細胞學鑒定物種方法有哪些

㈠ 細胞生物學中常用的實驗技術或者方法

第二節 細胞生物學實驗方法與技術
當前細胞生物學與醫葯保健事業聯系的較為緊密的熱點問題主要有以下幾種：1）真核細胞基因結構及其表達調控；2）細胞膜、膜系、受體與信號傳遞研究；3）細胞生長、分化、衰老、癌變、死亡，尤其是程序性細胞死亡的研究；4) 細胞工程，包括基因工程及體細胞核移植的研究。
一、細胞培養常用方法
1、細胞原代培養（primay culture） 又稱初代培養，即直接從機體取下細胞、組織、或器官、讓他們在體外維持與生長。原代細胞的特點是細胞或組織剛離開機體，他們的生物狀態尚未發生很大的改變，一定程度上可反映他們在體內的狀態，表現出來源組織或細胞的特性，因此用於葯物實驗尤其是葯物對細胞活動、結構、代謝、有無毒性或殺傷作用等研究是極好工具。常用的原代培養方法有組織快培養法及消化培養法。前者方法簡單，細胞也較易生長，尤其是培養心肌有時能觀察到心肌組織塊的搏動。細胞從組織塊外長並鋪滿培養皿或培養瓶後即可進行傳代。2、細胞的傳代培養 當細胞生長至單層匯合時，便需要進行分離培養否則會因無繁殖空間、營養耗竭而影響生長，甚至整片細胞脫離基質懸浮起來直至死亡。為此當細胞達到一定密度時必須傳代或再次培養，目的是藉此繁殖更多的細胞，另一方面是防止細胞的退化死亡。
二、器官培養方法
器官培養（organ culture）是指用特殊的裝置使器官、器官原基或它們的一部分在體外存活，幷保持其原有的結構和功能。器官培養可模擬體內的三維結構，用於觀察組織間的相互反應、組織與細胞的分化以及外界因子包括葯物對組織細胞的作用。
器官培養方法很多，最經典的方法即表玻皿器官培養法；一種最常用的方法是不銹鋼金屬網格法及Wolff培養法和擴散盒培養法，實驗者可根據情況選擇採用。
三、放射自顯影術測定
放射自顯影術（autoradiography）是利用放射性同位素電離輻射對核子乳膠的感光作用，顯示標本或樣品中放射物的分布、定量以及定位的方法。放射性同位素能在緊密接觸的感光乳膠中記錄下它存在的部位和強度，准確顯示出形態與功能的定位關系。現已可將放射自顯影術與電鏡以及生物分子結合起來。不但可以研究放射性物質在組織和細胞內的分布代謝，而且可以揭示核酸合成及其損傷等改變，目前已在生命科學各領域被廣泛應用。
四、染色體分析技術
染色質或染色體是遺傳物質在細胞水平的形態特徵。前者是指當細胞處於合成期時遺傳物質經鹼性染料著色後，呈現出細絲狀彌漫結構；當細胞進入分裂期時，染色質細絲高度螺旋化凝聚為形態有特徵的染色體。特別是在分裂中期，復制後的染色體達到最高程度的凝聚，稱為中期染色，是進行染色體形態觀察分析的最佳時期。染色體分析應用領域越來越廣，主要用於以下幾方面：1）為臨床診斷提供新手段；2）研究不育和習慣性流產發生的遺傳基礎；3) 通過檢查胎兒的染色體，預防有染色體異常患兒出生（先天愚型）；4）根據染色體的多肽性進行親子和異型配子的起源研究；結合DNA重組技術可以將基因定位於染色體的具體區帶上。
五、電鏡技術
早在1940年，英國劍橋大學首先試製成功掃描電子顯微鏡，但因解析度低無實用價值。1965年英國劍橋科學儀器有限公司開始生產出商品掃描電鏡，其以顯著優點廣泛用於生物學、醫學、物理學、化學、電子學及勘探、冶金、國防、公安、機械與輕工業等諸多領域，並已成為非常有用的研究工具。

㈡ 多倍體的鑒定方法

多倍體廣泛分布於植物界，如普通小麥是異源六倍體，棉花是四倍體，栽培草莓是八倍體等，多倍體產生途徑除自然發生外，化學葯劑誘導是很有效的途徑。不管以何種方式產生，檢測、鑒定多倍體就顯得很重要和迫切。
鑒定多倍體，可採用間接和直接的方法。間接方法包括形態學和細胞學的觀察，直接法是直接對試材檢測染色體的數目。一般來講，多倍體植物在形態學和細胞學上的特徵表現為: 氣孔、花器、花粉粒、種子、果實甚至葉片等明顯變大，單位面積葉片上的氣孔數目減少而密度降低等。考慮到染色體觀察、記數較為煩瑣，首先對試材從形態學和細胞學上來初步判斷是否為多倍體，然後把初步斷定為多倍體的試材再觀察、記錄染色體數目是否真正地發生了倍性的變異，從而最終確定為多倍體。
芽變選種是無性繁殖植物育種的一種有效途徑，多以嵌合體的形式存在，特別是多倍體芽變。通過檢測梢端分生組織LⅠ、LⅡ 、LⅢ三層細胞的細胞、細胞核及核仁的大小，可以鑒定芽變材料倍性嵌合體的類型。
本實驗學習多倍體鑒定的基本方法。

