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日本寶寶pcr檢測方法

發布時間:2024-02-09 05:47:41

A. 什麼是PCR檢測他的原理是什麼需要什麼材料

B. PCR產物的檢測方法哪些都有什麼原理

1.瓊脂糖凝膠電泳 同時點分子量marker,根據marker條帶判斷產物分子量大小,從而大致判斷是不是你要的
2.酶切 已知你產物的序列,看上面有什麼酶切位點,用一個酶或者兩個酶切斷,看與理論預測的條帶數目和大小是否一致。一般檢測有以上兩步就行了,如果需要知道確切的需要進行3
3.測序 連接到pMD-18t 載體上,轉到大腸桿菌中。拿到公司去測序,測序結果通過gene bank比對看與哪個基因一致,這種方法最准確
4.表達 pcr產物連到真核或者原核表達載體上,適宜條件表達出來以後的蛋白做質譜分析,看與理論產物表達的蛋白是否有一致的片段

C. 如何用PCR方法檢測基因的多樣性

多態性(polymorphism)是指處於隨機婚配的群體中,同一基因位點可存在2種以上的基因型。在人群中,個體間基因的核苷酸序列存在著差異性稱為基因(DNA)的多態性(gene polymorphism)。這種多態性可以分為兩類,即DNA位點多態性(site polymorphism)和長度多態性 (longth polymorphism)。

基因多態性的主要檢測方法簡述如下:
1.限制性片段長度多態性(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP):由DNA 的多態性,致使DNA 分子的限制酶切位點及數目發生改變,用限制酶切割基因組時,���鈉�問�亢兔扛銎�蔚某ざ染筒煌��此�降南拗菩雲�緯ざ榷嗵�裕�賈孿拗破�緯ざ確⑸�謀淶拿蓋形壞悖�殖莆�嗵�暈壞恪W鈐縭怯肧outhern Blot/RFLP方法檢測,後來採用聚合酶鏈反應(PCR)與限制酶酶切相結合的方法。現在多採用PCR-RFLP法進行研究基因的限制性片段長度多態性。

2.單鏈構象多態性(SSCP):是一種基於單鏈DNA構象差別的點突變檢測方法。相同長度的單鏈DNA如果順序不同,甚至單個鹼基不同,就會形成不同的構象。在電泳時泳動的速度不同。將PCR產物經變性後,進行單鏈DNA凝膠電泳時,靶DNA中若發生單個鹼基替換等改變時,就會出現泳動變位(mobility shift),多用於鑒定是否存在突變及診斷未知突變。

3.PCR-ASO探針法(PCR-allele specific oligonucleotide, ASO):即等位基因特異性寡核苷酸探針法。在PCR擴增DNA片段後,直接與相應的寡核苷酸探雜交,即可明確診斷是否有突變及突變是純合子還是雜合子。其原理是:用PCR擴增後,產物進行斑點雜交或狹縫雜交,針對每種突變分別合成一對寡核苷酸片段作為探針,其中一個具有正常序列,另一個則具有突變鹼基。突變鹼基及對應的正常鹼 基勻位於寡核苷酸片段的中央,嚴格控制雜交及洗脫條件,使只有與探針序列完全互補的等位基因片段才顯示雜交信號,而與探針中央鹼基不同的等位基因片段不顯示雜交信號,如果正常和突變探針都可雜交,說明突變基因是雜合子,如只有突變探針可以雜交,說明突變基因為純合子,若不能與含有突變序列的寡核苷探針雜交,但能與相應的正常的寡核苷探針雜交,則表示受檢者不存在這種突變基因。若與已知的突變基因的寡核苷探針勻不能雜交,提示可能為一種新的突變類型。

4. PCR-SSO法:SSO技術即是順序特異寡核苷酸法(Sequence Specific Oligonucleotide, SSO)。原理是PCR基因片段擴增後利用序列特異性寡核苷酸探針,通過雜交的方法進行擴增片段的分析鑒定。探針與PCR產物在一定條件下雜交具有高度的特異性,嚴格遵循鹼基互補的原則。探針可用放射性同位素標記,通過放射自顯影的方法檢測,也可以用非放射性標記如地高辛、生物素、過氧化物酶等進行相應的標記物檢測。

5. PCR-SSP法:序列特異性引物分析即根據各等位基因的核苷酸序列,設計出一套針對每一等位基因特異性的(allele-specific)、或組特異性 (group-specific)的引物,此即為序列特異性引物(SSP)。SSP只能與某一等位基因特異性片段的鹼基序列互補性結合,通過PCR特異性地擴增該基因片段,從而達到分析基因多態性的目的。

