适用于抗药性抗体的分析方法

1. 利用基因工程技术进行药物的研制与开发时，目的基因的鉴定方法有哪些其原理是什么

目的序列与载体DNA正确连接的效率、重组导入细胞的效率都不是百分之百的，因而最后生长繁殖出来的细胞并不同都带有目的序列。一般一个载体只携带某一段外源DNA，一个细胞只接受一个重组DNA分子。最后培养出来的细胞群中只有一部分、甚至只有很小一部分是含有目的序列的重组体（recombinant）。将目的重组体筛选出来就等于获得了目的序列的克隆，所以筛选(dcreening)是基因克隆的重要步骤。在构建载体，选择宿主细胞、设计分子克隆方案时都必须仔细考虑筛选的问题。以下就常用技术的基本原理加以介绍。
一、根据重组载体的标志作筛选
最常见的载体携带的标志是抗药性标志，如抗氨芐青霉素（anpr）、抗四环素(terr)、抗卡那霉素(kanr)等。当培养基中含有抗生素时，只有携带相应抗药性基因载体的细胞才能生存繁殖，这就把凡未能接受载体DNA的细胞全部筛除掉了。如果外源目的序列是插入在载体的抗药性基因中间使这抗药性基因失活，这个抗药性标志就会消失。例如质粒pBR322含有anpr、和terr两个抗药基因，若将目的序列插入terr基因序列中，转化大肠杆菌，让细菌放在含氨芐青霉素或四环素培养基中，凡未接受质粒DNA的细胞都不能生长；凡在含氨芐青霉素和四环素中都能生长的细菌是含有质粒pBR322的，但其pBR322未插入目的序列，凡在氨芐青霉素中能生长、而在四环素中不能生长的细菌就很可能是含有目的序列的重组质粒。 载体含有lacZ’的蓝白筛选法，近年更被广泛应用。例如将目的序列插入前面述及的质粒pUC19的多克隆位点，转化大肠杆菌，放入含氨芐青霉素、IPTG、X-gal的培养基中培养，凡能生长并呈白色的菌落，其细菌中就很可能含有插入目的序列的重组质粒，这样就很容易获得目的序列的克隆。 根据重组载体的标志来筛选，可以筛选去大量的非目的重组体，但还只是粗筛，例如细菌可能发生变异而引起抗药性的改变，却并不代表目的序列的插入，所以需要做进一步细致的筛选。
二、核酸杂交法
利用标记的核酸做探针与转化细胞的DNA进行分子杂交，可以直接筛选和鉴定目的序列克隆。常用的方法是将转化后生长的菌落复印到硝酸纤维膜上，用碱裂菌，菌落释放的DNA就吸附在膜上，再与标记的核酸探针温育杂交，核酸探针就结合在含有目的序列的菌落DNA上而不被洗脱。核酸探针可以用放射性核素标记，结合了放射性核酸探针的菌落集团可用放射性自显影（auroradiography）法指示出来，核酸探针也可以用非放射性物质标记，通常是经颜色呈现指示位置，这样就可以将含有目的序列的菌落挑选出来。
三、PCR法
PCR技术的出现给克隆的筛选增加了一个新手段。如果已知目的序列的长度和两端的序列，则可以设计合成一对引物，以转化细胞所得的DNA为模板进行扩增，若能得到预期长度的PCR产物，则该转化细胞就可能含有目的的序列。
四、免疫学方
利用特定抗体与目的基因表达产物特异性结合的作用进行筛选。此法不是直接筛选目的基因，而是通过与基因表达产物的反应指示含有目的基因的转化细胞，因而要求实验设计要使目的基因进入受体细胞后能够表达出其编码产物。抗体可用特定的酶常用过氧化物酶、碱性磷酸酶等标记，结合酶标抗体处，酶可催化特定的底物分解而呈现颜色，从而指示出含有目的的基因的细胞集落位置。免疫学方法特异性强、灵敏度高，适用于从大量转化细胞集合体中筛选很少几个含目的基因的细胞克隆。
五、DNA限制性内切酶图谱分析
这是在上述筛选后的进一步分析。目的序列插入载体会使载体DNA限制性酶图谱（restriction map）发生变化，例如一个长600bp的目的序列利用它两端的EooR I和SalI切后的粘末端连接插入pUC19的多克隆点，则重组质粒就增大为3.3kb，用Eoor I和SalI双酶切后会出现600bp和-2.7kb两个DNA片段，提取转化细菌的质粒DNA作酶切后做电泳观察其酶切图谱，就能分析得结果；如插入的目的序列中有其它限制性内切酶位点，也能在酶切电泳图谱上观察到。这就可以进一步鉴定重组体是不是所要的目的克隆。
六、核苷酸序列测定
所得到的目的序列或基因的克隆，都要用其核酸序列测定来最后鉴定。已知序列的核酸克隆要经序列测定确证所获得的克隆准确无误；未知序列的核酸克隆要测定序列才能确知其结构、推测其功能，用进一步的研究。因此核酸序列测定是分子克隆中必不可少的鉴定步骤。核酸序列测定的原理和方法在实验教材中有详细的叙述。

