實時熒光定量pcr常見數據分析方法

『壹』 實時熒光定量PCR的結果該怎樣分析

1、如果有標准曲線，按照標准曲線計算；

2、一般都是相對量，則用delta delta CT方法來計算；

3、引物或探針降解：可通過PAGE電泳檢測其完整性；

4、模板量不足：對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起；

5、看CT值是分析熒光定量PCR最直觀的一個數據，CT值一般在35左右就失去參考價值了，平時我們實驗室用BIODAI-PCR熒光定量法測得的擴增曲線的起跳值基本在30左右。

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PVR的循環參數：

1、預變性；

模板DNA完全變性與PCR酶的完全激活對PCR能否成功至關重要，加熱時間參考試劑說明書。

2、變性步驟；

循環中一般95℃，30秒足以使各種靶DNA序列完全變性，可能的情況下可縮短該步驟時間。變性時間過長損害酶活性，過短靶序列變性不徹底，易造成擴增失敗。

3、引物退火；

退火溫度需要從多方面去決定，一般根據引物的Tm值為參考，根據擴增的長度適當下調作為退火溫度。然後在此次實驗基礎上做出預估。退火溫度對PCR的特異性有較大影響。

4、引物延伸；

引物延伸一般在72℃進行（Taq酶最適溫度）。但在擴增長度較短且退火溫度較高時，本步驟可省略延伸時間隨擴增片段長短而定，一般推薦在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生設定為1min/kbp。

5、循環數；

大多數PCR含25-35循環，過多易產生非特異擴增。

6、最後延伸；

在最後一個循環後，反應在72℃維持10-30分鍾．使引物延伸完全，並使單鏈產物退火成雙鏈。

『貳』 實時定量PCR的結果是怎樣分析的

1、如果有標准曲線，按照標准曲線計算。

2、一般都是相對量，則用delta delta CT方法來計算。

3、舉例如下：對照組基因A的CT值為20， 內參（比如βactin)CT值15。實驗組基因A CT值18，內參CT值14。

4、首先算加樣量：delta CT=15-14=1。2的1次方是2。也就是說實驗組的加樣量是對照組的2倍。基因A: delta CT=20-18=2。2的2次方是4。也就是說基因A的量在實驗組是對照組的4倍。但是由於加樣量是2倍，所以4處以2=2，最後的相對量是2倍。

5、幾點注意：必須確定擴增的特異性，只有相同目標的CT值才能相減（擴增效率有可能不同），2的某次方只是理論值，實際擴增效率低於2，最好不用Syber Green。

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PCR原理：

1、PCR技術的基本原理類似於DNA的天然復制過程，其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。

2、PCR由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構成：

①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間後，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；

②模板DNA與引物的退火（復性）：模板DNA經加熱變性成單鏈後，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；

③引物的延伸：DNA模板-引物結合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按鹼基互補配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈。每完成一個循環需2～4分鍾，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

參考資料來源：網路--PCR反應

『叄』 實時定量PCR的結果分析

如果有標准曲線，按照標准曲線計算。一般都是相對量。則用delta delta CT方法來計算。舉例如下：對照組基因A的CT值為20， 內參（比如βactin)CT值15。實驗組基因A CT值18，內參CT值14。首先算加樣量：delta CT=15-14=1。2的1次方是2。也就是說實驗組的加樣量是對照組的2倍。基因A: delta CT=20-18=2。2的2次方是4。也就是說基因A的量在實驗組是對照組的4倍。但是由於加樣量是2倍，所以4處以2=2，最後的相對量是2倍。幾點注意： 1。必須確定擴增的特異性 2。 只有相同目標的CT值才能相減（擴增效率有可能不同） 3。 2的某次方只是理論值，實際擴增效率低於2。 4。 最好不用Syber Green

『肆』 實時定量PCR的結果是怎樣分析的

的 探討實時熒光定量PCR不同結果分析模式對檢測結果的影響。方法 用Line—Gene FQD-33A型熒光定量PCR檢測系統檢測本院門診和病房乙肝病人血清HBV DNA77份，分別用最大二階導數法和樣點擬合法進行結果分析。結果 發現兩種分析方法的總體相關性較好(r=0．978)。但HBV DNA拷貝數含量<10^5時，兩種模式的相關性差(r=0．706)，此時，最大二階導數法得出的數值要比樣點擬合法低(t=2．61，P<0．05)，且易出現假陰性結果。結論 雖然樣點擬合法步驟較多，但其結果更可靠，因此進行結果分析時，建議使用樣點擬合法。而且當樣本中HBV DNA拷貝數<10^5時只能使用樣點擬合法進行結果分析。

『伍』 熒光定量pcr常用的是什麼方法

熒光定量pcr常用的是什麼方法
用已知濃度的DNA樣本（通常是質粒）梯度稀釋成一系列的樣本。做實驗的時候，這些標准品和待測樣本加在同樣一塊96孔盤的不同孔內。一起做PCR。

標准品的熒光強度和已知的濃度作圖，可以得到一條標准曲線。而待測樣本的熒光強度測出以後，就可以在標准曲線上算出樣本濃度了。

『陸』 您好，我想問一下實時熒光定量pcr的數據分析！

用2-△△ ct法算的話，應如何算？

假設檢測A基因，CT分別為（這里記住CT越大，表明相對含量越低）
普通組/Test1：28
實驗組1/Test2：29
實驗組2/Test3：30
這時候要設對照了，假設Test1為對照組（普通組），當然是以普通組為對照
那麼，相對含量為：
普通組/Test1：1
實驗組1/Test2：2^-(28-29)=1/2=0.5
實驗組2/Test3：2^-(28-30)=1/4=0.25

A基因在實驗組1和實驗組2中的表達量，分別下降2倍和4倍！

所以，就出來啦，結果

對於每組不同部位的比較的話，將其中一個處理為1進行比較嗎？
如
實驗組1
Testis
Brain
Liver
Muscle
可以把任何一個作為1，作為對照，但是要在figure 的legend中註明出來，說清楚就好了！

那對於三個組中的同一部位的比較的話，難道也要將其中一組處理為1嗎？

是的，可以，如
Brain
普通組/Test1
實驗組1/Test2
實驗組2/Test3

就以普通組/Test1，為對照組，設為1，其他為相對含量，也要在figure 的legend中註明出來說清楚！

『柒』 熒光定量pcr數據分析的方法有幾種

公式如上所列，僅供參考

『捌』 絕對熒光定量PCR的數據分析

現在最常用的兩種分析實時定量PCR
實驗數據的方法是絕對定量和相對定量。絕對定量通過標准曲線計算起始模板的拷貝數；相對定量方法則是比較經過處理的樣品和未經處理的樣品目標轉錄本之間的表達差異。2－△△CT方法是實時定量PCR
實驗中分析基因表達相對變化的一種簡便方法，即相對定量的一種簡便方法。本文介紹了該方法的推導，假設及其應用。另外，在本文中我們還介紹了兩種2－△△CT衍生方法的推導和應用，它們在實時定量
PCR
數據分析中可能會被用到。
希望對您有所幫助