A. 根據檢測原理不同,食品中抗生素殘留的檢測方法可分為哪幾種
分為四種：酶抑制率法 分光光度法 膠體金法 滴定分析法
酶抑制率法
在一定條件下，有機磷和氨基甲酸酯類農葯對膽鹼酯酶正常功能有抑製作用，其抑制率與農葯的濃度呈正相關。正常情況下，酶催化神經傳導代謝產物（乙醯膽鹼）水解，其水解產物與顯色劑反應，產生黃色物質，在412nm處測定吸光度隨時間的變化值，計算出抑制率，通過抑制率可以判斷出樣品中是否有高劑量的有機磷或氨基甲酸酯類農葯的存在。
分光光度法
不同的物質由於其分子結構不同，對不同波長光的吸收能力也不同，因此具有其特有的吸收光譜。即使是相同的物質由於其含量不同，對光的吸收程度也不同。標准曲線法就是利用這一特性來測定物質含量，先配製一系列濃度由小到大的標准溶液，分別測定出它們的A值，以A值為橫坐標，濃度為縱坐標，作標准曲線。在測定待測溶液時，操作條件應與製作標准曲線時相同，以待測液的A值從標准曲線上查出該樣品的相應濃度。
膠體金法
將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在膜上，膠體金標記試劑（抗體或單克隆抗體）吸附在結合墊上，當待檢樣本加到試紙條一端的樣本墊上後，通過毛細作用向前移動，溶解結合墊上的膠體金標記試劑後相互反應，再移動至固定的抗原或抗體的區域時，待檢物與金標試劑的結合物又與之發生特異性結合而被截留，聚集在檢測帶上，產生顯色反應。當光源照射到檢測帶，反射光被收集並轉化為電信號，根據信號的強弱即可判斷被測物質的陰陽性。
滴定分析法
滴定分析法是將一種已知准確濃度的試劑溶液，滴加到被測物質的溶液中，直到所加的試劑與被測物質按化學計量定量反應為止，根據試劑溶液的濃度和消耗的體積，計算被測物質的含量。
B. 求助生物素-親和素標記技術的優缺點
BAS在實際應用中所具有的巨大優越性，主要表現在以下幾個方面。
靈敏度
生物素容易與蛋白質和核酸類等生物大分子結合，形成的生物素衍生物，不僅保持了大分子物質的原有生物活性，而且比恬度高，具多價性。此外，每個親和素分子有四個生物素結合部位，可同時以多價形式結合生物素化的大分子衍生物和標記物。因此，BAS具有多級放大作用，使其在應用時可極大地提高檢測方法的靈敏度。
特異性
親和素與生物素間的結合具有極高的親和力，其反應呈高度專一性。因此，BAS的多層次放大作用在提高靈敏度的同時，並不增加非特異性干擾。而且，BAS結合特性不會因反應試劑的高度稀釋而受影響，使其在實際應用中可最大限度地降低反應試劑的非特異作用。
穩定性
親和素結合生物素的親和常數可為抗原-抗體反應的百萬倍，二者結合形成復合物的解離常數很小，呈不可逆反應性；而且酸、鹼、變性劑、蛋白溶解酶以及有機溶劑均不影響其結合。因此，BAS在實際應用中，產物的穩定性高，從而可降低操作誤差，提高測定的精確度。
普適性
生物素-親和素系統的多功能性還能提供一套統一的研究方法。例如對於某待測分子，已經得到了對於該分子的生物素標記抗原，那麼配合結合親和素的膠體金可以在電鏡下觀測，配合結合熒游標記的親和素可以使用流式細胞儀篩選，配合連接到酶的親和素可以進行ELISA等免疫組化實驗。
其他
BAS可依據具體實驗方法要求製成多種通用性試劑（如生物素化第二抗體等）適用於不同的反應體系，而且都可高度稀釋，用量很少，實驗成本低；尤其是BAS與成本高昂的抗原特異性第一抗體偶聯使用，可使後者的用量大幅度減少，節約實驗費用．此外，由於生物素與親和素的結合具高速、高效的特性，盡管BAS的反應層次較多，但所需的溫育時間不長，實驗往往只需數小時即可完成
C. 生物素標記的DNA探針用什麼方法檢測
生物素標記的DNA探針用什麼方法檢測
以病原微生物DNA或RNA的特異性片段為模板,人工合成的帶有放射性或生物素標記的單鏈DNA片段,可用來快速檢測病原體.
怎麼檢測：
將一段已知序列的多聚核苷酸用同位素、生物素或熒光染料等標記後製成的探針.可與固定在硝酸纖維素膜的DNA或RNA進行互補結合,經放射自顯影或其他檢測手段就可以判定膜上是否有同源的核酸分子存在.
以細菌為例,目前分子雜交技術用於細菌的分類和菌種鑒定比之G+C百分比值要准確的多,是細菌分類學的一個發展方向.加之分子雜交技術的高敏感性,分子雜交在臨床微生物診斷上具有廣闊的前景.細菌的基因組大小約5×106bp,約含3000個基因.（各種細菌之間絕大部分DNA是相同的,要獲得某細菌特異的核酸探針,通常要採取建立細菌基因組DNA文庫的辦法,即將細菌DNA切成小片段後分別克隆得到包含基因組的全信息的克隆庫.然後用多種其它菌種的DNA作探針來篩選,產生雜交信號的克隆被剔除,最後剩下的不與任何其它細菌雜交的克隆則可能含有該細菌特異性DNA片段.將此重組質粒標記後作探針進一步鑒定,亦可經DNA序列分析鑒定其基因來源和功能.）括弧里比較重要!