6. PCR-熒光法:用熒游標記PCR引物的5』端,熒光染料FAM和JOE呈綠色熒光,TAMRA呈紅色熒光,COUM 呈蘭色熒光,不同熒游標記的多種引物同時參加反應,PCR擴增待檢測的DNA,合成的產物分別帶有引物5』端的染料,很容易發現目的基因存在與否。

7. PCR-DNA測序:是診斷未知突變基因最直接的方法,由於PCR技術的應用,使得DNA 測序技術從過去的分子克隆後測序進入PCR直接測序。PCR產物在自動測序儀上電泳後測序。常用方法有:Sanger雙脫氧末端終止法;Maxam-Gilbert化學裂解法;DNA測序的自動化。目前DNA順序全自動激光測定法是最先進的方法。

8. PCR指紋圖法(PCR-fingerprints):實用於快速的同種異型DR/Dw配型。在DR/DW純合子及雜合子個體中,每種DR單倍型及每種單倍型組合所產生的單鏈環狀結構的大小、數目和位置各異,由於同質雙鏈和異質雙鏈之間的分子構象不同。因此,在非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳時,它們的遷移率各不相同,從而獲得單倍型特異的電泳帶格局即PCR指紋。也有人用人工合成的短寡核苷酸片段作為探針,同經過酶切的人體DNA作Southern blot,可以得出長度不等的雜交帶,雜交帶的數目和分子量的大小具有個體特異性,除非同卵雙生,幾乎沒有兩個人是完全相同的,就象人的 指紋一樣,人們把這種雜交帶圖形稱為基因指紋(gene finger-printing)。

9. 基因晶元法:又稱為DNA 微探針陣列(Micro array)。它是集成了大量的密集排列的大量已知的序列探針,通過與被標記的若干靶核酸序列互補匹配,與晶元特定位點上的探針雜交,利用基因晶元雜交圖象,確定雜交探針的位置,便可根據鹼基互補匹配的原理確定靶基因的序列。這一技術已用於基因多態性的檢測。對多態性和突變檢測型基因晶元採用多色熒光探針雜交技術可以大大提高晶元的准確性、定量及檢測范圍。應用高密度基因晶元檢測單鹼基多態性,為分析SNPs提供了便捷的方法。

10. AFLP(Amplication Fragment Length Polymorphism)法
AFLP技術是一項新的分子標記技術,是基於PCR技術擴增基因組DNA限制性片段,基因組DNA先用限制性內切酶切割,然後將雙鏈接頭連接到DNA片段的末端,接頭序列和相鄰的限制性位點序列,作為引物結合位點。限制性片段用二種酶切割產生,一種是罕見切割酶,一種是常用切割酶。它結合了RFLP和PCR技術特點,具有RFLP技術的可靠性和PCR技術的高效性。由於AFLP擴增可使某一品種出現特定的DNA譜帶,而在另一品種中可能無此譜帶產生,因此,這種通過引物誘導及DNA擴增後得到的DNA多態性可做為一種分子標記。AFLP可在一次單個反應中檢測到大量的片段。以說AFLP技術是一種新的而且有很大功能的DNA指紋技術。

11. DGGE(denaturing gradinent electrophoresis,DGGE)法
變性梯度凝膠電泳法() DGGE法分析PCR產物,如果突變發生在最先解鏈的DNA區域,檢出率可達100%,檢測片段可達1kb,最適圍為100bp-500bp。基本原理基於當雙鏈DNA在變性梯度凝膠中進行到與DNA變性濕度一致的凝膠位置時,DNA發生部分解鏈,電泳適移率下降,當解鏈的DNA鏈中有一個鹼基改變時,會在不同的時間發生解鏈,因影響電泳速度變化的程度而被分離。由於本法是利用溫度和梯度凝膠遷移率來檢測,需要一套專用的電泳裝置,合成的PCR引物最好在5`末端加一段40bp-50bp的GC夾,以利於檢測發生於高熔點區的突變。在DGGE的基礎上,又發展了用濕度梯度代替化學變性劑的TGGE法(溫度梯度凝膠電泳temperature gradient gelelectrophoresis,TGGE)。DGGE和TGGE均有商品化的電泳裝置,該法一經建立,操作也較簡便,適合於大樣本的檢測篩選。
12. RAPD(Random amplified polymorphic DNA)法
運用隨機引物擴增尋找多態性DNA片段可作為分子標記。這種方法即為RAPD( Random amplified polymorphic DNA,隨機擴增的多態性DNA)。盡管RAPD技術誕生的時間很短, 但由於其獨特的檢測DNA多態性的方式以及快速、簡便的特點,使這個技術已滲透於基因組研究的各個方面。該RAPD技術建立於PCR技術基礎上,它是利用一系列(通常數百個)不同的隨機排列鹼基順序的寡聚核苷酸單鏈(通常為10聚體)為引物,對所研究基因組DNA進行PCR擴增.聚丙烯醯胺或瓊脂糖電泳分離,經EB染色或放射性自顯影來檢測擴增產物DNA片段的多態性,這些擴增產物DNA片段的多態性反映了基因組相應區域的DNA多態性。RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同,但對於任一特異的引物,它同基因組DNA序列有其特異的結合位點.這些特異的結合位點在基因組某些區域內的分布如符合PCR擴增反應的條件,即引物在模板的兩條鏈上有互補位置,且引物3'端相距在一定的長度范圍之內,就可擴增出DNA片段.因此如果基因組在這些區域發生DNA片段插入、缺失或鹼基突變就可能導致這些特定結合位點分布發生相應的變化,而使PCR產物增加、缺少或發生分子量的改變。通過對PCR產物檢測即可檢出基因組DNA的多態性。分析時可用的引物數很大,雖然對每一個引物而言其檢測基因組DNA多態性的區域是有限的,但是利用一系列引物則可以使檢測區域幾乎覆蓋整個基因組。因此RAPD可以對整個基因組DNA進行多態性檢測。另外,RAPD片段克隆後可作為RFLP的分子標記進行作圖分析。