2. 酶联免疫吸附分析法主要有哪三种

双抗体夹心法

双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：

双抗体夹心法

一、将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。

二、加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。

三、加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。

四、加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。

根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。

在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步法检测。

在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成"夹心复合物"。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值相同，如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应（hook effect），因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时，应注意可测范围的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。

假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如HBsAg的a决定簇，也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在HBsAg的检测中应注意亚型问题，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型，显然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性，这也是用单抗作夹心法应注意的问题。

双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰。RF是一种自身抗体，多为IgM型，能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF，它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应。采用F（ab'）或Fab片段作酶结合物的试剂，由于去除了Fc段，从而可消除RF的干扰。双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响，已被列为这类试剂的一项考核指标（参见6.2）。

双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。

双抗原夹心法测抗体

反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。

双位点一步法

在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显着提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。

在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。

间接法测抗体

间接法

间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：

⑴将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。

⑵加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他抗体及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。

⑶加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体。

⑷加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。

本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。

间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性。特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质，例如以E.Coli为工程酶的重组抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能与受过E.Coli感染者血清中的抗E.Coli抗体发生反应。抗原中也不能含有与酶标抗人Ig反应的物质，例如来自人血浆或人体组织的抗原，如不将其中的Ig去除，试验中也发生假阳性反应。另外如抗原中含有无关蛋白，也会因竞争吸附而影响包被效果。

间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性抗体。病人血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一小部分。IgG的吸附性很强，非特异IgG可直接吸附到固相载体上，有时也可吸附到包被抗原的表面。因此在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封闭（blocking）固相上的空余间隙。另外，在检测过程中标本须先行稀释（1:40~1:200），以避免过高的阴性本底影响结果的判断。

竞争法

竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下：

⑴将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。

⑵待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。

⑶加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。一般情况，是通过方波伏安法，检测培养体系的峰电流，通过峰电流与抗原抗体的线性关系来最终确定体系的最终检测目标的浓度。

当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。如抗原为高纯度的，可直接包被固相。如抗原中会有干扰物质，直接包被不易成功，可采用捕获包被法，即先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原，形成固相抗原。洗涤除去抗原中的杂质，然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应。竞争法测抗体有多种模式，可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合，抗HBc ELISA一般采用此法。另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合，洗涤后再加入酶标抗体，与结合在固相上的抗原反应。抗HBe的检测一般采用此法。

捕获法

血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗体多用捕获法，先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下：

