基因多態性檢測方法提取DNA

1. 基因檢測怎麼採集DNA基因樣本

基因是遺傳的基本單元，攜帶有遺傳信息的DNA或RNA序列，通過復制，把遺傳信息傳遞給下一代，指導蛋白質的合成來表達自己所攜帶的遺傳信息，從而控制生物個體的性狀表達。基因檢測是通過血液、其他體液、或細胞對DNA進行檢測的技術，是取被檢測者外周靜脈血或其他組織細胞，擴增其基因信息後，通過特定設備對被檢測者細胞中的DNA分子信息作檢測，分析它所含有的基因類型和基因缺陷及其表達功能是否正常的一種方法，從而使人們能了解自己的基因信息，明確病因或預知身體患某種疾病的風險。
基因檢測可以診斷疾病，也可以用於疾病風險的預測。疾病診斷是用基因檢測技術檢測引起遺傳性疾病的突變基因。目前應用最廣泛的基因檢測是新生兒遺傳性疾病的檢測、遺傳疾病的診斷和某些常見病的輔助診斷。

2. DNA多態的類型、特點及其應用

DNA多態的類型、特點及其應用
一
在刑事案件的偵破工作中，常常要檢驗血痕、精斑、唾液等現場遺留物的血型物質是哪個種屬，並同嫌疑人進行對照、比較，確認異同。這種血型鑒定是法醫物證檢驗中最常用的技術手段。
最早意義上的血型僅指血紅細胞表面抗原的四種類型（A、B、AB、O）。當今血型檢驗的系統己經大大擴展，可以在刑事技術部門實際應用的血斑檢驗系統15-20個，精班檢驗系統5一6個（均含血型、血清型和酶型系統）。譬如，設在倫敦的國際刑警組織實驗室常規檢驗血液項目為13項，檢驗精液項目為5項，因而排除嫌疑的比率明顯增大。但是，各檢驗項目的聯合排除率並不等於各項目獨立排除率的簡單相加，而是：P=l-l（l-P1）（l-P2）……（l-Pn）。其中，Pl、P2……Pn分別代表各獨立血型系統的排除率，P為聯合排除率。從理論上可以看出，盡管檢驗項目擴展，但最終不能達到同一認定的目的。而DNA檢驗技術，則解決了這個關鍵問題。
法醫物證的DNA檢驗技術是本世紀80年代中期才開始研究和應用的，它藉助了新興的「分子生物學」和「遺傳工程學」的理論與技術。早在19世紀60年代，奧地利遺傳學家孟德爾在運用數學方法對植物遺傳性狀進行多年分析研究的基礎上，提出了著名的孟德爾遺傳定律，預言了遺傳因子的存在。到20世紀40年代，美國學者艾弗里等人證明了遺傳因子就是脫氧核糖核酸。1953年，美國生物學家沃森（JamsWatson）和英國物理學家克里克（FrancisCrick）發現並提出了DNA分子的雙螺旋結構理論與鹼基配對原則，開創了分子生物學。1989年，美國科學家用「掃描隧道顯微鏡」直接觀察到了脫氧核糖核酸的雙螺旋結構。1990年，我國青年科學家白春禮用自己研製的「掃描隧道顯微鏡」首次觀察到人們尚未認知的三鏈狀脫氧核糖核酸，為生命信息研究又辟新途。在60年代，經過許多科學家的共同努力，破譯了遺傳物質中的全部密碼，使人類對遺傳物質的認識進入了新的階段；1973至1974年，美國斯坦福大學的科恩博士在實驗室運用重組DNA的方法，改變了生物的遺傳信息，也改變了生物的遺傳性狀，開創了遺傳工程學。1985年，英國萊斯特大學三名遺傳學家亞歷克·傑費里斯（AlecJeffroys）、彼得·吉爾（PeterGil1）、戴維·沃雷特發現每個人的DNA分子中，鹼基的排列都是獨特的。事實上，除了同卵雙生子的DNA結構有相同的可能性之外，沒有任何兩個人存在相同的DNA.這一重大發現立刻引起法醫學界的高度重視，各國紛紛投向這一領域的研究。英國首先在移民糾紛中應用DNA檢驗手段確認母子親緣關系。
二
DNA是脫氧核糖核酸的英文（DoXyriboNucleicAcid）縮寫。它是在生物細胞核中普遍存在的大分子聚合物。它具有「自我復制」及「互補合成RNA（核糖核酸）」二項功能，使生物體的遺傳性狀得以在新生體上體現，因而被稱為「遺傳基因」。DNA的化學組成包括磷酸（P）、脫氧核糖（S）和四種含氮鹼基：腺嘌呤脫氧核苷酸（dAmp）、鳥嘌呤脫氧核苷酸（dGmp）、胞嘧啶脫氧核苷酸（dCmp）、胸腺嘧啶脫氧核苷酸（dTmp）。DNA的分子結構為兩條平行但方向相反的多個核苷背酸聚合長鏈，圍繞一個中心軸相對旋轉成雙螺旋狀（見圖一）
每條長鏈的外側排列著磷（P）和脫氧核糖（S），內側排列的四種鹼基依照A=T、T=A、G=C、C=G的對應關系由氫鍵連接，使雙鏈成一整體。在不同的DNA分子中，S與P的排列結構是相同的（一S一P一S一P一），但鹼基的排列順序不同。DNA分子中的鹼基雖只四種，但由氫鍵連接的鹼基對的數目少則幾千，多則數萬，組成極多的不同排列順序。這就構成了DNA分子結構的多樣性，從理論上解決了同一認定問題。
DNA分子的復雜結構具有三個重要特性：（1）人各不同；（2）終生不變；（3）同一人體各不同部位細胞中的DNA結構相同。法醫物證檢驗正是利用了這些可貴特性，依據攝取的DNA結構圖譜進行個體識別。這同利用指紋進行個體別的准確性相同，因而又被稱為「DNA遺傳指紋圖譜」。
三
目前，各國專家一般採用化學方法分離DNA，再用特殊的DNA探針檢驗，可以獲得代表每個人獨特基因組的DNA圖譜。其程序包括七個環節：
1、提齲先將DNA從檢材細胞核中提取出來。不同檢材的性質不同，提取和純化DNA的方法也不完全相同。如對精液與陰道分泌物混合的檢材：先裂解、洗滌，清除女性物質後，獲得純精子，再裂解取出DNA.
2、酶解。由特定的限制性內切酶裂解DNA分子長鏈。由於每個人DNA分子中鹼基排列呈現多樣性，所以酶切鹼基後，就獲得在數量和長度上體現個體差異的若干DNA片段。
3、電泳。瓊脂糖凝膠是一層充滿網孔的膠狀物，在電泳時，其一端為正極，另一端為負極。DNA片段帶負電，當將它加在凝膠負極板後，就會向正極緩慢泳動，泳動速度和距離取決於片段長度大校經過一段時間，DNA片段按長短順序排列開來。
4、轉移。經電泳展開的DNA片段通過吸印或真空轉移法，轉移並固定到硝酸纖維素膜或尼龍膜上。
5、探針標記與雜交。所謂探針標記，就是使用專門的特殊試劑，經過特定的反應，在不破壞DNA排列結構的前提下，使DNA片段能產生放射線（同位素探針），或顯色發光（非同位素探針），從而可以識別DNA片段。標記好的探針需與附著有DNA片段的轉移膜溫育，才能結合，這個過程叫「雜交」。雜交後清洗未結合的多餘探針。
6、顯影。將雜交好的膜與X光感光片重合放在暗盒內感光，再經顯影、定影，即得到DNA圖譜。
7、檢驗。將檢材DNA圖譜與嫌疑樣本DNA圖譜進行譜帶比較。一般若有15條以上譜帶相同，又不存在差異（不吻合譜帶），則可做認定結論。但現場檢材會由於各種客觀原因，使DNA圖譜不完整，所以用15條以上譜帶完全吻合為標準是不現實的。據觀察統計：每個個體平均具有的譜帶數16·8條，兩個不相關的個體間具有一條相同譜帶的概率為0·21，具有二條相同譜帶的概率為