一、試材及用具
1．試材:玉米、小麥、棉花、草莓、番茄、蘋果等。
2．用具:顯微鏡、剪刀、培養皿、載玻片、蓋玻片、吸水紙、鑷子、紗布、酒精燈、物鏡測微尺、目鏡測微尺等。
3． 試劑 及配製
（1）卡諾氏固定液: 冰醋酸1份，加純（或95%）酒精3份，混勻，現用現配。
（2）醋酸纖維素液: 稱取10g醋酸纖維素，加入到100 mL的丙酮溶液中，用玻棒攪拌數分鍾至醋酸纖維素全部溶解。
（3）醋酸洋紅染色劑: 取45 mL冰醋酸，加入55 mL蒸餾水，加熱至沸騰，慢慢加入2 g洋紅，煮沸約5 min，冷卻後加入2% 硫酸亞鐵。過濾，貯於棕色瓶中。
（4）解離液: 鉻酸2g，濃硫酸8 mL，濃硝酸3 mL，蒸餾水89 mL，充分混勻。

二、方法步驟
（一）間接方法
1．形態學觀察
觀察試材的形態學特徵，例如葉片、果實、種子、花器等是否有較明顯的增大現象，如果肉眼就能觀察到明顯的增大現象，說明試材很有可能是多倍體。不論形態上是否存在明顯變異，還需觀察、檢測細胞學上的變化。
2．細胞學觀察
（1）檢測氣孔大小和密度
對葉背無茸毛的材料，可直接觀察。取葉片用卡諾氏固定液固定，撕取葉片下表皮置載玻片上，滴上1～2滴醋酸洋紅染色劑染色1～2 min，蓋上蓋玻片，用吸水紙吸去多餘的染液，在顯微鏡下觀察記錄氣孔保衛細胞長度、寬度和氣孔的密度。
對葉背有茸毛的材料，用印膜法觀察。 選取生長健壯葉片，於葉背中部（避開葉脈）塗上一層均勻醋酸纖維素液，約5 min後形成一層薄膜，用鑷子揭下薄膜，就除掉了葉背的茸毛。然後再往葉背塗一層醋酸纖維素液，注意要塗勻，在室內涼3～5 min，用鑷子取下薄膜，置於載玻片上，加蒸餾水或醋酸洋紅染色劑1～2滴，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察氣孔的大小和密度。
對葉背茸毛多的材料，用解離液法觀察。先用醋酸纖維素液去掉茸毛，然後把葉片剪成小塊放入解離液中浸泡，直至表皮邊緣與葉肉脫離翹起，放入清水中漂洗，揭下表皮，置於載玻片上，用醋酸洋紅染色，蓋上蓋玻片，鏡檢。
把臨時製片在低倍鏡下找到氣孔，換用高倍鏡，用目鏡測微尺測量保衛細胞大小，求30個氣孔大小的平均值。然後統計計算每個視野中氣孔的數目，移動載玻片，換另外的視野，進行10次記數，用物鏡測微尺測量視野的直徑，計算出每個視野的面積，求出單位葉面積上的氣孔的數目，即為氣孔的密度。

㈢ 作物怎樣按細胞學分類

從20世紀30年代初期開始，細胞有絲分裂時的染色體數目和形態就得到了大量研究。到目前為止，約40%的顯花植物已經做過染色體數目統計，利用這些資料已修正了某些作物在植物分類學上的一些錯誤。因此，染色體核型（指一個個體或種的全部染色體的形態結構，包括染色體數目、大小、形狀、主縊痕、次縊痕等）的差異在細胞分類學發展的60多年裡，被廣泛地用作確定植物間分類差別的依據。

此外，根據染色體組（又稱基因組）進行的細胞學分類也是十分重要的。例如，在芸薹屬中，分別把染色體基數為10、8和9的染色體組命名為AA組、BB組和CC組，它們成為區分物種的重要依據之一。染色體倍性同樣是分類學上常用的指標。

㈣ 生物學的主要研究方法都有哪些

生物學的主要研究方法有：觀察描述的方法、比較的方法、實驗的方法、系統的方法。

1、觀察描述法

生物學的研究則是考察那些將不同生物區別開來的、往往是不可測量的性質。生物學用描述的方法來記錄這些性質，再用歸納法，將這些不同性質的生物歸並成不同的類群。18世紀，由於新大陸的開拓和許多探險家的活動，生物學記錄的物種幾倍、幾十倍地增長，於是生物分類學首先發展起來。生物分類學者搜集物種進行鑒別、整理，描述的方法獲得巨大發展。要明確地鑒別不同物種就必須用統一的、規范的術語為物種命名，這又需要對各種各樣形態的器官作細致的分類，並制定規范的術語為器官命名。

