核酸产物分析方法

Ⅰ PCR产物的检测方法有哪些

PCR产物的检测方法：

1. 琼脂糖凝胶电泳

   这是实验室最常用的方法，简便易行，只需少量DNA即可进行实验。其原理是不同大小的DNA分子通过琼脂糖凝胶时，由于泳动速度不同而被分离，经溴化乙锭（EB）染色，在紫外光照射下DNA分子发出荧光而判定其分子的大小。

   用于电泳检测PCR产物的琼脂糖浓度常为1%—2%，应该使用纯度高的电泳纯级琼脂糖，这种琼脂糖已除去了荧光抑制剂及核酸酶等杂质。

   （1）制胶

   琼脂糖凝胶厚度约为3~5mm。过薄则加样孔样品会溢出来，过厚观察时荧光穿透不强以至有些小片段DNA带型不易分辨。如配制2%凝胶100ml，称取琼脂糖2g于三角瓶中，加入100ml0.5×TBE液，微波炉加热2-5min，使琼脂糖完全溶解（注意不要暴沸），置室温等温度下降至60℃时，加入终浓度0.5μg/ml的EB液，充分混匀后倒板（注意排除气体）。

   （2）加样和电泳

   上样时一般取PCR反应液5~10μl，加入3μl溴酚兰液，充分混匀，加入凝胶加样孔中。电泳仪可用一般稳压可调中压电泳仪，电泳工作液为0.5×TBE液，接通电源，使样品由负极向正极移动。60-100V恒压电泳约30-60分钟。

   （3）检测

   将凝胶板放在紫外透射仪的石英玻璃台上进行检测，DNA产物与荧光染料EB形成橙黄色荧光复合物。观察各泳道是否有橙黄色荧光带出现，并与扩增时所设的阳性对照比较，判断阳性或阴性结果。也可在电泳时以标准分子量作对照，判断其扩增片段是否与设计的大小相一致。

2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳

   聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖凝胶电泳繁琐，但在引物纯化、PCR扩增指纹图、多重PCR扩增、PCR扩增产物的酶切限制性长度多态性分析时常用到。

   聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨DNA片段的有效范围：

   (1)制胶
   

   在两块制胶玻璃板中间放上垫片，放上制胶架，拧紧制胶螺丝夹紧玻璃板。

   制备适量合适浓度的凝胶，使之略多于胶板。制备100μl体积凝胶的配制方法见下表。

   不同浓度（%）聚丙酰胺凝胶的制法：

   
   

   

   
   

   在加入TEMED和10%过硫酸铵后，立即混匀，倒入放置45℃角的玻璃板内，完全注满（注意不要有气泡），迅速将玻璃板放置水平位置。立即放成型梳子于腔顶并夹紧，待30-60分钟胶聚合后，取下胶板，放入电泳槽中固定。

   （2）加样和电泳

   上下槽中加入1×TBE电泳缓冲液，溢过加样孔，拔出梳子，排出加样孔中的气泡，将PCR产物或限制性内切酶消化产物2与1上样缓冲液混匀，用微量注射器加入加样孔底部，使样品在孔底成一层，两侧孔中加入标准分子量的DNAMarker。

   以2-10V/cm电压电泳，电泳时间足够长，使片断足以分开，待指示剂走到适宜位置时关闭电源，将胶片取出。

   （3）银染

   分开两块玻璃板，将凝胶片放入100ml银染固定液中振荡15min，双蒸水洗3次，每次2min，然后将凝胶片转入100ml0.2%的AgNO3中于摇床上染色约10min，吸去AgNO3液，用双蒸水洗3次，每次30s，加入100ml显色液约7-10min，待DNA带显示清除时，吸去显色液，加入固定液Na2CO3，静置2-3min，取出凝胶观察。

Ⅱ 核酸序列分析、蛋白质序列分析、基因表达分析、进化分析、非编码miRNA分析

核酸序列分析： 基因阅读框分析：使用工具如GENSCAN预测基因位置，分析从ATG起始密码子到终止密码子的蛋白质编码序列。 CpG岛分析：利用CpGplot等工具识别DNA序列中的CpG岛，这些区域通常与基因表达调控相关。 转录终止信号预测：通过softberry网站的polyah等软件预测mRNA 3’端的终止信号。 启动子区域预测：使用PromoterScan等工具确定启动子位置，这是基因表达调控的关键区域。 密码子偏好分析：采用CodonW软件分析不同密码子的使用频率，了解基因编码的偏好性。