D. PCR實驗方法步驟

PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途,下面小編就向大家介紹PCR實驗方法步驟:

方法

E. 核酸病毒檢測有PCR和快檢,這兩個檢測方式有什麼區別

檢驗核酸病毒有PCR和快檢兩種方式,一般常規PCR檢測是在樣品採集之後,要對樣品進行核酸純化,再進行後續的PCR反應,在這個過程中大約需要30~60分鍾。在進行PCR檢測的過程中,可以進行多個樣本的檢測,PCR反應的時間大約在兩個小時左右。不同醫院的儀器設備不同,儀器的好壞能夠影響檢測樣本的多少,通常一個反應板可以同時檢測96個樣品。

醫護人員採集人們的少量咽拭子,根據其中病毒的濃度來確定是否是陽性,還是陰性。新冠肺炎病毒的核酸物質主要是RNA,在檢驗過程中通過技術可以將RNA進行逆轉錄,轉化為DNA。 PCR技術可以通過特殊的酶在生物體外,對轉錄的DNA片段進行復制,再將DNA片段擴大,從而達到檢測的目的。選擇核酸檢測的方式主要根據自己情況而定,主要依靠醫生的判斷。

F. PCR檢查是查什麼的

PCR是現在實驗室常用的技術手段之一。一般用於病原的檢測,分子機制中各基因的檢測以及遺傳相關的檢測。
感染性疾病
PCR在醫學檢驗學中最有價值的應用領域就是對感染性疾病的診斷。理論上,只要樣本有一個病原體存在,PCR就可以檢測到。一般實驗室也能檢出10~100基因拷貝,而目前病原體抗原檢測方法一般需要105-7個病原體才可檢測到。PCR對病原體的檢測解決了免疫學檢測的「窗口期」問題,可判斷疾病是否處於隱性或亞臨床狀態。
定量PCR研究資料已表明,病原體數量與感染性疾病病情的輕重程度、傳染性及治療效果均有相關性。許多研究表明,人類免疫缺陷病毒(HIV)感染後,潛伏期長短和臨床症狀輕重與血液中的病毒量顯著相關;也有研究表明,HIV病毒載量低於一定值時,沒有傳染性。
在乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒定量研究中發現,病毒的數量與某些葯物的療效相關。例如,干擾素治療對肝炎病毒高拷貝者不敏感,低拷貝者敏感;而有些葯物則具有顯著降低病毒高拷貝的作用。
腫瘤
癌基因的表達增加和突變,在許多腫瘤早期和良性的階段就可出現。PCR技術不但能有效的檢測基因的突變,而且能准確檢測癌基因的表達量,可據此進行腫瘤早期診斷、分型、分期和預後判斷。
幾乎所有慢性骨髓性白血病患者都可檢測到原癌基因易位導致的BCR/ABL融合基因形成,定量PCR技術可通過檢測BCR/ABL融合基因的表達確定微量殘余惡性細胞存在的數量,以此作為治療效果和估計復發的危險性的依據。
一些病毒致癌作用也與病毒載量有關,EB病毒載量的FQ-PCR檢測結果已被用於鼻咽癌早期發現和隨訪。
遺傳病
PCR技術首次臨床應用就是從檢測鐮狀細胞和β-地中海貧血的基因突變開始的。基因的突變和缺失均會引起各種珠蛋白的表達不平衡,用FQ-PCR檢測各種珠蛋白基因表達差異,是地中海貧血診斷的有效手段