2、比較法

運用比較的方法研究生物，是力求從物種之間的類似性找到生物的結構模式、原型甚至某種共同的結構單元。19世紀30年代，消色差顯微鏡問世，使人們得以觀察到細胞的內部情況。1838～1839年施萊登和施萬的細胞學說提出：細胞是一切動植物結構的基本單位。比較形態學者和比較解剖學者多年來苦心探求生物的基本結構單元，終於有了結果。細胞的發現和細胞學說的建立是觀察和描述深入到顯微領域所獲得的成果，也是比較方法研究的一個重要成果。

3、實驗法

實驗方法則是人為地干預、控制所研究的對象，並通過這種干預和控制所造成的效應來研究對象的某種屬性。實驗的方法是自然科學研究中最重要的方法之一。19世紀80年代，實驗方法進一步被應用到了胚胎學，細胞學和遺傳學等學科。到了20世紀30年代，除了古生物學等少數學科，大多數的生物學領域都因為應用了實驗方法而取得新進展。

4、系統法

系統科學源自對還原論、機械論反省提出的有機體、綜合哲學，從C.貝爾納與W.B.坎農揭示生物的穩態現象、維納與艾什比的控制論到貝塔郎菲的一般系統論，系統生態學、系統生理學等先後建立與發展，20世紀70-80年代系統論與生物學、系統生物學等概念發表。從香農資訊理論到I.普里戈津的耗散結構理論，將生命看作自組織化系統。

(4)細胞學鑒定物種方法有哪些擴展閱讀：

生物學是研究生物(包括植物、動物和微生物)的結構、功能、發生和發展規律的科學，是自然科學的一個部分。目的在於闡明和控制生命活動，改造自然，為農業、工業和醫學等實踐服務。幾千年來，中國在農、林、牧、副、漁和醫葯等實踐中，積累了有關植物、動物、微生物和人體的豐富知識。1859年，英國博物學家達爾文《物種起源》的發表，確立了唯物主義生物進化觀點，推動了生物學的迅速發展。

生物分類學是研究生物分類的方法和原理的生物學分支。分類就是遵循分類學原理和方法，對生物的各種類群進行命名和等級劃分。瑞典生物學家林奈將生物命名後，而後的生物學家才用域（Domain）、界（Kingdom）、門（ Phylum）、綱（Class）、目（Order）、科（Family）、屬（Genus）、種（Species）加以分類。最上層的界，由懷塔克所提出的五界，比較多人接受；分別為原核生物界、原生生物界、菌物界、植物界以及動物界。 從最上層的「界」開始到「種」，愈往下層則被歸屬的生物之間特徵愈相近。共有七大類，分別是：界門綱目科屬種。

㈤ 目前生物學上常用什麼來鑒定生物的種類

生物學上常用顯微鏡來鑒定生物的種類，目前常用的是光學顯微鏡。
顯微鏡是用來鑒定生物種類的，先用顯微鏡鑒定生物是什麼種類，然後再用檢索表來明確這種生物的分類地位。
不同的生物具有不同的特徵，一般鑒定生物種類首先看生物外貌，其次看生理生化特徵，然後看生活環境，通過檢索表最終確定。現在科技發達，有些種類長得十分相似，只能藉助於基因來鑒定分類。
生物分類是研究生物的一種基本方法。生物分類主要是根據生物的相似程度（包括形態結構和生理功能等），把生物劃分為種和屬等不同的等級，並對每一類群的形態結構和生理功能等特徵進行科學的描述，以弄清不同類群之間的親緣關系和進化關系。分類的依據是生物在形態結構和生理功能等方面的特徵。分類的基本單位是種。分類等級越高，所包含的生物共同點越少；分類等級越低，所包含的生物共同點越多。了解生物的多樣性，保護生物的多樣性，都需要對生物進行分類。
人為分類法主要是憑借對生物的某些形態結構、功能、習性、生態或經濟用途的認識將生物進行分類，而不考慮生物親緣關系的遠近和演化發展的本質聯系，因此所建立的分類體系大都屬於人為分類體系。例如，將生物分為陸生生物、水生生物；草本植物、木本植物；糧食作物、油料作物等。另外，18世紀瑞典植物學家林奈(1707—1778)以生物能否運動為標准，將生物劃分為動物界和植物界的兩界系統。他還根據雄蕊的有無、數目，把植物界分為一雄蕊綱、二雄蕊綱等24個綱。16世紀我國李時珍(1518—1593)在他的《本草綱目》一書中將植物分為五部，即草部、谷部、菜部、果部和木部；將動物也分為五部，即蟲部、鱗部、介部、禽部和獸部；人另屬一部，即人部。又如，亞里士多德根據血液的有無，把動物區分為有血液的動物和無血液的動物兩大類，等等。

㈥ 根據作物的細胞學是怎樣進行分類的

從20世紀30年代初期開始，細胞有絲分裂時的染色體數目和形態就得到了大量研究。到目前為止，約40%的顯花植物已經做過染色體數目統計，利用這些資料已修正了某些作物在植物分類學上的一些錯誤。因此，染色體核型（指一個個體或種的全部染色體的形態結構，包括染色體數目、大小、形狀、主縊痕、次縊痕等）的差異在細胞分類學發展的60多年裡，被廣泛地用作確定植物間分類差別的依據（徐炳聲等，1996）。