蛋白质序列分析： 理化性质和一级结构分析：利用ExPASy和Protparam等工具分析蛋白质的分子量、等电点等理化性质，以及氨基酸序列组成。 信号肽预测：通过SignalP等工具预测蛋白质序列中的信号肽，了解蛋白质的亚细胞定位信息。 二级结构分析：使用Coils等工具分析蛋白质的卷曲螺旋等二级结构特征。 二级结构预测：采用Predictprotein等工具预测蛋白质的二级结构。 三维结构预测：利用SWISSMODEL等工具根据蛋白质序列预测其三维结构。

基因表达分析： 通常涉及对基因转录产物的定量分析，如使用qRTPCR等方法检测mRNA水平的变化，以及通过芯片或测序技术评估全基因组范围内的基因表达模式。

进化分析： 构建分子进化树：使用工具如MEGA等根据核酸或蛋白质序列的相似性构建进化树，了解物种间的亲缘关系和进化历程。 分子进化中性学说研究：探讨分子水平上的进化机制，如碱基替换速率、突变模式等。

非编码miRNA分析： miRNA特征分析：研究miRNA的基本特征，如长度、结构等。 合成过程与调控机理：探讨miRNA的合成途径，以及通过Ago2蛋白降解靶mRNA、阻断翻译等机制调控基因表达。 生理调节作用：分析miRNA在调控基因表达、参与多种生物学过程中的生理作用。 miRNA预测与靶基因分析：利用miRanda、Targetscan、RNAhybrid等工具预测miRNA，并通过分析miRbase数据库等信息预测特定miRNA的靶基因。

Ⅲ HIV核酸检测HIV核酸检测方法及程序

HIV核酸检测方法及程序

一、HIV核酸定性检测

1.1 方法和试剂

1.1.1 方法：HIV核酸定性检测采用商品化试剂盒或实验室自建方法，商品化试剂需严格遵循说明书操作。实验室自建方法如下：

(1) 使用逆转录PCR（RT-PCR）方法检测血浆或血清样品，建议第一轮PCR扩增使用RT-PCR一步法。血细胞或组织样品则使用PCR方法，一般采用扩增两轮的套式PCR方法。

(2) 设立阳性、阴性及空白对照，阳性对照含目的基因，阴性对照不含目的基因，与待测样品处理程序一致。阴性对照数量应根据实验样品数量设置，并分散放置。

1.1.2 试剂：PCR引物用于扩增HIV gag、pol、env、LTR等区域。进行RNA逆转录时可使用下游特异性引物或随机引物。引物设计可参考文献或自行设计，应广泛覆盖常见HIV流行毒株。抗污染试剂用于实验室自建检测方法。

1.2 扩增目的基因片段

1.2.1 样品采集和处理：收集样品并妥善处理，避免RNA降解。DNA保存于-20℃，RNA和需长期保存的DNA于-80℃。

1.2.2 核酸提取：使用硅胶柱离心、磁性硅胶颗粒分离或自动化仪器提取，注意保护RNA不被降解。

1.2.3 逆转录合成cDNA：使用商品化试剂，按说明书操作，确保RNA酶抑制剂、dTta等成分充分。

1.2.4 PCR扩增反应：使用商品化试剂，按说明书操作，确保dNTPs、DNA聚合酶、缓冲液和超纯水的量足。

1.3 扩增产物分析及结果报告

1.3.1 扩增产物分析：使用琼脂糖凝胶电泳法，与分子量标准比较，判断扩增片段是否在预期范围内。其他方法如限制性内切酶酶切分析、特异性探针杂交分析及DNA序列分析。

1.3.2 结果判定和报告：实验成立需同时满足阳性对照、阴性对照和双份平行样品一致的条件。HIV核酸检测阳性需重复采样复测，复测阳性判定为阳性，阴性则为不确定结果，需进一步检测。

二、HIV核酸定量检测

2.1 方法：主要基于靶核酸扩增RT-PCR和信号放大扩增方法。国内常用方法如NucliSens Esay Q HIV-1 v1.1、Amplicor Cobas等，其检测线性范围和国际单位关系各不相同。

