rna融合基因檢測方法

A. RNA的測序原理及方法！^~^

細胞中的RNA可以分為信使RNA、轉運RNA和核糖體RNA三大類，不同組織總RNA提取的實質就是將細胞裂解，釋放出RNA，並通過不同方式去除蛋白，DNA等雜質，最終獲得高純度RNA產物的過程。

RNA 提取流程
1. 樣品處理
從各種不同來源樣品（如細菌、酵母、血液、動物組織、植物組織和培養細胞）,或同一來源樣品的不同組織（如植物幼嫩葉片、成熟根、莖等）中提取高質量的RNA，因細胞結構及所含的成分不同，樣品預處理的方式也各有差異。
樣品的要求：
最好使用新鮮的樣品或取樣後立即在低溫（-20℃或-70℃）冷凍保存的樣品，避免反復凍融，因為這會導致提取的RNA降解和提取量下降。
樣品預處理方式：
植物材料-液氮研磨
動物材料-勻漿、液氮研磨
細菌-溶菌酶破壁
酵母-液氮研磨、玻璃珠處理、混合酶破壁
2. 細胞裂解
異硫氰酸胍/苯酚法（TRIZOL）
這是一種傳統的RNA提取方法，適用於大部分動植物材料，但對於次生代謝產物較多的植物材料提取RNA效果較差。異硫氰酸胍能使核蛋白復合體解離，並將RNA釋放到溶液中，採用酸性酚-氯仿混合液抽提，低PH值的酚將使RNA進入水相，而蛋白質和DNA仍留在有機相，從而可以完成RNA的提取工作。
該法應用非常廣泛，適用於包括動物組織、微生物、培養細胞等在內的各類動物性材料，同時還適用於次生代謝物較少的植物性材料，如幼苗、幼葉等。該法主要應用在動物組織和培養細胞的RNA提取中。
胍鹽/ β- 巰基乙醇法：
適用於各種不同動物材料和次生代謝物少的植物材料。
在這種方法中，胍鹽使細胞充分裂解，β-巰基乙醇作為蛋白的變性劑在實驗全程中可以抑制RNaseA的活性，保護RNA不被降解。
我公司的「GREEN 」系列總RNA 提取試劑盒是基於這種方法開發的產品，分別適用於各類不同的材料。此系列產品的具體實驗步驟和適用范圍在實驗技術手冊中有詳細介紹，實驗者可根據自己的需要進行選擇。
其它方法：
有些植物材料多糖多酚含量較高，如植物果實，番茄的葉子等，有些植物木質化程度較高，如根莖等組織。針對這類材料本公司推出了一種全新的植物總RNA提取試劑，該試劑特別適合於從富含多糖、多酚、澱粉的材料中提取純度高、完整性好的總RNA，有關的具體步驟將在分論中詳細介紹，實驗者可根據自己的需要進行選擇。

3. RNA 純化及獲得
純化要求
RNA樣品中不應存在對酶（如逆轉錄酶）有抑製作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子。避免其它生物大分子如蛋白質、多糖和脂類分子的污染。排除DNA分子的污染。
純化方法及沉澱
方法一：有機溶劑抽提法
氯仿抽提
在使用RNA提取試劑進行RNA提取時，常使用氯仿進行抽提，以去除蔗糖、蛋白等雜質，並促進水相與有機相的分離，從而達到純化RNA的方法。在本公司的提取RNA的產品中，與TRIzol同型試劑法及其衍生試劑盒。
沉澱
氯仿抽提RNA後，一般採用了異丙醇或乙醇來沉澱水相RNA。加入0.6倍水相體積的異丙醇或與水相等體積的異丙醇，室溫沉澱20-30分鍾，高速離心，可獲得RNA沉澱。
洗滌沉澱
加入無RNase的75%乙醇，將RNA沉澱振盪懸浮，使RNA沉澱中的鹽離子被充分溶解。然後再離心10-30分鍾。再次沉澱RNA。離心後，小心倒掉上清（注意不要倒出RNA沉澱），隨後快速離心1-2秒，將殘留在管壁上的乙醇手機到管底後，用小槍頭吸凈，超靜台中風干1-2分鍾（注意不要晾得太干，否則RNA沉澱不易溶解）。
溶解沉澱
加入適量RNase-free ddH2O溶解RNA沉澱。
方法二：硅基質吸附法
隨著實驗方法的改進，現已發展出一種採用吸附材料純化核酸的方法。目前較常見的有：硅基質吸附材料、陰離子交換樹脂和磁珠等。硅基質吸附材料因其具有可特異吸附核酸，使用方便、快捷、不使用有毒溶劑如苯酚、氯仿等優點，成為核酸純化的首選。
本公司生產的總RNA提取試劑盒（ZP403-ZP407）和GREENspin系列總RNA提取試劑盒即採用硅基質吸附達到RNA分離純化目的，通過專一結合RNA的離心吸附柱和獨特的緩沖液系統，使樣品在高鹽條件下與硅膠膜特異結合，而蛋白、有機溶劑等雜質不能結合到膜上而被洗脫，鹽類則被含有乙醇的漂洗液洗滌，最後用RNase-free ddH2O將RNA從硅膠膜上洗脫下來。