⑴将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。

⑵加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。

⑶加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。

⑷加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。

⑸加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。

3. 体内药物分析常用的分析方法有

药学专业知识（一）第六章生物药剂学，是研究药物吸收、分布、代谢与排泄过程，阐明药物制剂剂型因素，生物因素与药效关系。下面小编总结了药物在体内的各过程：

体内过程示意图
了解完药物在体内的过程示意图，接着我们来掌握执业药师考试中涉及的相关考点：

1. 需要掌握的几个概念

2. 药物的跨膜转运

【相关考题】

1.大部分口服药物的胃肠道中最主要的吸收部分是

A.胃

B.小肠

C.盲肠

D.结肠

E.直肠

2.借助载体或酶促系统，消耗机体能量，从膜的低浓度一侧向高浓度一侧转运的方式是

A.滤过

B.简单扩散

C.易化扩散

D.主动转运

E.膜动转运

答案：B D

4. 多肽和蛋白质类药物的分析方法

1.1生物检定法
由于蛋白多肽类药物多为有生物活性的物质,且生物活性不仅取决于药物的一级结构，与二 、三级结构亦密切相关，故生物检定法是研究该类药物动力学独特而必需的方法。生物检定 法 有两个目的，直接测定体液中药物浓度及鉴定标记药物的生物活性。其方法主要可分为两大 类。
1.1.1在体分析常规的有胰岛素的小鼠血糖法等，另外还有根据各 类蛋白多肽的生物活性 不同而建立的各异的方法，如根据IL-8可将大量中性粒细胞从骨中动员出的性质[1] 而建立 的IL-8动员中性粒细胞家兔体内实验。这类方法最直观地反映生物活性，但涉及整体动物 ，费时费力，灵敏度不高，变异较大。
1.1.2离体组织（细胞）分析如NGF刺激鸡背根神经节增长，缩宫素 的大鼠离体子宫法等。 随着分子生物学的发展，许多特异性强，灵敏度高的依赖细胞株被建立，细胞培养已是最常 用的方法。根据蛋白多肽与细胞相互作用的机理不同，具体的操作亦有多种。如细胞增殖法 （Proliferation assays）,快速灵敏,但特异性稍差; 抑制增殖法(Antiproliferation as s ays),检测系统简单,灵敏而专一; 减少细胞损伤法(Cytopathic effect rection assays ) [2],则是依据具有抗病毒活性的药物如干扰素，保护细胞不受病毒损伤, 方法直观 灵敏, 但 可能会受到多肽亚型的干扰。以上的方法都是以细胞数目的增减为量效指标，计数方法有直 接计数法和间接计数法，后者包括MTT法，同位素（3H,14C）掺入法 等。此外，还有根据蛋 白多肽与细胞间接作用进行检测，如与免疫检测联用的抗体诱导法[3]，结合酶反 应的酶诱 导分解法[4]等。总的说来，细胞培养法多具有灵敏特异，客观可靠的优点，但其 不足也显 而易见。首先，生物检定法无法定量失去活性的小代谢物，无法示踪它们的体内动态；其次 ，样品多存在于人或动物血清中，血清中内源物质的干扰以及可能存在的内源因子的交叉反 应，影响了方法的专属性；再者，启动生物过程常需阈量细胞因子从而降低了方法的灵敏度 ；依赖株细胞长期培养易发生变异而影响检测的特异性。
1.2免疫学方法
免疫学方法是利用蛋白多肽药物抗原决定簇部位的单克隆或多克隆抗体特异地识别被检药物 ，再以放射计数，比色等方法予以定量，即将特异的抗原抗体反应配以灵敏检测的方法。常 用的方法有三种。