D. 凝膠遷移實驗（EMSA） 的原理及實驗方案詳解
對於新手小白做這些大實驗時可能不知所措，為了方便學習，將相關實驗進行歸納總結:
凝膠遷移或電泳遷移率實驗（EMSA）是一種研究DNA結合蛋白和其相關的DNA結合序列相互作用的技術，可用於定性和定量分析。這一技術最初用於研究DNA結合蛋白，已用於研究RNA結合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。
需要兩個試劑盒 碧雲天（GS008 GS009）:一個用於生物素標記 ，一個用於凝膠遷移實驗
配備TBE緩沖液可以配置成 5× 或者 10×的儲液。
10x TBE 儲液配製方法：
將Tris（FW=121）108g，硼酸（FW=61.8）55g，40 ml 0.5 M EDTA 溶解在600 ml的去離子水中；而後調節pH至8.3，加去離子水定容至1L後，室溫保存。使用時稀釋10倍 即為1×TBE Buffer。
（1）設計重組引物TF-F，R，進行PCR擴增，PCR產物純化回收。
（2）使用NEB限制性內切酶將pet28a載體線性化，並進行純化回收。
（3）利用重組試劑盒進行重組反應(Vazyme, C112-02）。
（4）將反應體系加入DH5α感受態中，進行轉化，塗板，挑斑檢測。挑選陽性菌液過夜培養，提質粒，-20℃保存備用。
參照康為世紀試劑盒：His-tag 標簽蛋白純化試劑盒（可溶性蛋白）
（1）使用1xTEN buffer溶解單鏈探針，將互補的單鏈探針按1:1混勻。
（2）95℃加熱10分鍾，自然降溫到15-25℃。
（3）取出退火探針，加入適量的1 x TEN buffer稀釋濃度至3-4pmol/ µl.。
（4）將100ng退火探針置於無酶的PCR管中，加去ddH2O補至10 µl。
（5）按以下體系將各組分混合，37℃孵育30分鍾
a. 參考上表設置反應體系。註：對於雙鏈的EMSA探針的標記反應，建議一次做兩管，即總體積共100µl，以最終獲得足夠的生物素標記EMSA探針用於後續EMSA檢測。
b. 用槍輕輕吹打混勻，切勿vortex。37ºC孵育30分鍾。
c. 加入2.5µl 探針標記終止液，輕輕混勻終止反應。
a. 探針標記反應終止後，加入52.5µl氯仿-異戊醇(24:1)，vortex使有機相和水相充分混合以抽提TdT(說明：靜止後有機相和水相會很快分層)。
b. 12000-14000g離心1-2分鍾。吸取上清備用。上清即為被生物素標記的單鏈DNA探針。
通常為實驗簡便起見，可以不必純化標記好的探針。有些時候，純化後的探針會改善後續實驗的結果。如需純化，可以按照如下步驟操作：
a. 對於100µl標記好的探針，加入1/4體積即25µl的5M醋酸銨，再加入2體積即200µl的無水乙醇，混勻。
b. -70ºC至-80ºC沉澱1小時，或-20ºC沉澱過夜。
c. 4ºC，12,000g-16,000g離心30分鍾。小心去除上清，切不可觸及沉澱。
d. 4ºC，12,000g-16,000g離心1分鍾。小心吸去殘余液體。微晾乾沉澱，但不宜過分乾燥。 e. 加入50µl TE，完全溶解沉澱。標記好的探針可以-20ºC保存。
a. 取5µl Biotin-Control Oligo (0.4µM)，加入196µl TE，混勻，稀釋成10nM Biotin-Control Oligo(作為標准品)。取出適量10nM Biotin-Control Oligo，依次稀釋成5nM、2.5nM、1nM、0.5nM和0.25nM。
b. 取3µl步驟3B所獲得的生物素標記的DNA探針(100nM)，加入27µl TE，混勻，稀釋成10nM 生物素標記的探針(作為待測樣品)。取出適量的10nM 生物素標記的探針，依次稀釋成5nM、2.5nM、1nM、0.5nM和0.25nM。
c. 參考下面的表格，取一適當大小的帶正電荷尼龍膜，在膜上做好相應標記。對於經過梯度稀釋的標准品和待測樣品，分別取2µl滴加到膜上。在膜上滴加標准品或待測樣品時，請注意使液滴充分被膜吸收，在膜上形成一個濕的圓形小斑點。說明：如果條件許可，可以使用專門用於點雜交或狹縫雜交的設備進行探針標記效率的檢測，探針的用量參考下表，濃度可以再稀釋50倍，而所用體積可以相應放大50倍至100µl。
a. 對於步驟2B標記好的單鏈DNA探針，把正義鏈和反義鏈等體積混合(不可根據標記效率調整摩爾比例)。對於最初使用變性的雙鏈EMSA探針進行探針標記的情況，直接進入下一步。
b. 加入退火緩沖液(10X)，使退火緩沖液的最終濃度為1X，混勻。例如待退火探針的體積為100微升，則加入11微升退火緩沖液(10X)。
c. 如下設置PCR儀進行退火反應：
注1：如果所用的PCR儀不具備下降0.1ºC的功能，也可以設置為每90秒下降1ºC。
d. 退火反應結束後，-20ºC保存標記好的EMSA探針。此時的EMSA探針已經可以直接用於後續的EMSA檢測，也可以對探針進行適當純化後再進行EMSA檢測。
a. 准備好倒膠的模具。可以使用常規的制備蛋白電泳膠的模具(例如BioRad的常規用於蛋白電泳的制膠裝置)，或其它適當的模具。最好選擇可以灌制較薄膠的模具，以便於干膠等後續操作。為得到更好的結果，可以選擇可灌制較大EMSA膠的模具。制膠前必須把制膠模具沖洗干凈，需特別注意不能有SDS殘留。
b. 按照如下配方配製20ml 4%的聚丙烯醯胺凝膠(注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis對結果影響不大)。
注意：此實驗中需去除SDS變性劑
c. 按照上述順序依次加入各種試劑，加入TEMED前先混勻，加入TEMED後立即混勻，並馬上加入到制膠的模具中。避免產生氣泡，並加上梳齒。如果發現非常容易形成氣泡，可以把一塊制膠的玻璃板進行硅烷化處理
b. 按照上述順序依次加入各種試劑，在加入標記好的探針前先混勻，並且室溫(20-25ºC)放置10分鍾，從而消除可能發生的探針和蛋白的非特異性結合，或者讓冷探針優先反應。然後加入標記好的探針，混勻，室溫(20-25ºC)放置20分鍾。
c. 加入1µl EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液(無色，10X)，混勻後立即上樣。注意：有些時候溴酚藍會影響蛋白和DNA的結合，建議盡量使用無色的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液。如果對於使用無色上樣緩沖液在上樣時感覺到無法上樣，可以在無色上樣緩沖液裡面添加極少量的藍色的上樣緩沖液，至可以觀察到藍顏色即可。
a. 用0.5XTBE作為電泳液。按照10V/厘米的電壓預電泳10分鍾。預電泳的時候如果有空餘的上樣孔，可以加入少量稀釋好的1X的EMSA上樣緩沖液(藍色)，以觀察電壓是否正常進行。
b. 把混合了上樣緩沖液的樣品加入到上樣孔內。在多餘的某個上樣孔內加入10µl稀釋好的1X的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液(藍色)，用於觀察電泳進行的情況。