此外，根據染色體組（又稱基因組）進行的細胞學分類也是十分重要的。例如，在芸薹屬中，分別把染色體基數為10、8和9的染色體組命名為AA組、BB組和CC組，它們成為區分物種的重要依據之一。染色體倍性同樣是分類學上常用的指標。

㈦ 請問一下菌種鑒定的方法和實驗步驟

實驗步驟：菌種鑒定工作是各類微生物學實驗室都經常遇到的基礎性工作。不論鑒定對象屬哪一類，其工作步驟都離不開以下三步：①獲得該微生物的純種培養物；②測定一系例必要的鑒定指標；③查找權威性的鑒定手冊。 一、經典分類鑒定方法 群體：菌落形態，在半固體或液體培養基中的生長狀態等
* 形態 個體：細胞形態，染色反應，各種特殊構造等
* 營養要求：能源，碳源，氮源，生長因子等
* 生理、生化反應 酶；產酶種類和反應物性等
* 代謝產物：種類，產量，顯色反應等
* 經典指標 生態特性：生長溫度，對氧的需要，宿主種類等
* 生活史特點
* 血清學反應
* 噬菌體的敏感性
* 其它
經典分類法
經典分類法是一百多年來進行微生物分類的傳統方法。其特點是人為地選擇幾種形態生理生化特徵進行分類，並在分類中將表型特徵分為主、次。一般在科以上分類單位以形態特徵、科以下分類單位以形態結合生理生化特徵加以區分。 * A. 能在 60 o C 以上生長
* B. 細胞大，寬度 1.3~1.8mm ………………… 1. 熱微菌屬 ( Thermomicrobium )
* B. 細胞小，寬度 0.4~0.8mm
* C. 能以葡萄糖為碳源生長
* D. 能在 pH4.5 生長 …………………………… 2. 熱酸菌屬 ( Acidothermus )
* DD. 不能在 pH4.5 生長 …………………………………… 3. 棲熱菌屬 ( Thermus )
* CC. 不能以葡萄糖為唯一碳源 ……………… 4. 棲熱嗜油菌屬 ( 棲熱嗜獅菌屬 Thermoleophilum )
* AA. 不能在 60 o C 以上生長
二、現代分類鑒定方法
* 近年來，隨著分子生物學的發展和各項新技術的廣泛應用，促使微生物分類鑒定工作有了飛速發展。對微生物鑒定工作來說，已從經典的表型特徵的鑒定深入到現代的遺傳學特性的鑒定、細胞化學組分的精確分析以及利用電子計算機進行數值分類研究等新的層次上。
* （一）微生物遺傳型的鑒定
* DNA是除少數RNA病毒以外的一切微生物的遺傳信息載體。每一種微生物均有其自己特有的、穩定的DNA成分和結構，不同微生物間DNA成分和結構的差異程度代表著它們間新緣關系的遠近。因此，測定每種微生物DNA的若乾重要數據，是微生物鑒定中極其重要的指標：
1. DNA的鹼基組成(G+Cmol%)* 每一個微生物種的 DNA 中 GC mol% 的數值是恆定的，不會隨著環境條件、培養條件等的變化而變化，而且在同一個屬不同種之間， DNA 中 GCmol% 的數值不會差異太大，可以某個數值為中心成簇分布，顯示同屬微生物種的 GC mol% 范圍。 DNA 中 GC mol% 分析主要用於區分細菌的屬和種，因為細菌 DNA 中 GC 含量的變化范圍一般在 25 ％～ 75 ％；而放線菌 DNA 中的 GC 比例范圍非常窄 (37 ％～ 51%) 。一般認為任何兩種微生物在 GC 含量上的差別超過了 10 ％，這兩種微生物就肯定不是同一個種。因此可利用 G+C mol ％來鑒別各種微生物種屬間的親緣關系及其遠近程度。值得注意的是，親緣關系相近的菌，其 G+C mol ％含量相同或者近似，但 G+C mol ％相同或近似的細菌，其親緣關系並不一定相似，這是因為這一數據還不能反映出鹼基對的排列序列，而且如放線菌的 DNA 的 GC mol% 在 37 ～ 51 之間，企圖在這么小的范圍內區分放線菌的幾十個屬顯然是不現實的。要比較兩種細菌的 DNA 鹼基對排列序列是否相同，以及相同的程度如何，就需做核酸雜交試驗。
1. DNA的鹼基組成(G+Cmol%)* 1）每個生物種都有特定的GC%范圍，因此後者可以作為分類鑒定的指標。細菌的GC%范圍為25--75%，變化范圍最大，因此更適合於細菌的分類鑒定。
* 2）GC%測定主要用於對表型特徵難區分的細菌作出鑒定，並可檢驗表型特徵分類的合理性，從分子水平上判斷物種的親緣關系。
* 3）使用原則：
* G+C含量的比較主要用於分類鑒定中的否定每一種生物都有一定的鹼基組成，親緣關系近的生物，它們應該具有相似的G+C含量，若不同生物之間G+C含量差別大表明它們關系遠。但具有相似G+C含量的生物並不一定表明它們之間具有近的親緣關系。
1. DNA的鹼基組成(G+Cmol%)* 同一個種內的不同菌株G+C含量差別應在4～5%以下；同屬不同種的差別應低於10～15%。所以G+C含量已經作為建立新的微生物分類單元的一項基本特徵，它對於種、屬甚至科的分類鑒定有重要意義。