1.2.1放射免疫法（Radioimmunoassays RIA）该法是被测药物（Ag ）,标记药物（多为125I-Ag）与抗体（Ab）的竞争性结合反应，方法的特异性 取决于抗原抗体的亲和力及标记药 物的纯度，与生物检定法相比，有简明，易于控制的优点。
1.2.2免疫放射定量法（Immunoradiometrec assays IRMA）该法中 被测药物依然是Ag，它 先与固定相上的Ab形成Ab∶Ag复合物，再与标记抗体125I-Ab结合，形成Ab∶Ag ∶125I-Ab夹心 状。由于Ag需有两个Ab来识别，这就大大增加了方法的特异性，是一灵敏而低变异的方法， 只是对标记抗体的纯度要求很高。
1.2.3酶联免疫法（Enzyme-linked immunosorbent assays ELISA）ELISA的原理与IRMA相 似，只是第二个抗体不是用碘标，而是用可以与底物发生显色反应的酶如HRP来标记，与上 述两法相比，ELISA具有使用寿命长，重复性好，无辐射源的优点，并且已有不少实验证明 ，它与生物检定法具有一定的量效关系[4]及相关性[5]，提示它可部分地 反映药物的生物活性。
免疫学方法的缺点在于它测定的是蛋白多肽的免疫活性而不是生物活性；不能同时测定代谢 物，且具有抗原决定簇的代谢片段可能增加结果误差；不同来源的抗体与相同的蛋白多肽反 应可能有较大的差别；还可能受到内源物质的干扰。但免疫法毕竟是一种迅速，灵敏，适于批处理的方法，已有数十种蛋白多肽被开发成能满足药物动力学研究的商品药盒。临床 药动学领域，免疫法已逐渐取代生物检定法。
1.3同位素标记示踪法
放射性同位素标记技术是研究蛋白多肽在生物体内处置的一种最常用的方法。所使用的同位 素有125I, 99mTc, 3H,14C, 35S 等，其中125I因比放射性高，半衰期适宜，标记制备简单 而最为常用。标记方法有两种，一是内标法，即把含有同位素的氨基酸加入生长细胞或合成 体系，该法对生物活性地影响可能较小，但由于制备复杂而限制了其广泛应用；二是外标法 ，常用化学方法如氯胺T或Iodogen法将125I连接于大分子上，因相对简单而被首 选。
同位素法具有简便直观，检测迅速的优点，尤其适用于蛋白多肽药物的组织分布研究，但其 缺点亦显而易见。首先，它不能进行人体药物动力学研究；其次，同位素标记后是否会引起 药物的生物活性及其在生物体内的代谢行为发生变化，一直存在争议．前者可通过调整反应 条件和生物检定法加以改善和验证，基本上可使生物活性无明显变化；后者因药而异则复杂 的多，已有报道认为[6]，放射性标记法可干扰表皮生长因子与细胞的相互作用， 从而导致 其体内清除的紊乱；最后，由于蛋白多肽进入体内会被降解代谢，或与其它蛋白质结合，总 的放射性不能代表药物动力学过程，因此如何鉴别样品的原药，降解物及结合物是该法中需 解决的关键问题，常用的方法有两种。
1.3.1SDS-PAGE法根据药物Mr的大小选择不同浓度的凝胶电 泳，通过控制电流等条件使得原 药与其它产物分开，然后通过切割胶条放射计数或放射自显影的方法，来检测电泳放射性图 谱。该法具有较高的分辨率和灵敏度，但电泳过程中，125I-小肽和游离 125I可能扩散至空白凝胶或电解液中，从而使结果可能偏高。
1.3.2HPLC法高效反相色谱（RHPLC），高效排阻液相色谱（SEHPLC ）[7]，高效离子交换液相色 谱（IEHPLC）分别根据保留时间与蛋白多肽的疏水-亲水性特征，Mr大小，极性的 关系 来分离样品中的物质。它们共同的优点是特异性高，分辨率好，可同时测定原药和降解物， 其中SEHPLC亦可得到结合物的信息，而RHPLC用于蛋白多肽的分离有独特的优越性。但因受 注入样品量的限制，灵敏度，重现性都受影响，且设备昂贵，成本较高。
1.3.3 HPLC-RAD法