c. 按照10V/厘米的電壓電泳。確保膠的溫度不超過30ºC，如果溫度升高，需要適當降低電壓。電泳至EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液中的藍色染料溴酚藍至膠的下緣1/4處，停止電泳。
a. 取一和EMSA膠大小相近或略大的尼龍膜，剪角做好標記，用0.5XTBE浸泡至少10分鍾。尼龍膜自始至終僅能使用鑷子夾取，並且僅可夾取不可能接觸樣品的邊角處。
b. 取兩片和尼龍膜大小相近或略大的濾紙，用0.5XTBE浸濕。
c. 把浸泡過的尼龍膜放置在一片浸濕的濾紙上，注意避免尼龍膜和濾紙間產生氣泡。
d. 非常小心地取出EMSA膠放置到尼龍膜上，注意確保膠和膜之間沒有氣泡。
e. 再把另外一片浸濕的濾紙放置到EMSA膠上，注意確保濾紙和膠之間沒有氣泡。 碧雲天/Beyotime 400-1683301/800-8283301 GS009 化學發光法EMSA試劑盒 3 / 5
f. 採用Western時所使用的濕法電轉膜裝置或其它類似的電轉膜裝置，以0.5XTBE為轉膜液，把EMSA膠上的探針、蛋白以及探針和蛋白的復合物等轉移到尼龍膜上。對於大小約為10x8x0.1cm的EMSA膠，用BioRad的常用的Western轉膜裝置，電轉時可以設置為380mA(約100V)轉膜30-60分鍾。如果膠較厚，則需適當延長轉膜時間。轉膜時需保持轉膜液的溫度較低，通常可以把電轉槽置於4ºC冷庫或置於冰浴或冰水浴中進行電轉，這樣可以確保低溫。具體的電轉膜方法請參考電轉膜裝置的使用說明。
g. 轉膜完畢後，小心取出尼龍膜，樣品面向上，放置在一乾燥的濾紙上，輕輕吸掉下表面明顯的液體。立即進入下一步的交聯步驟，不可使膜幹掉。
a. 用紫外交聯儀(UV-light cross-linker)選擇254nm紫外波長，120mJ/cm2，交聯45-60秒(根據經驗，建議交聯30min)。如果沒有紫外交聯儀可以使用普通的手提式紫外燈(例如碧雲天的手提紫外檢測儀(EUV002))，距離膜5-10厘米左右照射3-10分鍾。也可以使用超凈工作台內的紫外燈，距離膜5-10厘米左右照射3-15分鍾。最佳的交聯時間可以使用標准品自行摸索。
b. 交聯完畢後，可以直接進入下一步檢測；也可以用保鮮膜包裹後在室溫乾燥處存放3-5天，然後再進入下一步檢測。
c. 如果檢測結果發現交聯效果不佳，甚至連free probe的條帶都非常微弱，可以考慮在膜乾燥後參考步驟A的條件再交聯一次，以進一步改善交聯效果。
a. 37-50ºC水浴溶解封閉液和洗滌液。 注意：封閉液和洗滌液必須完全溶解後方可使用，封閉液和洗滌液可以在室溫至50ºC之間使用，但必須確保這兩種溶液中均無沉澱產生，在冬天需特別注意。
b. 取一合適的容器加入15ml封閉液，再放入交聯過的含有樣品的尼龍膜。在側擺搖床或水平搖床上緩慢搖動15分鍾。
c. 取7.5µl Streptavidin-HRP Conjugate加入到15ml封閉液中(1:2000稀釋)，混勻備用。
d. 去除用於尼龍膜封閉的封閉液，加入上一步中配製的15ml含有Streptavidin-HRP Conjugate的封閉液。在側擺搖床或水平搖床上緩慢搖動15分鍾。
e. 取25ml洗滌液(5X)，加入100ml重蒸水或Milli-Q級純水，混勻配製成125ml洗滌液。
f. 將尼龍膜轉移至另一裝有15-20ml洗滌液的容器內，漂洗1分鍾。
g. 去除洗滌液，加入15-20ml洗滌液，在側擺搖床或水平搖床緩慢上洗滌5分鍾。
h. 重復步驟G 三次(共洗滌四次)，每次洗滌時間都約為5分鍾。
i. 將尼龍膜轉移至另一裝有20-25ml檢測平衡液的容器內，在側擺搖床或水平搖床上緩慢搖動5分鍾。
j. 取5ml BeyoECL Moon A液和5ml BeyoECL Moon B液混勻，配製成BeyoECL Moon工作液。注意：BeyoECL Moon工作液必須現配現用。說明：從本步驟起操作方法和注意事項同Western實驗的熒光檢測。
k. 取出尼龍膜，用吸水紙吸去過多液體。立即將膜的樣品面向上，放置到處於水平桌面上的潔凈容器內或保鮮膜上。
l. 在尼龍膜的表面小心加上步驟J配製好的共10ml BeyoECL Moon工作液，使工作液完全覆蓋尼龍膜。室溫放置2-3分鍾。
m. 取出尼龍膜，用吸水紙吸去過多液體。將尼龍膜放在兩片保鮮膜或其它適當的透光薄膜中間，並固定於壓片暗盒(也稱片夾)內。
n. 用X光片壓片1-5分鍾。可以先壓片1分鍾，立即顯影定影，然後根據結果再調整壓片時間；也可以直接分別壓片30秒、1、3、5分鍾或更長時間，然後一起顯影定影觀察結果。
E. 常用的標記方法有什麼呢
大多數研究者使用熒游標記物，也有一些研究者使用生物素標記，聯合抗生物素結合物檢測DNA化學發光
F. 指出ELISA有哪幾種常用方法各種方法在操作上有什麼異同應用有什麼異同
ELISA的類型
ELISA可用於測定抗原，也可用於測定抗體。在這種測定方法中有三個必要的試劑：（1）固相的抗菌素原或抗體，即"免疫吸附劑"（immunosorbent）；（2）酶標記的抗原或抗體，稱為"結合物"（conjugate）；（3）酶反應的底物。根據試劑的來源和標本的情況以及檢測的具體條件，可設計出各種不同類型的檢測方法。用於臨床檢驗的ELISA主要有以下幾種類型：
1.雙抗體夾心法測抗原
雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，操作步驟如下：
1） 將特異性抗體與固相載體聯結，形成固相抗體。洗滌除去未結合的抗體及雜質。
2） 加受檢標本，保溫反應。標本中的抗原與固相抗體結合，形成固相抗原抗體復合物。洗滌除去其他未結合物質。
3） 加酶標抗體，保溫反應。固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢抗原的量相關。
4） 加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產物。通過比色，測知標本中抗原的量。在臨床檢驗中，此法適用於檢驗各種蛋白質等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用於包被固相載體和制備酶結合物而建立此法。如抗體的來源為抗血清，包被和酶標用的抗體最好分別取自不同種屬的動物。如應用單克隆抗體，一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗，分別用於包被固相載體和制備酶結合物。這種雙位點夾心法具有很高的特異性，而且可以將受檢標本和酶標抗體一起保溫反應，作一步檢測。
在一步法測定中，當標本中受檢抗原的含量很高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成"夾心復合物"。類同於沉澱反應中抗原過剩的後帶現象，此時反應後顯色的吸光值（位於抗原過剩帶上）與標准曲線（位於抗體過剩帶上）某一抗原濃度的吸光值相同，如按常法測讀，所得結果將低於實際的含量，這種現象被稱為鉤狀效應（hook effect），因為標准曲線到達高峰後呈鉤狀彎落。鉤狀效應嚴重時，反應甚至可不顯色而出現假陰性結果。因此在使用一步法試劑測定標本中含量可異常增高的物質（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）時，應注意可測范圍的最高值。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應。