3. 如何用dnasp分析多態性原理是什麼

RAPD技術是建立在PCR技術的基礎上，它用一系列(通常數百個)不同的隨機排列鹼基序列的寡核苷酸單鏈(一般為10個bp)作為引物，對所研究的基因組DNA進行單引物擴增。模板DNA經90—94變性 解鏈後在較低溫度(36～37℃)下退火，這時形成的單鏈模板會有許多位點與引物互補配對，在 72℃下，通過鏈延伸，形成雙鏈結構，完成DNA合成。重復上述過程，即可產生片段大小不等的擴增產物，通過電泳分離和顯色便可得到許多不同的條帶，從中 篩選出特徵性條帶。擴增產物片段的多態性反映了基因組DNA的多態性。如果基因組在這些區域內發生DNA片段插入、缺失或鹼基突變就可能導致這些特定結合 位點的分布發生相應的變化，而使PCR產物增加、缺少或發生分子量的改變。因此，通過對PCR產物的檢測即可測出基因組DNA在這些區域的多態性。進行 RAPD分析時，可用引物的數量很大，雖然對每個引物而言，其檢測基因組DNA多態性的區域是有限的，但是利用一系列引物則可以使檢測區域幾乎覆蓋整個基 因組。因此，RAPD可以對整個基因組DNA進行多態性檢測。