高效液相偶联同位素在线检测系统。这种方法将HPLC的高度分析分离行为和同位素的高灵敏度检测结合在一起。使得药物的分析分离更加直观和方便。特别在蛋白质多肽类药物药动学方面体现了其独特的优点。
1.4色谱法
1.4.1HPLC在进行普通药物动力学研究中，HPLC是技术成熟，应用广 泛的分析手段。在蛋 白多肽药物的实验研究或产业化中，HPLC都是主要的分离纯化工具。但鉴于蛋白多肽药物结 构的特殊性，除了一些小分子多肽，如peptichemio[8]，加压素的八肽拮抗剂（oc tapeptid e antagonist of vasopressin）[9]可分别直接或经选择性柱反应后,单独 用带荧光检测 器的HPLC进行药动学研究外，HPLC常需进一步改进或与其它更灵敏的检测技术联用方能满足 药动学的需要。除了上述提及的与同位素的联用，还有许多与免疫学方法的联用，如Philli ps[10]采用免疫亲和色谱技术分析人三种不同体液中粒细胞集落刺激因子的浓度； Partilla [11]等认为HPLC与RIA联用可以检测人体液中的神经肽。此外，令人瞩目的还有液 /质在线联用（LC-MS）。
LC-MS将高分离能力，适用范围广泛的色谱分离技术与高灵敏、专属及通用,在研究蛋 白多肽的结构中具有重要价值的质谱法联用起来，成为强有力的分离分析方法。多年来限制 LC-MS技术发展的决定因素是接口问题，由传送带接口（Moving-belt interface），热喷 雾 接口（Thermospray），到最近的电喷雾离子化接口（Electrosptay ionization ESI），联 用技术日趋成熟，尤其适用于生物样品中低浓度（pg/ml）药物及代谢物的测定[12] ，而蛋 白多肽类药物恰有在体内代谢快，浓度低的特点。国外已将用LC-MS于该类药物，药物代 谢 物[13，14]的动力学研究，国内尚处于起步阶段，除了仪器本身价格昂 贵，技术上亦存在 一些问题，如它对样品的纯度要求很高如何将药物从生物体液，尤其是血浆中提取纯化以 减少干扰；如何选择合适的内标以减少系统误差；在将LC-MS用于检测体育禁用肽(HCG,HGH ,EPO,ACTH等)时发现，糖肽难用于质谱分析，因为在质谱条件下，同样的氨基酸序列可产生 多种不同质量的多糖链，而每条链及整个分子都有可以产生质谱信号，这就大大降低了质谱 信号的专属性。尽管LC-MS在蛋白多肽药物的体内药物代谢动力学研究中还存在一 定的难度，但其作为实用性强，前景好的领域已引起人们的广泛关注。
1.4.2高效毛细管电泳（HPCE）HPCE是离子或荷电粒子以电场为驱动 力，在毛细管中按其 浓度和分配系数不同进行高效，快速分离的新技术，它以高分辨率，高灵敏度，分析时间短 ，样品量少及操作简单等诸多优点而成为蛋白多肽生物分子分离分析的重要手段。在临床 上 ，生物体液中低浓度蛋白多肽的分析面临的问题有：蛋白多肽与毛细管壁的相互作用所引起 的迁移时间的改变，这可以通过涂层CE加以改善；由于毛细管很细，管内容积很小，进样量 的不易控制给实验的重复性带来影响，而且很可能无法对低浓度的样品提供足够的灵敏度。 国外根据样品的性质采用不同的预处理，大体上可分为非特异性和高亲和性两种， 将样品加以浓缩，取得了满意的效果[15]。HPCE在检测上的迅速发展与HPLC已有并 驾齐驱之 势，况且鉴于HPCE在样品微量分析的优越性，已有人在药物动力学研究、体内分析中，将微 透析连续采样与之联用[16]，这在整个药动学研究中都不失为一有希望的方向。 2结语
由以上可知，现代科学技术的发展给蛋白多肽类药物的研究提供了多样的分析手段，但鉴于 该类药物的特殊性，尚无一种方法能完全满足动力学研究的要求。根据人用药物注册国 际协调会议（ICH）对生物药物临床前安全性评价“在科学基础上的灵活性和具体情节个别 处理”的总则，人们通常将几种方法联合应用，互相补充，才能得到比较可靠的结果。