G. pcr核酸檢測是什麼意思方法及步驟

核酸檢測是目前全球用來對是否攜帶新冠病毒進行確定的一種有效方式。目前大家主要使用的是鼻拭子、咽拭子以及抗體血清lgm進行參考。但是根據最新的新加坡入境要求是進行pcr核酸檢測,那麼pcr核酸檢測是什麼意思呢?

pcr核酸檢測是什麼意思

PCR的意思是聚合酶鏈式反應,能夠用來擴增DNA,從而將微量的DNA擴增到能夠檢測的程度。有些病毒的核酸是DNA,需要採用這個方法進行檢測。所以PCR並不是進行的檢查,而是檢測DNA的一種方法。比如乙肝病毒DNA定量,用的就是這一種方法。檢查DNA的目的,一方面是可以診斷疾病,如果連病原體的DNA都能檢測到,就說明感染了這種病原體;另一方面是判斷病毒復制的多少,從而判斷病情嚴重程度或者治療效果。

pcr核酸檢測方法與步驟

進行核酸檢驗,需要經過取樣、留樣、留存、核酸提取、上機檢測五個步驟。

核酸檢測的第一步就是採集人體分泌物,用鼻試子或咽試子擦拭鼻腔或咽後壁及雙側咽扁桃體處。

第二步醫務人員進行留樣,將試子頭浸入細胞保存液中,折斷尾部後立即旋緊管蓋。

第三部要將樣本放入密閉袋中,保存好並及時送檢。

第四步將樣本送進實驗室,提取核酸。

第五步,將提取物進行熒光PCR擴增反應。

核酸是什麼

核酸(nucleicacid),是一類由核苷酸(nucleotide)構成的生物大分子,分為核糖核酸(ribonucleic
acid,宴前者RNA)和脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic
acid,DNA)兩類,其中RNA多為單鏈結構,DNA多為雙鏈結構。除朊病毒(prion)外,核酸是構成生命所必需的生物大分子,其主要作用是構成生命體的遺傳信息載體,除此之外,還有部分核酸可作為及參與構成具有生物活性的酶分子或晌薯其他分子機器

核酸檢測是什麼

核酸檢測顧名思義就是針對核酸開展檢測。

核酸檢測有何獨特的優勢呢?為何能作為新冠病毒確診的「金標准」呢?

其實每一種檢測方法都有其擅長的應用場景。以病毒檢測為例,通常的免疫學檢測方法(膠體金、ELISA、化學發光等)的檢測對象是病毒的抗原或抗體,相當於「側面描繪」。由於從感染到可檢測存在一個時間窗口期,因此免疫學檢測方法一般不合適作為早期診斷。

假陽性與假陰性

1、假陽性

假陽性通常比較少。一般實驗室人員操作不當會導致樣本間交叉污染或擴增產物的遺留污染,該種情況下可能會導致假陽性。

不過假陽性可以通過嚴格控制檢測流程、以及執行若干個陰性樣本隨機參與檢測的策略而有效規避。

2、假陰性

在這里需要說明的是,PCR檢測的假陰性與臨床的假陰性實際上不是一個概念。

以網路上激烈討論的新冠病毒的診斷為例,臨床假陰性是指臨床症狀和影像學高度疑似被感染、但PCR檢測卻多次或始終為陰性的情況;而PCR檢測假陰性是指所採集樣本中存在足夠量的新型冠狀病毒但卻沒有檢出悔簡的情況。

避免核酸檢測的假陰性,主要需要解決:(1)被感染者的細胞中有足量的病毒、(2)採集樣本中可以採集到含有病毒的細胞、以及(3)檢測出樣本中的病毒這三個環節。

其中PCR試劑盒的技術參數優劣主要影響第三個檢測環節。

僅針對第三個檢測環節,若樣本中病毒數量低於一個程度(低於最低檢測限),PCR試劑盒就無法檢出。從這個角度看,PCR檢測的假陰性是無法完全避免的。這也是為何需要補充開發病毒的特異抗體檢測的原因所在。

沈陽PCR核酸檢測實驗室

實驗室建設堅持高標准、嚴要求,嚴格按照國家《醫學生物安全二級實驗室建築技術標准》進行建設,建設面積100餘平方米,分為試劑貯存和准備區、標本制備與提取區、擴增和產物分析區三個區域。實驗室內配置全自動核酸提取儀、實時熒光定量PCR儀、擴增儀、高壓滅菌器、B2型生物安全櫃、超凈工作台、超低溫冰箱等儀器,消毒和防護設施齊全,符合相關生物實驗室安全標准。為防止實驗室外的區域被污染,實驗室的氣壓均為負壓,有效降低感染風險。此外,實驗室配備了污水處理系統,達到了廢液的合理排放和處理。

*目前我國多地區建設了PCR核酸檢測實驗室用以進行新冠病毒核酸檢測

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