假使在被測分子的不同位點上含有多個相同的決定簇，例如HBsAg的a決定簇，也可用針對此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結合物。但在HBsAg的檢測中應注意亞型問題，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4個亞型，雖然每種亞型均有相同的a決定簇的反應性，這也是用單抗作夾心法應注意的問題。
雙抗體夾心法測抗原的另一注意點是類風濕因子（RF）的干擾。RF是一種自身抗體，多為IgM型，能和多種動物IgG的Fc段結合。用作雙抗體夾心法檢測的血清標本中如含有RF，它可充當抗原成份，同時與固相抗體和酶標抗體結合，表現出假陽性反應。採用F（ab'）或Fab片段作酶結合物的試劑，由於去除了Fc段，從而消除RF的干擾。雙抗體夾心法ELISA試劑是否受RF的影響，已被列為這類試劑的一項考核指標。
雙抗體夾心法適用於測定二價或二價以上的大分子抗原，但不適用於測定半抗原及小分子單價抗原，因其不能形成兩位點夾心。
2.雙抗原夾心法測抗體
反應模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進行包被和制備酶結合物，以檢測相應的抗體。與間接法測抗體的不同之處為以酶標抗原代替酶標抗抗體。此法中受檢標本不需稀釋，可直接用於測定，因此其敏感度相對高於間接法。乙肝標志物中抗HBs的檢測常採用本法。本法關鍵在於酶標抗原的制備，應根據抗原結構的不同，尋找合適的標記方法。
3.間接法測抗體
間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗體）以檢測與固相抗原結合的受檢抗體，故稱為間接法。操作步驟如下：
1）將特異性抗原與固相載體聯結，形成固相抗原。洗滌除去未結合的抗原及雜質。
2）加稀釋的受檢血清，保溫反應。血清中的特異抗體與固相抗原結合，形成固相抗原抗體復合物。經洗滌後，固相載體上只留下特異性抗體，血清中的其他成份在洗滌過程中被洗去。
3）加酶標抗抗體。可用酶標抗人Ig以檢測總抗體，但一般多用酶標抗人IgG檢測IgG抗體。固相免疫復合物中的抗體與酶標抗體抗體結合，從而間接地標記上酶。洗滌後，固相載體上的酶量與標本中受檢抗體的量正相關。
4）加底物顯色
本法主要用於對病原體抗體的檢測而進行傳染病的診斷。間接法的優點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。
間接法成功的關鍵在於抗原的純度。雖然有時用粗提抗原包被也能取得實際有效的結果，但應盡可能予以純化，以提高試驗的特異性。特別應注意除去能與一般健康人血清發生反應的雜質，例如以E.Coli為工程酶的重組抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能與受過E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗體發生反應。抗原中也不能含有與酶標抗人Ig反應的物質，例如來自人血漿或人體組織的抗原，如不將其中的Ig去除，試驗中也發生假陽性反應。另外如抗原中含有無關蛋白，也會因竟爭吸附而影響包被效果。
間接法中另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性。病人血清中受檢的特異性IgG只佔總IgG中的一小部分。IgG的吸附性很強，非特異IgG可直接吸附到固相載體上，有時也可吸附到包被抗原的表面。因此在間接法中，抗原包被後一般用無關蛋白質（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封閉（blocking）固相上的空餘間隙。另外，在檢測過程中標本須先行稀釋（1:40~1:200），以避免過高的陰性本底影響結果的判斷。
4.競爭法測抗體
當抗原材料中的干擾物質不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。其原理為標本中的抗體和一定量的酶標抗體競爭與固相抗原結合。標本中抗體量越多，結合在固相上的酶標抗體愈少，因此陽性反應呈色淺於陰性反應。如抗原為高純度的，可直接包被固相。如抗原中會有干擾物質，直接包被不易成功，可採用捕獲包被法，即先包被與固相抗原相應的抗體，然後加入抗原，形成固相抗原。洗滌除去抗原中的雜質，然後再加標本和酶標抗體進行競爭結合反應。競爭法測抗體有多種模式，可將標本和酶標抗體與固相抗原競爭結合，抗HBc ELISA一般採用此法。另一種模式為將標本與抗原一起加入到固相抗體中進行競爭結合，洗滌後再加入酶標抗體，與結合在固相上的抗原反應。抗HBe的檢測一般採用此法。
5.競爭法測抗原
小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的位點，因此不能用雙抗體夾心法進行測定，可以採用競爭法模式。其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結合。標本中抗原量含量愈多，結合在固相上的酶標抗原愈少，最後的顯色也愈淺。小分子激素、葯物等ELISA測定多用此法。
6.捕獲包被法測抗體
IgM抗體的檢測用於傳染病的早期診斷中。間接法ELISA一般僅適用於檢測總抗體或IgG抗體。如用抗原包被的間接法直接測定IgM抗體，因標本中一般同時存在較高濃度的IgG抗體，後者將競爭結合固相抗原而使一部份IgM抗體不能結合到固相上。因此如用抗人IgM作為二抗，間接測定IgM抗體，必須先將標本用A蛋白或抗IgG抗體處理，以除去IgG的干擾。在臨床檢驗中測定抗體IgM時多採用捕獲包被法。先用抗人IgM抗體包被固相，以捕獲血清標本中的IgM（其中包括針對抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM）。然後加入抗原，此抗原僅與特異性IgM相結合。繼而加酶標記針對抗原的特異性抗體。再與底物作用，呈色即與標本中的IgM成正相關。此法常用於病毒性感染的早期診斷。甲型肝炎病毒（HAV）抗體的檢測模式。
類風濕因子（RF）同樣能幹擾捕獲包被法測定IgM抗體，導致假陽性反應。因此中和IgG的間接法近來頗受青睞，用這類試劑檢測抗CMV IgGM和抗弓形蟲IgM抗體已獲成功。
7.ABS-ELISA法