* 若二個在形態及生理生化特性方面及其相似的菌株，如果其G+C含量的差別大於5%，則肯定不是同一個種，大於15%則肯定不是同一個屬。
* 在疑難菌株鑒定、新種命名、建立一個新的分類單位時，G+C含量是一項重要的，必不可少的鑒定指標。其分類學意義主要是作為建立新分類單元的一項基本特徵和把那些G+C含量差別大的種類排除出某一分類單元。
2.核酸的鹼基組成和分子雜交：* 與形態及生理生化特性的比較不同，對DNA的鹼基組成的比較和進行核酸分子雜交是直接比較不同微生物之間基因組的差異，因此結果更加可信。
DNA-DNA 雜交
* DNA 雜交法的基本原理是用 DNA 解鏈的可逆性和鹼基配對的專一性，將不同來源的 DNA 在體外加熱解鏈，並在合適的條件下，使互補的鹼基重新配對結合成雙鏈 DNA ，然後根據能生成雙鏈的情況，檢測雜合百分數。如果兩條單鏈 DNA 的鹼基順序全部相同，則它們能生成完整的雙鏈，即雜合率為 100% 。如果兩條單鏈 DNA 的鹼基序列只有部分相同，則它們能生成的「雙鏈」僅含有局部單鏈，其雜合率小於 100% 。由此；雜合率越高，表示兩個 DNA 之間鹼基序列的相似性越高，它們之間的親緣關系也就越近。如兩株大腸埃希氏菌的 DNA 雜合率可高達 100 ％，而大腸埃希氏菌與沙門氏菌的 DNA 雜合率較低，約有 70 ％。 G+Cmol ％的測定和 DNA 雜交實驗為細菌種和屬的分類研究開辟了新的途徑，解決了以表觀特徵為依據所無法解決的一些疑難問題，但對於許多屬以上分類單元間的親緣關系及細菌的進化問題仍不能解決。
DNA — rRNA 雜交
* 目前研究 RNA 鹼基序列的方法有兩種。一是 DNA 與 rRNA 雜交，二是 16S rRNA 寡核苷酸的序列分析。 DNA 與 rRNA 雜交的基本原理、實驗方法同 DNA 雜交一樣，不同的是① 是 DNA 雜交中同位素標記的部分是 DNA ，而 DNA 與 rRNA 雜交中同位素標記的部分是 rRNA 。② DNA 雜交結果用同源性百分數表示，而 DNA 與 rRNA 雜交結果用 Tm(e) 和 RNA 結合數表示。 Tm(e) 值是 DNA 與 rRNA 雜交物解鏈一半時所需要的溫度。 RNA 結合數是 100 m gDNA 所結合的 rRNA 的 m g 數。根據這個參數可以作出 RNA 相似性圖。在 rRNA 相似性圖上，關系較近的菌就集中到一起。關系較遠的菌在圖上占據不同的位置。用 rRNA 同性試驗和 16SrRNA 寡核苷酸編目的相似性比較 rRNA 順反子的實驗數據可得到屬以上細菌分類單元的較一致的系統發育概念，並導致了古細菌的建立。
3.建立16 S r RNA系統發育樹
* a）使生物進化的研究范圍真正覆蓋所有生物類群；
* 傳統的生物進化研究，主要基於復雜的形態學和化石記載，因此多限於研究後生生物（metazoa），而後者僅占整個生物進化歷程的1/5
* b）提出了一種全新的正確衡量生物間系統發育關系的方法；
* c）對探索生命起源及原始生命的發育進程提供了線索和理論依據；
* d）突破了細菌分類僅靠形態學和生理生化特性的限制，建立了全新的微生物分類、鑒定理論；
* e）為微生物生物多樣性和微生物生態學研究建立了全新的研究理論和研究方法，特別是不經培養直接對生態環境中的微生物進行研究。
3、 16S rRNA(16S rDNA) 寡核苷酸的序列分析
* 首先， 16S rRNA 普遍存在於原核生物（真核生物中其同源分子是 18S rRNA ）中。 rRNA 參與生物蛋白質的合成過程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物進化的漫長歷程中保持不變，可看作為生物演變的時間鍾。其次，在 16S rRNA 分子中，既含有高度保守的序列區域，又有中度保守和高度變化的序列區域，因而它適用於進化距離不同的各類生物親緣關系的研究。第三， 16S rRNA 的相對分子量大小適中，約 1 540 個核苷酸，便於序列分析。因此，它可以作為測量各類生物進化和親緣關系的良好工具。
分離菌株 16S rRNA 基因
* 。從平板中直接挑取一環分離菌株細胞 , 加入 100μL 無菌重蒸 H 2 O 中 , 旋渦混勻後 , 沸水浴 2min, 12 000r min -1 離心 5min, 上清液中即含 16S rRNA 基因，可直接用於 PCR 擴增。分離菌株 16S rRNA 基因的 PCR 擴增和序列測定的一般步驟為： 16S rRNA 基因的 PCR 引物： 5'-AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3' ； 5'-AAGGA GGTGA TCCAG CCGCA-3' 。擴增反應體積 50 m L ，反應條件為 95 ℃預變性 5min ， 94 ℃變性 1min ， 55 ℃退火 1min ， 72 ℃延伸 2min ，共進行 29 個循環， PCR 反應在 PTC-200 型熱循環儀上進行。取 5 m L 反應液在 10g L -1 的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。 PCR 產物測序可由專門技術公司完成。