5. 怎样监测病原物抗药性

因为大多数植物病原菌的致病阶段处于单倍体时期，且繁殖系数大、周期短，所以植物病原菌抗药性是发生速度最快、为害最严重的农业有害生物。同时，病原菌抗药性不容易被农民肉眼识别，必须通过实验室精密测定才能鉴别和诊断，因此，世界各国投入杀菌剂抗性监测研究的人力和财力也最多。

病原物抗药性监测是指测定自然界病原物群体对使用药剂敏感性的变化。包括在各地定点连年系统测定和对有抗药性怀疑的地方临时采集标本测定。最常用的监测方法是测定病原物生长量与药剂的效应关系。常见方法有菌落直径法，即在含有系列浓度杀菌剂培养基上测量药剂对菌落线性增长速率的抑制效应。采用干重法测量在含药的液体培养基中培养的菌体干重增长速率与药剂的效应，更能够准确反映杀菌剂对菌体生长的抑制作用。不过这种方法比较繁琐，工作量大。当病菌以孢子繁殖生长时，亦可采用浊度法测定细胞生长量与药剂的效应。

采用临界剂量或鉴别剂量是检测和测量抗药性广度的常用方法。如在含有完全能抑制野生敏感菌生长的杀菌剂浓度的培养基平板上，涂抹病原物混合孢子或其他繁殖体，进行适当培养后，检查病菌的生长情况，计算抗药性菌株的出现频率。

采用孢子萌发法也可测定药剂对不同菌株孢子萌发的抑制来鉴别抗药性。但是，许多内吸性杀菌剂并不阻止孢子萌发，这时应该考虑对芽管形态和菌体发育的作用。

活体测定法是指把病菌接种到经杀菌剂处理过的植株或部分组织上，评估药剂处理剂量与发病程度间的效应关系。这种活体测定方法不仅是测定专性寄生菌抗药性的唯一方法，而且是验证病菌在培养基上对药剂敏感性差异是否与在寄主上的反应差异一致必不可少的方法。例如，麦角甾醇生物合成抑制剂和二甲酰亚胺类杀菌剂在离体条件下，很容易引起真菌的抗性突变，但是，这些突变体对寄主的致病性也常随之降低。此外，在培养基上能对叶枯唑表现抗药性的稻白叶枯病菌，则失去了致病能力，而在经叶枯唑、敌枯唑等处理的水稻上表现抗性的菌株，在培养基上反而不表现抗性。

已知有些杀菌剂对菌体的呼吸作用或生物合成过程等生命过程有显着抑制作用，可以用生化测定法，测定不同杀菌剂浓度对这些过程影响程度的差异来比较不同菌株的敏感性。或者基于靶标蛋白三维结构变化而丧失与药剂的亲和性抗药性机制，制备和利用单克隆抗体进行免疫检测。最近，也有根据单核苷酸变异而产生抗药性的机制使用DNA探针杂交和PCR指纹图谱等分子生物技术进行病原物抗药性监测的成功例子。定量PCR检测技术的开发和应用，使病原菌的抗药性早期监测和预警成为可能。

一种病原物对某一农药的敏感性还常随着个体的遗传差异、培养基组分、琼脂的质量、温度、pH、测试环境和方法的不一致而有变化。如在含乙磷铝的PDA培养基上，疫霉的生长不受影响，但是在不含磷酸盐的合成培养基上，这种真菌对药剂则变得敏感。因此，某种药剂—病原物组合的抗药性测定，不但要选用适当的方法和条件进行，而且被怀疑有抗药性的菌株也必须用测得敏感基线同样的方法和条件进行各种测试，最好在所有抗药性测定中均包含有一个已知敏感的参考系。

在测定某种病原物各个个体对农药不同浓度的效应后，如何进一步鉴别和评估它们的抗药性，常用的标准有3种：第一种是用同一浓度测定各个体对药剂的反应；第二种是测定最低抑制浓度；第三种是测定产生相同效应的浓度，如抑制菌体生长发育或致病50%的有效浓度（EC50）。