ABS為親和素(avidin)生物素(biotin)系統(system)的略語。親和素是一種糖蛋白，分子量60000，每個分子由4個能和生物素結合的亞基組成。生物素為小分子化合物，分子量244。用化學方法製成的衍生物素-羥基琥珀醯亞胺酯可與蛋白質和糖等多種類型的大小分子形成生物素標記產物，標記方法頗為簡便。生物素與親和素的結合具有很強的特異性，其親和力較抗原抗體反應大得多，兩者一經結合就極為穩定。由於一個親和素可與4個生物素分子結合，因此如把ABS與ELISA法可分為酶標記親和素-生物素（LAB）法和橋聯親和素-生物素（ABC）法兩種類型。兩者均以生物素標記的抗體（或抗原）代替原ELISA系統中的酶標抗體（抗原）。在LAB中，固相生物素先與不標記的親和素反應，然後再加酶標記的生物素以進一步提高敏感度。在早期，親和素從蛋清中提取，這種卵親和素為鹼性糖蛋白，與聚苯乙烯載體的吸附性很強，用於ELISA中可使本底增高。從鏈黴菌中提取的鏈霉親和素則無此缺點，在ELISA應用中有替代前者的趨勢。由於ABS-ELISA較普通ELISA多用了兩種試劑，增加了操作步驟，在臨床檢驗中ABS-ELISA應用不多。
G. 免疫檢測方法
免疫檢測方法大全2017
免疫學檢測技術的用途非常廣泛，它們可用於有關免疫疾病的診斷、療效評價及發病機制的研究。如對傳染病、免疫增殖性疾病、免疫缺損病、超敏反應、自身免疫病、移植排斥反應腫瘤的免疫學檢測，對診斷、治療均有很大幫助。此外在醫學生物學研究中對抗原性物質或細胞的定性、定量檢查不僅推動了對各種免疫學現象的研究，而且擴大免疫學與醫學生物許多領域的聯系。本章僅介紹常用免疫學檢測方法的原理，簡要過程和實用意義。下面是我為大家帶來的關於免疫學檢測法的知識，歡迎閱讀。
第一節抗原或抗體的檢測
一、檢測的原理
藉助抗原和抗體在體外特異結合後出現的各種現象，對樣品中的抗原或抗體進行定性、定量、定位的檢測。
1.抗原與抗體的親和力(affinity)抗原抗體的結合就像酶與底物的結合，激素與其受體的結合一樣不是化學的反應，而是非共價鍵的可逆的結合。抗原決定簇和抗體分子可變區互補構型，造成兩分子間有較強的親和力。空間構型互補程度不同，抗原和抗體分子之間結合力強弱也不同。互補程度高，則親和力強。此外，反應溫度、酸鹼度和離子濃度對抗原和抗體分子上各基因的解離性和電荷特性也有重要的影響，抗體與抗原決定簇之間的結合力大小可用親合力來表示。高親合力的抗體與抗原的結合力強，即使抗原濃度很低時也有較多的抗體結合抗原形成免疫復合物。
2.抗原或抗體外檢測原理根據抗原抗體結合形成免疫復合物的性狀與活性特點，對標本中的抗原或抗體進行定性、定位或定量的檢測。定性和定位檢測比較簡單，即用已知的抗體和待檢樣品混合，經過一段時間，若有免疫復合物形成的現象發生，就說明待檢樣品中有相應的抗原存在。若無預期的現象發生，則說明樣品中無相應的抗原存在。同理也可用已知的抗原檢測樣品中是否有相應抗體。
對抗原或抗體進行定量檢測時，以反應中加入抗原和抗體的濃度與形成免疫復物的濃度呈函數關系。
(1)根據免疫復合物產生的多少來推算樣品中抗原(或抗體)的含量：在一定的反應條件下，加入的已知抗體(或抗原)的濃度一定，反應產生的免疫復合物多少與待檢樣品中含有相應抗原(或抗體)量成正比。也就是抗體濃度一定時，免疫復合物越多則樣品中的抗原量也越多。可用實驗性標准曲線推算出樣品中抗原(或抗體)的含量。如免疫單向擴散試驗、免疫比濁試驗和酶聯免疫檢測等都屬於這類方法。
(2)抗原或抗體效價滴定的原理：當抗原抗體復合物形成多少不能反應抗原抗體反應強弱時，就不能以檢測反應強度來對抗原或抗體進行定量。在實際工作中，把濃度低的反應成分(抗原或抗體)的濃度固定，把濃度高的另一種反應成分作一系列稀釋。例如用人血清作抗原免疫3隻家兔，比較3隻家兔產生抗體的多少，即滴定3隻兔血清抗體效價，可用雙向瓊脂擴散法來滴定，例如將抗體濃度固定，將抗原作不同的稀釋度，分別將抗原或抗體滴入瓊脂的相應小孔中，觀察免疫兔血清與不同稀釋度的抗原出現明顯沉澱淺的抗原稀釋度(如甲兔的抗體效價為1/2000，而丙免的是1/8000則可比較出後者比前者產生抗體的效價要高)。也就是表示效價的稀釋度越高，樣品中所含待檢成分越多。因人血清(抗原)和抗體(免疫兔血清)相比，濃度高，故應稀釋抗原。
二、抗原或抗體檢測的實用意義
1.抗體檢測的意義檢測抗體可用於評價人和動物免疫功能的指標。抗體用於臨床治療或實驗研究時也需做純度分析和定量測定。臨床上檢測病人的抗病原生物的抗體、抗過敏原的抗體、抗HLA抗原的抗體、血型抗體及各種自身抗體，對有關疾病的診斷有重要意義。
2.抗原檢測的意義可做為抗原進行檢測的物質可分為以下四類：
(1)各種微生物及其大分子產物：用於傳染病診斷、微生物的分類及鑒定以及對菌苗、疫苗的研究。
(2)生物體內各種大分子物質：包括各種血清蛋白(如各類免疫球蛋白、補體的各種成分)、可溶性血型物質、多肽類激素、細胞因子及癌胚抗原等均可做為抗原進行檢測。在對這些成分的生物學作用的研究以及各種疾病的診斷有重要意義。
(3)人和動物細胞的表面分子：包括細胞表面各種分化抗原(如CD抗原)、同種異型抗原(血型抗原或MHC抗原)、病毒相關抗原和腫瘤相關性情抗原等。檢測這些抗原對各種細胞的分類、分化過程及功能研究、對各種與免疫有關的疾病的診斷及發病機制的研究，均有重要意義。
(4)各種半抗原物質：某些葯物、激素和炎症介質等屬於小分子的半抗原，可以分別將它們偶聯到大分子的載體上，組成人工結合的完全抗原。用其免疫動物，制備出各種半抗原的抗體，應用於各種半抗原物質的檢測，例如對某些病人在服用葯物後進行血中葯物濃度的監測。對運動員進行服用違禁葯品的檢測，都是應用半抗原檢測的方法。
三、抗原或抗體檢測的方法
由於各種檢測方法中所用的抗原性狀不同，出現結果的現象也不同。最廣泛應用方法有下述幾種：
(一)沉澱反應
可溶性抗原與抗體結合，在兩者比例合適時，可形成較大的不溶性免疫復合物。在反應體系中出現不透明的沉澱物，這種抗原抗體反應稱為沉澱反應(precipitation neaction)。
1.環狀沉澱試驗先將含抗體的未稀釋的免疫血清加到直徑小於0.5cm的小試管底部。將稀釋的含有可溶性抗原的材料重疊於上，讓抗原與抗體在兩液體的界面相遇，形成白色免疫復合物沉澱環，故名為環狀沉澱試驗(ring precipitationtest),此法簡便易行，需用材料較多是其缺點。
2.單向免疫擴散試驗單向免疫擴散試驗(single immunodiffusion)是在凝膠中進行的沉澱反應。將抗體混入加熱溶解的瓊脂中，傾注於玻片上，製成含有抗體的瓊脂板，在適當位置打孔，將抗原材料加入瓊脂板的小孔內，讓抗原從小孔向四周的瓊脂中擴散，與瓊脂中的抗體相遇形成免疫復合物。當復合物體積增加到一定程度時停止擴散，出現以小孔為中心的圓形沉澱圈，沉澱圈的直徑與加入的抗原濃度成正相關。本方法簡便，易於觀察結果，可測定抗原的靈敏度(最低濃度)約為10～20μg/ml，常用於定量測定人或動物血清IgG、IgM、IgA和C3等，其缺點是需1～2天才能看結果
3.免疫比濁法 當抗體濃度高，加入少量可溶性抗原，即可形成一些肉眼看不見的小免疫復合物，它可使通過液體的光束發生散射，隨著加入抗原增多，形成的免疫復合物也增多，光散射現象也相應加強。免疫比濁法(immunonephelomytry)就是在一定的抗體濃度下，加入一定體積的樣品，經過一段時間，用光散射濁度計(nephelometry)測量反應液體的濁度，來推算樣品中的抗原含量。本法敏感、快速簡便，可取代單向擴散法定量測定免疫球蛋白的濃度。