B. 小分子RNA的檢測方法

實時熒光定量PCR技術是1996年由美國Applied biosystems公司推出在定性PCR技術基礎上發展起來的核酸定量技術。該技術在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，使每一個循環變得「可見」，最後通過Ct值和標准曲線對樣品中的DNA (或cDNA) 的起始濃度進行定量的方法。實時熒光定量PCR是目前確定樣品中DNA (或cDNA)拷貝數最敏感、最准確的方法。
目前市場上miRNA qPCR檢測方法主要有以下兩種：1. 兩步法； 2.三步加尾法。兩種方法的主要差別在於qPCR之前的cDNA制備過程（如圖）。其中兩步法是通過獨特設計的莖環結構引物進行反轉錄將miRNA反轉錄成cDNA。而三步法則是給miRNA序列加polyA尾，之後再利用反轉錄過程將miRNA反轉錄成cDNA並加上獨特設計的尾部序列。

兩步法的優勢在於特異性很高，但是最新的研究報道顯示在編輯過程中，miRNA 的3』序列的多樣化現象(Heterogeneity)，這種現象的發生使得目前市場上qPCR兩步檢測法的准確性受到影響（如圖）。而三步法則不受這一現象的影響，而且隨著科學家們的不斷摸索創新，三步法的特異性如今已經可以和兩步法媲美。更重要的是低廉的價格也是三步檢測法越來越受到廣大研發人員喜愛的重要原因。

C. 基因檢測方法有哪些

基因是遺傳的基本單元，攜帶有遺傳信息的DNA或RNA序列，通過復制，把遺傳信息傳遞給下一代，指導蛋白質的合成來表達自己所攜帶的遺傳信息，從而控制生物個體的性狀表達。基因檢測是通過血液、其他體液、或細胞對DNA進行檢測的技術，是取被檢測者外周靜脈血或其他組織細胞，擴增其基因信息後，通過特定設備對被檢測者細胞中的DNA分子信息作檢測，分析它所含有的基因類型和基因缺陷及其表達功能是否正常的一種方法，從而使人們能了解自己的基因信息，明確病因或預知身體患某種疾病的風險。
基因檢測可以診斷疾病，也可以用於疾病風險的預測。疾病診斷是用基因檢測技術檢測引起遺傳性疾病的突變基因。應用最廣泛的基因檢測是新生兒遺傳性疾病的檢測、遺傳疾病的診斷和某些常見病的輔助診斷。
一般有三種基因檢測方法：生化檢測、染色體分析和DNA分析。
1.生化檢測
生化檢測是通過化學手段，檢測血液、尿液、羊水或羊膜細胞樣本，檢查相關蛋白質或物質是否存在，確定是否存在基因缺陷。用於診斷某種基因缺陷，這種缺陷是因某種維持身體正常功能的蛋白質不均衡導致的，通常是檢測測試蛋白質含量。還可用於診斷苯丙酮尿症等。
2.染色體分析
染色體分析直接檢測染色體數目及結構的異常，而不是檢查某條染色體上某個基因的突變或異常。通常用來診斷胎兒的異常。
常見的染色體異常是多一條染色體，檢測用的細胞來自血液樣本，若是胎兒，則通過羊膜穿刺或絨毛膜絨毛取樣獲得細胞。將之染色，讓染色體凸顯出來，然後用高倍顯微鏡觀察是否有異常。
3.DNA分析
DNA分析主要用於識別單個基因異常引發的遺傳性疾病，如亨廷頓病等。DNA分析的細胞來自血液或胎兒細胞。
基因檢測可以分為以下五類：
1.基因篩檢
主要是針對特定團體或全體人群進行檢測。大多數通過產前或新生兒的基因檢測以達到篩檢的目的。
2.生殖性基因檢測
在進行體外人工授精階段可運用，篩檢出胚胎是否帶有基因變異，避免胎兒患有遺傳性疾病。
3.診斷性檢測
多數用來協助臨床用葯指導。
4.基因攜帶檢測
基因攜帶者如果與某些特殊基因相結合，可能會導致下一代患基因疾病，通過基因攜帶者的檢測可篩檢出此種可能，作為基因攜帶者婚前檢查、生育時的參考。
5.症狀出現前的檢測
檢測目的是了解健康良好者是否帶有某種突變基因，而此基因與特定疾病的發生有密切的聯系。
臨床意義
1.用於疾病的診斷
如對結核桿菌感染的診斷，以前主要依靠痰、糞便或血液培養，整個檢驗流程需要在兩周以上，採用基因診斷的方法，不僅敏感性大大提高，而且在短時間內就能得到結果。
2.了解自身是否有家族性疾病的致病基因，預測患病風險
資料證實10%～15%的癌症與遺傳有關，糖尿病、心腦血管疾病等多種疾病都與遺傳因素有關。如具有癌症或多基因遺傳病（如老年痴呆、高血壓、糖尿病等）的人可找出致病的遺傳基因，就能夠有針對性地調整生活方式，預防或者延緩疾病的發生。
3.正確選擇葯物，避免濫用葯物和葯物不良反應
由於個體遺傳基因上的差異，不同的人對外來物質產生的反應也會有所不同，因此部分患者使用正常劑量的葯物時，可能會出現葯物過敏、紅腫發疹的現象。根據基因檢測的結果，可制定特定的治療方案，從而科學地指導使用葯物，避免葯物毒副反應。