第一种标准常会过高地评估抗药性水平或抗性程度。因为病菌对同一剂量的效应有时差异很大。第二种标准也有缺陷。因为有的菌株抗药性水平很高，如灰霉菌（Botrytiscinerea）对多菌灵的抗药性，难以用最低抑制浓度来评估抗药性水平，有些杀菌剂即使在很高浓度下也不能完全抑制菌体生长，同样不能采用这种分析标准。但灰霉野生敏感菌株对多菌灵特别敏感，亦可用最低抑制浓度作为鉴别抗性和敏感菌株的标准。采用第三种分析标准，根据杀菌剂的剂量与抑制菌体生长发育的效应关系，得出剂量与生长抑制率之间的回归方程，然后根据对测定菌株和标准野生敏感菌株的相同抑制生长发育百分率的药剂浓度的比较，鉴别抗性菌株并分析抗性水平。有些病菌对某些药剂的敏感性是由多个微效基因决定的，表现出数量遗传性状，虽很难评估某一菌株的抗性水平，但可以通过测定某地区用药前病原群体（一般需测100个菌株）对药剂的敏感性分布，用药后再测定病原群体的敏感性，由此可根据平均EC50之比来评估某一地区病原群体的抗性水平。

6. 什么是耐药性与耐受性有什么区别

耐药性一般指微生物、寄生虫以及肿瘤细胞对于化疗药物作用的耐受性，的是对药物的治疗反应比较差，就是治疗没有效果，一般是指抗生素类药物。

耐药性和耐受性的区别：

1、对象不同

耐药性，是针对病原体而言的。在治疗细菌性感染或寄生虫病的过程中，长期使用某种药物，往往会导致某种病菌或寄生虫的基因变异，使该药不能杀灭或抑制这种病原体；耐受性，是针对人体而言，指人体对药物反应的一种适应性状态和结果。

2、应对方式不同

产生耐受性后，停止用药一段时间后，其耐受性可以逐渐消失；产生耐药性后，需要加大药物剂量，有时加大药物剂量也不能再杀死这些耐药病菌。

3、产生原因不同

耐药性产生的原因主要来自于病原体或肿瘤细胞自身发生基因突变；耐受性产生的原因有先天的因素和后天的因素，后天原因主要是受体发生自我调节。

参考资料来源：网络-耐受性

参考资料来源：网络-耐药性

7. 可用于elisa的抗体有哪些类型

• ELISA的类型
  ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：
  （1）固相的抗菌素原或抗体，即"免疫吸附剂"（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原
  或抗体，称为"结合物"（conjugate）；（3）酶反应的底物。根据试剂的来源和标本的情
  况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。用于临床检验的ELISA主要
  有以下几种类型：

• 2.2.1 双抗体夹心法测抗原

• 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：
  1） 将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。
  2） 加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。
  洗涤除去其他未结合物质。
  3） 加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合
  的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
  4） 加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。
  在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、
  AFP、hCG等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合
  物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动
  物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相
  载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标
  抗体一起保温反应，作一步检测。
  在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标
  抗体结合，而不再形成"夹心复合物"。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应
  后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的
  吸光值相同（参见1.3.2，图1-4），如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现
  象被称为钩状效应（hook effect），因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重
  时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常
  增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时，应注意可测范围的最高值。用
  高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。
  假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如HBsAg的a决定簇，也可
  用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在HBsAg的检测中应注意亚型
  问题，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型，虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应
  性，这也是用单抗作夹心法应注意的问题。
  双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰。RF是一种自身抗
  体，多为IgM型，能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含
  有RF，它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应。采用
  F（ab"）或Fab片段作酶结合物的试剂，由于去除了Fc段，从而消除RF的干扰。双抗体
  夹心法ELISA试剂是否受RF的影响，已被列为这类试剂的一项考核指标（参见6.2）。
  双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小
  分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。

• 2.2.2 双抗原夹心法测抗体
  反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应
  的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需
  稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBs的检测常采
  用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。