4，雙向免疫擴散試驗 雙免疫擴散試驗(double immunodiffusion)是在瓊脂板上按一定距離打數個小孔，在相鄰的兩孔內分別放入抗原和抗體材料。當抗原和抗體向四周凝膠中擴散，在兩孔間可出現2～3條沉澱線，本法常用於抗原或抗體的定性或定量檢測，或用於兩種抗原材料的抗原相關性分析。
5.對流免疫電泳對流電泳(counterimmunoelectrophoresis)是一敏感快速的檢測方法，即在電場作用下的雙向免疫擴散。將瓊脂板放入電泳槽內，使瓊脂板的兩孔沿著電場的方向，於負極側的孔內加入抗原，於正極側的孔內加入抗體，通電後，抗原帶負電荷向正極泳動，抗體分子雖也帶負電荷，但因分子量大，向正極的位移小，而受瓊脂中電滲作用向負極移動，抗原和抗體能較快地集中在兩孔之間的瓊脂中形成免疫復合物的沉澱線。只需1小時左右即可觀察結果。
6.免疫電泳 免疫電泳(immunoelectrophoresis)的方法分成兩個步驟，即先進行電泳，再進行瓊脂擴散。先將樣品加入瓊脂中電泳，將抗原各成分依電泳速度不同而分散開。然後在適當的位置上沿電泳方向挖一直線形槽，於槽內加入含有針對各種抗原混合抗體液，讓各抗原成分與相應抗體進行雙向免疫擴散，可形成多答卷沉澱線。常用此法進行血清的蛋白種類分析。對於免疫球蛋白缺損或增多的疾病的診斷或鑒別診斷有重要意義
7.免疫印跡法免疫印跡法(immunoblotting)又稱為Western印跡法，用於AIDS的血清抗體檢測。第一步，為電泳分離HIV抗原，在電場中根據分子量大小不同病毒抗原各成分散開。第二步，將電泳分離的蛋白質轉移到硝酸纖維膜上(電印跡)，然後將印跡有病毒抗原的硝酸纖維膜浸濕於病人血清中。如果病人血清中含有與一種或幾種抗原相對應的抗體的話，則在該抗原印跡部位形成免疫復合物沉澱。在洗去未沉澱的抗原和抗體後，在膜上加標記的抗人免疫球蛋白的抗體，此抗體可以和病毒抗原與人抗體形成的免疫復合物發生反應，最後加入顯色底物(如果抗人Ig是用酶標記的)或做放射自顯影(抗人Ig用125Ⅰ標記)以顯示結果
第一步：經電泳將HIV混合抗合抗原按分子量大小分離;
第二步：將已分離的抗原經電印跡轉移到硝酸纖維膜上;
第三步：將待檢病人血清加入覆蓋於硝酸纖維膜上;
第四步：加入標記的第二抗體使之覆蓋膜上;
第五步：加入顯色底物(或放射自顯影)顯現第二抗體
(二)凝集反應
細菌、紅細胞或表面帶有抗原的乳膠顆粒等都是不溶性的顆粒抗原，當與相應抗體結合，抗原與抗體結合形成凝集團塊，即稱為凝集反應(agglutination)。
1.直接凝集 直接凝集(direct agglutination)是將細菌或紅細胞與相應抗體結合產生的細菌凝集或紅細胞凝集現象。可用於傳染病診斷如肥達氏反應(Widal reaction)診斷傷寒病。或利用血細胞凝集現象檢查血型。
2.間接凝集 間接凝集(indirect agglutination)是用可溶性抗原包被在乳膠顆粒或紅細胞表面，與相應抗體混合出現的凝集現象。如用γ球蛋白包乳膠顆粒檢測類風濕關節炎病人血清中的類風濕因子，用甲狀腺球蛋白包被乳膠顆粒用於檢測甲狀腺球蛋的抗體。也可以將抗體吸附到乳膠顆粒上檢查臨床標本中的抗原，如細菌或真菌性腦膜炎抗體包被的乳顆粒，一旦與含有相應抗原的腦脊液混合，便可發生凝集，可進行快速診斷。故凝集反應即可測定抗原，也可測抗體，方法簡便、敏感。
3.抗球蛋白試驗 抗球蛋白試驗(antiglobulin test,coombs test)的原理為間接凝集試驗。例如應用於診斷自身免疫溶血性貧血症時，Rh+紅細胞與抗Rh血清間的反應。因抗Rh抗體是IgG只有兩個結合價，分子較小(不如IgM結合價多，分子大)很難直接引起Rh+紅細胞凝集。如果加入抗IgG的抗體，就可幫助抗Rh的IgG的抗體凝集紅細胞。也就是經抗Ig的作用提高凝集反應的'靈敏度。
(三)補體參與抗原抗體反應
這一類反應主要包括溶血反應(hemolytic assay)、補體介導的細胞毒試驗(complement mediated cytotoxicuty test)及補體結合試驗(complement fixation test)。
1.溶血反應 抗體與紅細胞表面抗原相遇，形成紅細胞-抗體復合物即可使加入反應中的補體活化，導致紅細胞溶解，此方法可用於紅細胞的各種抗原或相應抗體的檢測，此法比凝集反應敏感。溶血反應也是用於抗體分泌細胞即空斑形成細胞(PFC)檢測的原理。
2.補體介導的細胞毒試驗各種有核細胞與針對其表面抗原的抗體相遇，所形成的免疫復合物能活化反應中的補體，引起細胞膜穿孔，在一定時間內，細胞仍能維持一定的形態不破碎，加入水溶性染如伊紅Y(eosin Y)或台盼藍(trypan blue)後，染料即可進入被活化補體穿孔的細胞，不帶相應抗原細胞膜保持完整的活細胞不著色。此方法可用於帶各種抗原的細胞的檢測，如進行細胞MHC抗原的鑒定，和進行淋巴細胞中T細胞總數或其亞類的計數。在一些免疫學實驗中也可用這種方法，根據需要特異地消除帶某種抗原的細胞。
3.補體結合試驗當抗原(可溶性或顆粒性)與相應抗體結合，由於濃度低不出現可見反應時，應用補體結合試驗可檢出此抗原抗體反應，它比凝集反應或沉澱反應靈敏度高。本法包括兩個抗原抗體系統。一為檢測系統由待檢樣品與已知抗原(或抗體)組成;另一為指示系統，由綿羊紅細胞(SRBC)和抗SRBC組成。另加入作為補體的新鮮豚鼠血清。試驗時試管中先加入檢測系統和補體，混合經37℃30分鍾使抗原、抗體、補體形成復合物，再加入指示系統，如出現溶血現象，說明檢測系統中沒有相對應的抗原抗體，補體是游離的指示系統的SRBC和抗體結合而出現溶血，即為反應陰性。如不出現溶血，表明檢測系統中有抗原抗體復合物並結合補體，則指示系統無多餘的補體作用而沒有溶血現象，即為陽性。
在敏感的抗原、抗體檢測方法(如酶標方法)出現之前補體結合試驗曾廣泛用於檢測各種細菌、病毒或螺旋體(如梅毒)的抗原或抗體，由於本試驗影響因素多，結果不穩定現已被新檢測方法所代替。
四、用標記抗體或抗原進行的抗原、抗體反應
用熒光素、同位素或酶標記抗體或抗原，用於抗原或抗體檢測是目前廣泛應用的敏感、可靠的方法。上述三種常用的標記物與抗原或抗體化學連接之後不改變後者的免疫特性。本方法可用於定性、定量或定位檢測。
1.免疫熒光技術免疫熒光技術(immunofluorescence techni)是用化學方法使熒光素標記的抗體(或抗原)與組織或細胞中的相應抗原(或抗體)結合，進行定性定位檢查抗原或抗體的方法。
(1)直接熒光法：把熒光抗體加到待檢的細胞懸液，細胞塗片或組織切片上進行染色，經抗原抗體反應後，洗去未結合的熒光抗體，將待檢標本在熒光顯微鏡下觀察，有熒光的部位即有相應抗原存在，此法可用於病毒感染細胞、帶某種特異抗原的細胞(如T細胞和B細胞)或病原菌的檢查，也可用於組織中沉著的免疫復合物的檢查。本法的缺點是檢查多種抗原，就需分別制備相應的多種標記抗體。
(2)間接熒光法：可克服直接法需制備多種熒光抗體的復雜操作。將組織或細胞上的抗原直接與相應抗體(不標記熒光)結合，此為第一抗體，再把能與第一抗體特異結合的熒游標記的抗免疫球蛋白抗體加入，此為熒游標記的第二抗體，觀察結果與直接法相同。間接法比直接法敏感性高，如果用於檢查抗原的第一抗體是人或動物的只需制備一種抗人或動物的免疫球蛋白熒光抗體