比對分析
* 測序得到 分離菌株 16S rDNA 部分序列，此序列一般以 *.f.seq 形式保存，可以用寫字板或 Editsequence 軟體打開，將所得序列通過 Blast 程序與 GenBank 中核酸數據進行比對分析 ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast ) ，具體步驟如下：點擊網站中 Nucleotide BLAST 下 Nucleotide-nucleotide BLAST [blastn] 選項，將測序所得序列粘貼在「 search 」網頁空白處，或輸入測序結果所在文件夾目錄，點擊核酸比對選項，即「 blast 」，然後點擊「 format 」，計算機自動開始搜索核苷酸資料庫中序列並進行序列比較，根據同源性高低列出相近序列及其所屬種或屬，以及菌株相關信息，從而初步判斷 16S rDNA 鑒定結果。
比對分析
* 遺傳距離矩陣與系統發育樹構建，可採用 DNAStar 軟體包中的 MegAlign 程序計算樣本間的遺傳距離。由 GenBank 中得到相關菌株的序列，與本研究分離菌株所測得序列一起輸入 Clustalx1.8 程序進行 DNA 同源序列排列，並經人工仔細核查。在此基礎上，序列輸入 Phylip3.6 軟體包，以簡約法構建系統發育樹。使用 Kimura 2-parameter 法，系統樹各分枝的置信度經重抽樣法（ Bootstrap ） 500 次重復檢測， DNA 序列變異中的轉換和顛換賦於相同的加權值。
（二）細胞化學成分的鑒定* 除上述核酸成分外的其它化學成分的測定，是微生物化學分類法的重要內容，主要包括：1.細胞壁的化學成分。2.全細胞水解液的糖型。3.磷酸類脂成分的分析。4.枝菌酸的分析。5. 醌類的分析。6.氣相色譜技術的應用。
（二）細胞化學成分的鑒定
* 微生物分類中，根據微生物細胞的特徵性化學組分對微生物進行分類的方法稱化學分類法 (chemotaxonomy) 。在近二十多年中，採用化學和物理技術采研究細菌細胞的化學組成，已獲得很有價值的分類和鑒定資料，各種化學組分在原核微生物分類中的意義見表
細菌的化學組分分析及其在分類水平上的應用
細胞化學成分鑒定的意義
* 隨著分子生物學的發展，細胞化學組分分析用於微生物分類日趨顯示出重要性。細胞壁的氨基酸種類和數量現己被接受為細菌屬的水平的重要分類學標准。在放線菌分類中，細胞壁成分和細胞特徵性糖的分析作為分屬的依據，已被廣泛應用。脂質是區別細菌還是古菌的標准之一，細菌具有醯基脂 ( 脂鍵 ) ，而古菌具有醚鍵脂，因此醚鍵脂的存在可用以區分古菌。黴菌酸的分析測定己成為諾卡氏菌形放線菌分類鑒定中的常規方法之一。鞘氨醇單胞菌和鞘氨醇桿菌等細胞膜都含有鞘氨醇，因此鞘氨醇的有無可作為此類細菌的一個重要標志。此外某些細菌原生質膜中的異戊間二烯醌，細胞色素，以及紅外光譜等分析對於細菌、放線菌中某些科、屬、種的鑒定也都十分有價值。
（三）數值分類法
* 數值分類法亦稱統計分類法，是在約200年前與林奈同代人M.Adanson (1727 ~1806，法國植物學家)發展的分類原理基礎上藉助於現代的電子計算機技術而發展起來的。數值分類的基本步驟為：（1）計算兩菌株間的相似系數；（2）列出相似度矩陣；（3）將矩陣圖轉換成樹狀譜。
數值分類的基本步驟
數值分類法
* 又稱阿德遜氏分類法 。它的特點是根據較多的特徵進行分類，一般為 50 ～ 60 個，多者可達 100 個以上，在分類上，每一個特性的地位都是均等重要。通常是以形態、生理生化特徵，對環境的反應和忍受性以及生態特性為依據。最後，將所測菌株兩兩進行比較，並借用電子計算機計算出菌株間的總相似值，列出相似值矩陣 ( 圖 14-5) 。為便於觀察，應將矩陣重新安排，使相似度高的菌株列在一起，然後將矩陣圖轉換成樹狀譜 (dendrogram) ，再結合主觀上的判斷 ( 如劃分類似程度大於 85 ％者為同種，大於 65 ％者為同屬等 ) ，排列出—個個分類群。
數值分類法的優越性
* 數值分類法的優越性在於它是以分析大量分類特徵為基礎，對於類群的劃分比較客觀和穩定；而且促進對細菌類群的全面考查和觀察，為細菌的分類鑒定積累大量資料。但在使用數值分類法對細菌菌株分群歸類定種或定屬時，還應做有關菌株的 DNA 鹼基的 G + Cmol% 和 DNA 雜交，以進一步加以確證。

