖然被拆散到兩個不同的研究小組，但仍然踏實地合作與工作，正是這樣，幸運之神才降臨在他們的頭上。另外還有一點，就是他們沒有放過看似微不足道的東西。奧地利生物化學家切加夫將鹼基一一對應的關系同樣告訴了鮑林，但卻沒有得到鮑林的重視，而沃森和克里克並沒有放過這一點，而最終獲得啟發，找到了DNA的正確結構。

結構化學與生命科學的揉合已無需多說，我相信這種相互融合在將來會愈演愈烈。最後我想總結的是有關鮑林的研究方法，畢竟沃森與克里克的成功也來源於此，相信它對所有的科研者都會有所幫助：

http://www.paper800.com/N66/DD172F26/
參考資料：

Ⅵ DNA衍射圖譜的介紹

衍射又稱為繞射，光線照射到物體邊沿後通過散射繼續在空間發射的現象。如果採用單色平行光，則衍射後將產生干涉結果。相干波在空間某處相遇後，因位相不同，相互之間產生干涉作用，引起相互加強或減弱的物理現象。 衍射的條件，一是相干波（點光源發出的波），二是光柵。

Ⅶ 沃森和克里克研究DNA分子結構時，運用了什麼方法

答案是：
演繹法
歸納法

Ⅷ DNA測序可以採用哪些手段，並闡述各自的原理

這位是搞分子生物學的嗎?
DNA測序的方法有很多種. 目前最常見的是雙脫氧終止法了. 在測序用的緩沖液中含有四種dNTP及聚合酶. 測序時分成四個反應, 每個反應除上述成分外分別加入2,3-雙脫氧的A, C, G, T核苷三磷酸(稱為ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP), 然後進行聚合反應. 在第一個反應物中, ddATP會隨機地代替dATP參加反應一旦ddATP加入了新合成的DNA鏈, 由於其3位的羥基變成了氫, 所以不能繼續延伸. 所以第一個反應中所產生的DNA鏈都是到A就終止了; 同理第二個反應產生的都是以C結尾的; 第三個反應的都以G結尾, 第四個反應的都以T結尾, 電泳後就可以讀出序列了. 也許這樣說你不一定明白. 舉一個例子, 假如有一個DNA, 互補序列是GATCCGAT, 我們試著做一下:
在第一個反應中由於含有dNTP+ddATP, 所以遇到G, T, C三個鹼基時沒什麼問題, 但遇到A時, 摻入的可能是dATP或ddATP, 比如已合成到G, 下一個如果參與反應的是ddATP則終止, 產生一個僅有2個核苷酸的序列: GA, 否則繼續延伸, 可以產生序列GATCCG, 又到了下一個A了. 同樣有兩種情況, 如果是ddATP摻入, 則產生的序列是GATCCGA, 延伸終止, 否則可以繼續延伸, 產生GATCCGAT.
所以在第一個反應系統中產生的都是以A結尾的片段:
GA, GATCCGA,
同理在第二個反應中產生的都是以C結尾的片段:
GATC, GATCC,
在第三個反應中產生的都是以G結尾的片段:
G, GATCCG
在第四個反應中產生的都是以T結尾的片段:
GAT, GATCCGAT,
電泳時按分子量大小排列, A反應的片段長度為2, 7; C反應的為4, 5; G反應的為1, 6; T反應的為3, 8, 四個反應的產物分別電泳, 結果為

8 7 6 5 4 3 2 1

A | |
C | |
G | |
T | |

我們可以從右向左讀, 為GATCCGAT, 至此, 測序完成(上面這個圖在網路知道中顯示不正常, 因為網路知道的網頁用的是比例字體, 你如果想看它, 拷貝到記事本中, 用等寬的字體來看).

Ⅸ 沃森和克里克研究DNA分子結構時、運用了什麼方法

演繹 歸納法