免疫熒光技術在傳染病診斷上有廣泛的用途，如在細菌、病毒、螺旋體感染的疾病，檢查抗原或抗體，如查出IgM抗體，可做為近期接觸抗原的標志，所以使用熒游標記抗IgM可診斷近期感染。除微生物學方面的應用外，還可利用單克隆抗體鑒定淋巴細胞的亞類。使用流式細胞儀(fluorescene-activated cell sorting,FACS)，能自動檢測細胞的大小、熒光強度。針對細胞表面不同抗原，可以使用兩種不同的熒光染料，如用異硫氰熒光素(FITC)發黃綠熒光，用羅丹明(TMRITC)發紅色熒光。由於熒光顏色不同標記兩種不同的抗體，對同一細胞進行雙標記染色。對淋巴細胞亞類鑒定起著巨大推動作用。應用間接熒光法也用於自身免疫病的抗核抗體檢查。
2.放射免疫分析法 放射免疫分析法(radioimmunoassay RIA)應用競爭性結合的原理，應作放射性同素標記抗原(或抗體)與相應抗體(或抗原)結合，通過測定抗原抗體結合物的放射活性判斷結果，本方法可進行超微量分析，敏感性高，可用於測定抗原、抗體、抗原抗體復合物。本法常用的同位素有125Ⅰ和131Ⅰ。
放射免疫分析常用的有液相法和固相法兩種：
(1)液相法：將待檢標本(例如含胰島素抗原)與定時的同位素標記的胰島素(抗原)和定時的抗胰島素抗體混合，經一定作用時間後，分離收集抗原抗體復合物及游離的抗原，測定這兩部分的放射活性，計算結合率。在反應系統中，待檢標本的胰島素抗原與同位素標記的胰島素競爭奪戰性與胰島素抗體結合。非標記的抗原越多，標記抗原與抗體形成的復合物越少。非標記抗原含量與標記抗原抗體復合物的量呈一定的函數關系。預先用標準的非標記抗原作成標准曲線後，即可查出待檢標本中胰島素的含量
(2)固相法：將抗原或抗體吸附到固相載體表面，然後加待檢標本，最後加標記抗體。測定固相載體的放射活性，常用的固相載體有溴化氰(CNBr)海豹化的紙片或聚苯乙烯小管
放射免疫分析法應用范圍廣泛，包括多種激素(胰島素、生長激素、甲狀腺素等)維生素、葯物、IgE等。
3.酶聯免疫分析法 酶聯免疫分析法(enzyme immunoassay,EIA)是當前應用最廣泛的免疫檢測方法。本法將抗原抗體反應的特異性與酶對底物高效催化作用結合起來，根據酶作用底物後顯色，以顏色變化判斷試驗結果，可經酶標測定儀作定量分析，敏感度可達ng水平。常用於標記的酶有辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase)、鹼性磷酶(alkaline phosphatase)等。它們與抗體結合不影響抗體活性。這些酶具有一定的穩定性，製成酶標抗體可保存較長時間。目前常用的方法有酶標免疫組化法和酶聯免疫吸附法。前者測定細胞表面抗原或組織內的抗原;後者主要測定可溶性抗原或抗體。本法既沒有放射性污染又不需昂貴的測試儀器，所以較放射免疫分析法更易推廣。
(1)酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA):是與上述固相RIA相似的原理，將抗原或抗體吸附在固相載體表面。使抗原抗體反應在固相載體表面進行政區。可用間接法、雙抗體夾心法或競爭法測定抗原或抗體。
(2)夾心法(sandwich assay):將已知的特異抗體包裝在固相載體(塑料板凹孔或紙片上)，加入待檢標本，標本中的抗原即可與載體上的抗原結合，洗去未結合的材料後加入該抗原的酶標記抗體，洗去未結合的酶標抗體，加底物顯色，用酶免疫檢測儀測量顏色的光密度，可定量測定抗原。
間接法(indirecr ELISA)常用於檢查特異抗體。先將已知特異抗原包被固相載體，加入待檢標本(可能含有相應抗體)，再加入酶標抗Ig的抗全(即第二抗體)，經加底物顯色後，根據顏色的光密度計算出標本中抗體的含量。
(3)BAS-ELISA：近年來對酶免設分析法的改進是使用生物素-親合素-過氧化物酶復合物作為指示劑，組成一新的生物放大系統進一步提高檢測的敏感度。可用來檢測多種抗原抗體系統如細菌、病毒、腫瘤細胞表面抗原等。一個親合素(avidin)分子可以結合4個生物素分子(biotin)。結合非常穩定。親合素和生物素都可與抗全、酶、熒光素等分子結合，而不影響後者的生物活性。一個抗體分子可偶聯90個生物素分子，通過生物素又可連接多個親合素。因此大提高檢測的敏感度。目前應用生物-酶標親合素系統(biotinavidin system- ELISA,BAS-ELISA)，它是通過生物素標記抗體連接免疫反應系統，同時藉助生物素化酶或酶標親合素引入酶與底物反應系統。
;H. 哪位大俠用生物素標記的多肽做過間接法Elisa嗎
抽血檢測，一般用三代酶聯合免疫法 酶聯免疫法，簡稱ELISA。 它的中心就是讓抗體與酶復合物結合，然後通過顯色來檢測。 步驟：ELISA用血清來檢測，首先血液要經過至少半個小時的凝集，然後取血清（這是有些網友不理解為什麼醫院抽完了血對血置之不理的原因，其實是誤會）。將酶復合物用稀釋液稀釋後，加血清及陰性、陽性對照，還有就是質控品（這是嚴格的要求，它的范圍必須在質控范圍內）。經過一個小時的孵育，然後洗板，加底物，半個小時避光反應後加終止液即完成反應部分，然後就是讀數。由數值來判斷結果的陰性或陽性。嚴格的講，如果第一次檢測為陽性的話，無論是哪個實驗室，必須按照CDC的HIV操作規程來進行第二次檢測，第二次的方法必須與第一次的不同，如還是陽性，將送確認實驗室確認。有的醫院很不負責，將初篩陽性的報告發出後就不管了，這是不對的。必須經過確認實驗室確認後才可出陽性診斷。祝大家。PS，第一次檢測為陽性的話，一定要去確認實驗室再做一次，勇敢的去面對，也許結果就不一樣了。 基本原理是：①使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，並保持其免疫活性。②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開，最後結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底物後，底物被酶催化變為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據顏色反應的深淺刊物定性或定量分析。由於酶的催化頻率很高，故可極大地地放大反應效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。 ELISA可用於測定抗原，也可用於測定抗體。在這種測定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體，②酶標記的抗原或抗體，③酶作用的底物。根據試劑的來源和標本的性狀以及檢測的具備條件，可設計出各種不同類型的檢測方法。 具體方法有： （一）雙抗體夾心法 雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，操作步驟如下： （1）將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結合的抗體及雜質。 （2）加受檢標本：使之與固相抗體接觸反應一段時間，讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結合，形成固相抗原復合物。洗滌除去其他未結合的物質。 （3）加酶標抗體：使固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質的量正相關。 （4）加底物：夾心式復合物中的酶催化底物成為有色產物。根據顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量。 根據同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標抗原結合物，即可用雙抗原夾心法測定標本中的抗體。 （二）雙位點一步法 在雙抗體夾心法測定抗原時，如應用針對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標抗體，則在測定時可使標本的加入和酶標抗體的加入兩步並作一步（圖15-5）。這種雙位點一步不但簡化了操作，縮短了反應時間，如應用高親和力的單克隆抗體，測定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應用使測定抗原的ELISA提高到新水平。 在一步法測定中，應注意鉤狀效應（hookeffect），類同於沉澱反應中抗原過剩的後帶現象。當標本中待測抗原濃度相當高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成夾心復合物，所得結果將低於實際含量。鉤狀效應嚴重時甚至可出現假陰性結果。 （三）間接法測抗體 間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標記的抗抗體以檢測已與固相結合的受檢抗體，故稱為間接法。操作步驟如下： （1）將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原：洗滌除去未結合的抗原及雜質。 （2）加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結合，形成固相抗原抗體復合物。經洗滌後，固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及血清中的雜質由於不能與固相抗原結合，在洗滌過程中被洗去。 （3）加酶標抗抗體：與固相復合物中的抗體結合，從而使該抗體間接地標記上酶。洗滌後，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。例如欲測人對某種疾病的抗體，可用酶標羊抗人IgG抗體。 （4）加底物顯色：顏色深度代表標本中受檢抗體的量。 本法只要更換不同的固相抗原，可以用一種酶標抗抗體檢測各種與抗原相應的抗體。 （四）競爭法 競爭法可用於測定抗原，也可用於測定抗體。以測定抗原為例，受檢抗原和酶標抗原競爭與固相抗體結合，因此結合於固相的酶標抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下： （1）將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體。洗滌。 （2）待測管中加受檢標本和一定量酶標抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應。如受檢標本中無抗原，則酶標抗原能順利地與固相抗體結合。如受檢標本中含有抗原，則與酶標抗原以同樣的機會與固相抗體結合，競爭性地佔去了酶標抗原與固相載體結合的機會，使酶標抗原與固相載體的結合量減少。參考管中只加酶標抗原，保溫後，酶標抗原與固相抗體的結合可達最充分的量。洗滌。 （3）加底物顯色：參考管中由於結合的酶標抗原最多，故顏色最深。參考管顏色深度與待測管顏色深度之差，代表受檢標本抗原的量。待測管顏色越淡，表示標本中抗原含量越多。 （五）捕獲法測IgM抗體 血清中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時存在，後者會干擾IgM抗體的測定。因此測定IgM抗本多用捕獲法，先將所有血清IgM（包括異性IgM和非特異性IgM）固定在固相上，在去除IgG後再測定特異性IgM。操作步驟如下： （1）將抗人IgM抗體連接在固相載體上，形成固相抗人IgM。洗滌。 （2）加入稀釋的血清標本：保溫反應後血清中的IgM抗體被固相抗體捕獲。洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質成分。 （3）加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性IgM結合。洗滌。 （4）加入針對特異性的酶標抗體：使之與結合在固相上的抗原反應結合。洗滌。 （5）加底物顯色：如有顏色顯示，則表示血清標本中的特異性IgM抗體存在，是為陽性反應。 （六）應用親和素和生物素的ELISA 親和素是一種糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每個分子由4個亞基組成，可以和4個生物素分子親密結合。現在使用更多的是從鏈黴菌中提取的鏈霉和素（strepavidin）。生物素（biotin）又稱維生素H，分子量244.31，存在於蛋黃中。用化學方法製成的衍生物，生物素－羥基琥珀亞胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可與蛋白質、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產物。親和素與生物素的結合，雖不屬免疫反應，但特異性強，親和力大，兩者一經結合就極為穩定。由於1個親和素分子有4個生物素分子的結合位置，可以連接更多的生物素化的分子，形成一種類似晶格的復合體。因此把親和素和生物素與ELISA偶聯起來，就可大提高ELISA的敏感度。 親和素－生物素系統在ELISA中的應用有多種形式，可用於間接包被，亦可用於終反應放大。可以在固相上先預包被親和素，原用吸附法包被固相的抗體或抗原與生物素結合，通過親和素－生物素反應而使生物素化的抗體或抗在相化。這種包被法不僅可增加吸附的抗體或抗原量，而且使其結合點充分暴露。另外，在常規ELISA中的酶標抗體也可用生物素化的抗體替代，然後連接親和素－酶結合物，以放大反應信號。
I. 2021-07-21 神奇的單鏈DNA合成技術(2)——生物素標記純化
生物素-鏈霉親合素系統同樣可以應用於ssDNA的純化。
在這種基於生物素標記的ssDNA純化方法中，首先使用會進行PCR，不同之處在於使用的兩條引物中，根據需要將其中一條引物的5'端進行生物素標記，另一條未非生物素標記的引物。因此，經過PCR擴增後，獲得的dsDNA中一條鏈為生物素標記的ssDNA，另一條為未標記的ssDNA。後續將dsDNA變性（使用鹼變性或者高溫）後，使用聯鏈霉親和素進行生物素標記ssDNA的純化。