㈧ 微生物群落中關鍵物種的區分和鑒定有哪些方法

微生物群落中關鍵物種的區分和鑒定有哪些方法
微生物群落的種群多樣性一直是微生物生態學和環境學科研究的重點。近幾年來，微生物群落結構成為研究的熱點。首先，群落結構決定了生態功能的特性和強弱。其次，群落結構的高穩定性是實現生態功能的重要因素。再次，群落結構變化是標記環境變化的重要方面。因此，通過對目標環境微生物群落的種群結構和多樣性進行解析並研究其動態變化，可以為優化群落結構、調節群落功能和發現新的重要微生物功能類群提供可靠的依據。
從年代上來看，微生物群落結構和多樣性解析技術的發展可以分為三個階段。20世紀70年代以前主要依賴傳統的培養分離方法，依靠形態學、培養特徵、生理生化特性的比較進行分類鑒定和計數，對環境微生物群落結構及多樣性的認識是不全面和有選擇性的，方法的分辨水平低。在70和80年代，研究人員通過對微生物化學成分的分析總結出了一些規律性的結論，從而建立了一些微生物分類和定量的方法即生物標記物方法，對環境微生物群落結構及多樣性的認識進入到較客觀的層次上。在80和90年代，現代分子生物學技術以DNA為目標物，通過rRNA基因測序技術和基因指紋圖譜等方法，比較精確地揭示了微生物種類和遺傳的多樣性，並給出了關於群落結構的直觀信息。