• 2.2.3 间接法测抗体

• 间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗
  体）以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法（见图2-3）。操作步骤如下：
  1）将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。
  2）加稀释的受检血清，保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗
  体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清中的其他成份在洗涤过程
  中被洗去。
  3）加酶标抗抗体。可用酶标抗人Ig以检测总抗体，但一般多用酶标抗人IgG检测IgG抗
  体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，
  固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。
  4）加底物显色
  本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包
  被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。
  间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结
  果，但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性。特别应注意除去能与一般健康人血清发
  生反应的杂质，例如以E.Coli为工程酶的重组抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能与受过
  E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗体发生反应。抗原中也不能含有与酶标抗人Ig反应的物
  质，例如来自人血浆或人体组织的抗原，如不将其中的Ig去除，试验中也发生假阳性反
  应。另外如抗原中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影响包被效果。
  间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性。病人血清中受检的
  特异性IgG只占总IgG中的一小部分。IgG的吸附性很强，非特异IgG可直接吸附到固相载体
  上，有时也可吸附到包被抗原的表面。因此在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质
  （例如牛血清蛋白）再包被一次，以封闭（blocking）固相上的空余间隙。另外，在检
  测过程中标本须先行稀释（1:40~1:200），以避免过高的阴性本底影响结果的判断。

• 2.2.4 竞争法测抗体

• 当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特
  异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体
  量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。如抗原为高纯
  度的，可直接包被固相。如抗原中会有干扰物质，直接包被不易成功，可采用捕获包被
  法，即先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原，形成固相抗原。洗涤除去抗原中的
  杂质，然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应。竞争法测抗体有多种模式，可将标本
  和酶标抗体与固相抗原竞争结合，抗HBc ELISA一般采用此法。另一种模式为将标本
  与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合，洗涤后再加入酶标抗体，与结合在固相上的
  抗原反应。抗HBe的检测一般采用此法。

• 2.2.5 竞争法测抗原
  小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法
  进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相
  抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。
  小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。

• 2.2.6 捕获包被法测抗体

• IgM抗体的检测用于传染病的早期诊断(early diagnosis)中。间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或
  IgG抗体。如用抗原包被的间接法直接测定IgM抗体，因标本中一般同时存在较高浓度的
  IgG抗体，后者将竞争结合固相抗原而使一部份IgM抗体不能结合到固相上。因此如用抗人
  IgM作为二抗，间接测定IgM抗体，必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理，以除去IgG的
  干扰。在临床检验中测定抗体IgM时多采用捕获包被法。先用抗人IgM抗体包被固相，以捕
  获血清标本中的IgM（其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM）。然后加入
  抗原，此抗原仅与特异性IgM相结合。继而加酶标记针对抗原的特异性抗体。再与底物作
  用，呈色即与标本中的IgM成正相关。此法常用于病毒性感染的早期诊断(early diagnosis)。甲型肝炎病毒
  （HAV）抗体的检测模式见图2-7。
  类风湿因子（RF）同样能干扰捕获包被法测定IgM抗体，导致假阳性反应。因此中和
  IgG的间接法近来颇受青睐，用这类试剂检测抗CMV IgGM和抗弓形虫IgM抗体已获成功。

• 2.2.7 ABS-ELISA法
  ABS为亲和素(avidin)生物素(biotin)系统(system)的略语。亲和素是一种糖蛋白，分子
  量60000，每个分子由4个能和生物素结合的亚基组成。生物素为小分子化合物，分子量
  244。用化学方法制成的衍生物素-羟基琥珀酰亚胺酯可与蛋白质和糖等多种类型的大小分
  子形成生物素标记产物，标记方法颇为简便。生物素与亲和素的结合具有很强的特异性，
  其亲和力较抗原抗体反应大得多，两者一经结合就极为稳定。由于一个亲和素可与4个生
  物素分子结合，因此如把ABS与ELISA法可分为酶标记亲和素-生物素（LAB）法和桥联亲
  和素-生物素（ABC）法两种类型。两者均以生物素标记的抗体（或抗原）代替原ELISA系
  统中的酶标抗体（抗原）。在LAB中，固相生物素先与不标记的亲和素反应，然后再加酶
  标记的生物素以进一步提高敏感度。在早期，亲和素从蛋清中提取，这种卵亲和素为碱性
  糖蛋白，与聚苯乙烯载体的吸附性很强，用于ELISA中可使本底增高。从链霉菌中提取的
  链霉亲和素则无此缺点，在ELISA应用中有替代前者的趋势。由于ABS-ELISA较普通
  ELISA多用了两种试剂，增加了操作步骤，在临床检验中ABS-ELISA应用不多。