2.2 试剂：使用注册批准的商品化试剂，严格遵循说明书操作。试剂包含RT-PCR扩增、信号放大扩增、基于核酸序列扩增（NASBA）等。

2.2.1 靶核酸扩增试剂和性能：NucliSens Esay Q HIV-1 v1.1、Amplicor HIV-1 Monitor v1.5等试剂，使用不同的设备和方法，如实时荧光探针分析法、微颗粒酶免疫分析法等，检测线性范围和国际单位关系有所不同。

2.2.2 信号放大扩增试剂和性能：Versant HIV-1 RNA 3.0.bDNA试剂盒，利用分枝状DNA多级信号放大原理，无需RNA纯化和PCR扩增步骤。

2.2.3 实时荧光定量PCR技术：实时荧光定量PCR技术在PCR反应体系中加入荧光基团，监测PCR进程，通过标准曲线定量分析样品。

三、集合核酸定性检测

3.1 样品集合程序：根据样品量计算集合数量，依次集合并检测，同时制备阴性及阳性集合外部质控品用于RT-PCR检测。

3.2 集合样品的检测和分解路线：使用商品化试剂，严格按照说明书进行检测，集合样品数量根据试剂方案调整。

四、婴幼儿HIV感染核酸检测

4.1 适用范围：未满18个月的HIV感染产妇所生婴幼儿。

4.2 检测程序及结果报告：在婴儿出生后6周采集第一份血样本检测，若阳性尽快采集第二份血样本，若两份均阳性诊断HIV感染。若第一份阴性，满3个月再次检测。满3个月再次检测阴性，视为未感染，满12个月后开始HIV抗体检测。

五、结论

以上概述了HIV核酸检测的定性及定量方法、集合检测以及婴幼儿HIV感染的早期诊断流程，确保了HIV感染的早期发现和及时治疗。

Ⅳ 核酸检测具体步骤

1、核酸提取使用硅胶柱离心、磁性硅胶颗粒分离方法以及自动化仪器等商品化试剂或设备并按说明书操作。提取RNA时应注意防止RNA降解。DNA应置于-20℃保存，RNA和需长期保存的DNA应置于-80℃保存。

2、逆转录合成cDNA。逆转录cDNA合成反应需使用逆转录引物、dNTPs、逆转录酶、RNA酶抑制剂、DTT、缓冲液和适量无RNA/DNA酶的超纯水以及RNA模板。在扩增仪或水浴箱中，在规定的温度和时间下进行逆转录反应。

3、PCR扩增反应PCR反应需使用引物、dNTPs、DNA聚合酶、缓冲液、和适量无RNA/DNA酶超纯水、以及模板。在扩增仪中，按照设定的程序进行扩增。使用二次扩增的套式PCR扩增方法。

4、扩增产物定性分析；扩增产物常用分析方法是琼脂糖凝胶电泳法，与分子量标准比较，判断扩增片段是否在预期的戚粗分子量范围内。其它扩增产物分析方法还有限制性内切酶酶切分析、特异性探针杂交分析以及DNA序列分析等。

5、结果判定和完成报告单：每一次检测需同时做两个阳性对照、两个阴性对照，只有阳性对照扩增出预期的片段、阴性对照没有扩增出任何片段、双份平行样品结果一致的情况下实验才成立，可以作出核酸阳性或阴性反应结果的判定。

(4)核酸产物分析方法扩展阅读：

检测新型冠状病毒特异序列的方法最常见的是荧光定量PCR。因PCR反应模板仅为DNA，因此在进行PCR反应前，应将新型冠状病毒核酸逆转录为DNA。在PCR反应体系中，

包含一对特异性引物以及一个Taqman探针，该探针为一段特异性寡核苷酸序列，两端分别标记了报告荧光基团和淬灭档仔态荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信行源号被淬灭基团吸收；

如反应体系存在靶序列，PCR反应时探针与模板结合，DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性将探针酶切降解，报告基团与淬灭基团分离，发出荧光。

每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子产生。荧光定量PCR仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数与病毒核酸浓度有关，病毒核酸浓度越高，Ct值越小。不同生产企业的产品会依据自身产品的性能确定本产品的阳性判断值。