㈨ 細胞生物學的研究方法

細胞生物學廣泛地利用相鄰學科的成就，在技術方法上是博採眾長，凡是能夠解決問題的都會被使用。例如用分子生物學的方法研究基因的結構，用生物化學、分子生物學的方法研究染色體上的各種非組蛋白和它們對基因活動的調節和控制或者利用免疫學的方法研究細胞骨架的各種蛋白（微管蛋白、微絲蛋白、各種中等纖維蛋白）在細胞中的分布以及在生命活動中的變化。起源於分子遺傳學的重組DNA技術和起源於免疫學的產生單克隆抗體的雜交瘤技術，也成了細胞生物學的有力工具。顯然，一種方法所解決的問題不一定屬於原來建立這一方法的學科。例如用分子生物學的方法解決了核小體的結構，嚴格地說這應是形態學的范疇。這樣的例子並不少見，在這里學科的界限也被抹掉了。也許可以說細胞核移植、微量注射和細胞融合是細胞生物學自身發展起來的方法，但是用這些方法進行的實驗往往也需要其他方法配合來做進一步分析。 細胞生物學與其說是一個學科，倒不如說它是一個領域。這可以從兩個方面來理解：一是它的核心問題的性質──把發育與遺傳在細胞水平結合起來，這就不局限於一個學科的范圍。二是它和許多學科都有交叉，甚至界限難分。例如，就研究材料而言，單細胞的原生動物既是最簡單的動物，也是最復雜的細胞，因為它們集許多功能於一身；尤其是其中的纖毛蟲，不僅對於研究某些問題，例如纖毛和鞭毛的運動，特別有利，關於發育和遺傳的研究也積累了大量有價值的資料。但是這類研究也可以列入原生動物學的范疇。其次，就研究的問題而言，免疫性是細胞的重要功能之一，細胞免疫應屬細胞生物學的范疇，但這也是免疫學的基本問題。
由於廣泛的學科交叉，細胞生物學雖然范圍廣闊，卻不能像有些學科那樣再劃分一些分支學科──如象細胞學那樣，根據從哪個角度研究細胞而分為細胞形態學、細胞化學等。如果要把它的內容再適當地劃分，可以首先分為兩個方面：一是研究細胞的各種組分的結構和功能（按具體的研究對象），這應是進一步研究的基礎，把它們羅列出來，例如基因組和基因表達、染色質和染色體、各種細胞器、細胞的表面膜和膜系、細胞骨架、細胞外間質等等。其次是根據研究細胞的哪些生命活動劃分，例如細胞分裂、生長、運動、興奮性、分化、衰老與病變等，研究細胞在這些過程中的變化，產生這些過程的機制等。
當然這僅是人為地劃分，這些方面都不是各自孤立的，而是相互有關連的。從細胞的各個組分講，例如表面膜與細胞外間質有密切關系，表面膜又不是簡單地覆蓋著細胞質的一層膜，而是通過一些細微結構──已經知道其中之一是肌動蛋白分子，這又聯繫到細胞骨架了──與細胞質密切相連。這樣，表面膜才能和細胞內部息息相關。另一方面，從研究的問題出發，研究分裂、分化等生命現象，離不開結構的基礎。例如研究細胞分裂就涉及到染色質怎樣包紮成染色體，染色體的分裂和運動，細胞骨架的變化包括微管蛋白的聚合和解聚，與表面膜有關的分裂溝的形成，還有細胞分裂的調節與控制。再如研究細胞分化除去要了解某種細胞在分化過程中細胞器的變化、它們所特有的結構蛋白質的變化，主要地還要了解導致分化的物質基礎以及這些物質怎樣作用於基因調控的水平，導致有關的基因被激活。可見研究的重點盡管可以人為地劃分，但一定要把細胞作為一個整體看待，一定要把生命過程和細胞組分的結構和功能聯系起來。 既然細胞生物學的主要任務是把發育和遺傳聯系起來，細胞分化這個問題的重要性就不言而喻。因為就整個有機體而言，遺傳特點不僅顯示在長成的個體，而是在整個生命過程不斷地顯示出來。在細胞水平，細胞的分化也就是顯示遺傳特徵的過程，例如鳥類、爬行類的水晶體，其中所含的晶體蛋白是α、β、δ三種，不同於哺乳類，後者含有α、β、γ三種。在鳥類的晶體分化中首先出現大量的δ晶體蛋白，但是在哺乳類晶體分化中卻找不到這種蛋白。可見某種細胞的分化特徵的出現，也就是它們的遺傳特徵的出現。但是這僅是在細胞水平就一種生化性狀（特異的蛋白質）在一種特化細胞中的出現而言，情況當然還比較簡單，如果涉及到一個由多細胞組成的形態學性狀，情況會復雜得多，但是性狀發生的過程仍然是遺傳表現的過程。
像晶體細胞分化這樣的例子，細胞生物學的術語稱之為終末分化，也就是走向成熟的分化，其分化的產物就是這種細胞的終末產物。由於取材方便，產物比較單一易於分析等原因，細胞分化的研究中關於終末分化的研究占很大的比重，研究得比較多的是紅細胞、肌細胞、胰臟細胞、晶體細胞、黑色素細胞、軟骨細胞等。
一個經常被引用的例子是紅細胞中血紅素的轉換。人類胚胎早期的紅細胞中首先出現胚期血紅素，後來逐漸被胎兒期血紅素所代替，胎兒三個月之後，後者又被成體型血紅素所代替。關於這些血紅素已經有很多研究。例如它們各自由那些肽鏈組成，這些肽鏈在個體發育中交互出現的情況，它們各自的氨基酸組成和排列順序，各個肽鏈的基因位點，以至基因的結構都已比較清楚，工作可以說是相當深入了。
但是，追根到底有些問題依然沒有得到明確的解答，甚至沒有解答──這也適用於關於其他細胞的終末分化的研究。例如，為什麼胚期血紅素會在紅細胞而不在其他細胞中出現？為什麼會發生血紅素的轉換？關於前一問題，有人曾分別地從雞的輸卵管細胞（不產生血紅素）和紅細胞（產生血紅素）提取染色質，用酶來切割，觀察到兩種來源的染色質對酶的抵抗力不同。來自紅細胞的易於受到酶的攻擊，推測這可能由於核小體的構型不同。紅細胞中含有珠蛋白基因段落的核小體構型較鬆弛，因而易於受到影響；構型較鬆弛也就為RNA聚合酶在上面轉錄產生信使RNA提供了條件。但是如果追問下去，為什麼單單在紅細胞里核小體的構型比較鬆弛？RNA聚合酶怎樣識別出這樣的段落？這些問題還需進一步研究。其次，關於胚期血紅素向胎兒期血紅素的轉換。用兩種熒光染料標記兩種免疫抗體，觀察到在同一紅細胞中有兩種血紅素的存在，說明轉換不是由於出現不同的細胞，而是由於同一細胞相繼地產生了不同的血紅素。是什麼原因使得血細胞停止生產原有的而產生出新的血紅素？也許可以說是發育的「程序」，但還要回答發育程序得以實現的物質基礎是什麼。所有這些問題的解答，將使我們對基因選擇性表達的認識有極大的邁進。 實現了終末分化的細胞，已經失去了轉變為其他細胞類型的潛能，只能向一個方面分化。例如紅細胞，雖然發生血紅素的轉換，但不能轉變為其他類型的正常細胞，與胚胎細胞相比，它們的情況要簡單些，因為胚胎細胞在尚未獲得決定的時候是具有廣泛潛能的。拿中胚層細胞來說，它們既可以分化為肌細胞，也可以分化為前腎細胞、血細胞、間質細胞等。已經初步知道，外界因素可以影響中胚層細胞向肌細胞或紅細胞的方向分化，但是這因素是什麼，怎樣作用，都一無所知。在這里，首先要使中胚層細胞向某一方向分化，然後那一方向（例如紅細胞）所特有的一套終末分化的步驟才得以進行下去。形象化地說，中胚層細胞中似乎存在著向不同方向分化的開關，打開某一個開關（例如紅細胞的），才能進行那一方向的分化，這當然比終末分化更復雜些，對此還一無所知。