RAPD技術的優點：
①不使用同位素，減少了對工作人員健康的危害；
②可以在物種沒有任何分子生物學研究 的情況下分析其DNA多態性；
③對模板 DNA的純度要求不高；
④技術簡單，無需克隆DNA探針，無需進行分子雜交；
⑤靈敏度高，可提供豐富的多態性；
⑥RAPD引物沒有嚴格的種屬界限，同一套 引物可以應用於任何一種生物的研究，因而具有廣泛性、通用性。
但是，RAPD技術較易受到各種因素的影響。無論是模板的質量和濃度，短的引物序列，PCR的循環次數，基因組DNA的復雜性，技術設備等，都有可 能是RAPD技術重復性差的直接原因。目前，多從以下幾個方面來提高反應的穩定性：
①操作規范，反應體系的組成要力求一致，盡可能地使RAPD反應標准 化；
②提高擴增片段的解析度；
③將RAPD標記轉化為SCAR標記後再進行常規的PCR分析，可以提高反應的穩定性及可靠性。
,

4. PCR-RFLP檢測基因多態性的機理和主要實驗步驟

基因多態性的產生原因是一個也可以是多個核酸序列有所差異，而不產生顯性的生物結果．
造成的對於實驗原理的影響是，該差異通常造成產生一個酶切位點的特性，而無差異則不具有，也可以是原來有，差異後消失．總之可以利用酶切來判斷有無這種差異．
PCR的作用主要是擴充酶切原料，所以PCR的引物設計在你下一步要切割的兩側即可，PCR通常的高效擴充大約是復制100-500個BP的產物，當然隨著現代技術的提高，也沒有必要強行復合這個原則．
另外，由於將來切完了要電泳看，所以最好設計的時候切的位置不在中心．當然這點我覺得不是那麼重要了．
PCR完跑跑電泳試試，能清晰看到就好．
然後就內切酶來切，注意避免incomplete
digest,就是最好切的時間充足BUFFER濃度要正確．
切完了跑，能看出不同的，就是有差異．
舉例，原本含有GGACCC，有差異的是GGGCCC，那麼原本的不能被APAI
切，有差異的能．
PCR復制，不管是啥，把這段爭議的包含在裡面，然後APAI切了跑．比如說復制500BP，切了以後理論是200+300
如果完全不切，只見500，那就是沒差異序列存在．
如果既有500，也有200
+300，
那麼就可能是一個序列有，另外一個無．當然，也可能是酶切不徹底，要避免．
如果只有200+300，那麼就是兩個序列都有．
最後基本上定論還是需要SEQUENCING來定．
RFLP常常是用來SCREENING一下．

5. DNA怎麼提取

DNA提取主要是CTAB方法，其他的方法還有物理方式如玻璃珠法、超聲波法、研磨法、凍融法。化學方式如異硫氰酸胍法、鹼裂解法。生物方式：酶法。根據核酸分離純化方式的不同有；硅質材料、陰離子交換樹脂等。

提取DNA總的原則:

1.保證核酸一級結構的完整性；

2.核酸樣品中不應存在對酶有抑製作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子；

3.其他生物大分子如蛋白質、多糖和脂類分子的污染應降低到最低程度；

4.其他核酸分子，如RNA，也應盡量去除。

例如 : 用酶法提取

DNA提取分為三個基本步驟，每個步驟的具體方法可根據樣品種類、影響提取的物質以及後續步驟的不同而有區別。

工具/原料: 研磨棒、研磨儀或者組織破碎儀 , 氯仿：異戊醇（24:1）或者蛋白酶 , RNA酶 , 酒精 , 冰箱

方法/步驟 :

1. 使用研磨儀、研磨棒或者使用超聲破碎細胞的方法破碎細胞，加入去污劑，如sds等，除去膜脂。

2. 去除細胞內的蛋白質，包括與DNA結合的組蛋白，通過加入蛋白酶，醋酸鹽沉澱，或者酚／氯仿抽提等方法去除。

3. 加入RNA酶去除RNA，如實驗不嚴密，可省略此步。

4. 沉澱DNA，需在冷乙醇或異丙醇中沉澱，放在冰箱-20℃沉澱30分鍾以上，原理是DNA在醇中不可溶而黏在一起發生沉澱。

總結: DNA提取方法有下面⑦種

一.酚抽提法：先用蛋酶K、SDS破碎細胞，消化蛋白，然後用酚和酚-氯DNA大小為100-150kb

二.甲醯胺解聚法：破碎細胞同上，然後用高濃度甲醯胺解聚蛋白質與DNA的結合，再透析獲得DNA可得DNA200kb左右。

三.玻璃棒纏繞法：用鹽酸胍裂解細胞，將裂解物鋪於乙醇上，然後用帶鉤或U型玻璃棒在界面輕攪，DNA沉澱液繞於玻棒。生成DNA約80kb。

四.異丙醇沉澱法：基本同1法，僅用二倍容積異丙醇替代乙醇，可去除小分子RNA（在異丙醇中可溶狀態）

五.表面活性劑快速制備法：用Triton X-100A或NP40表面活性劑破碎細胞，然後用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉澱或透析。

六.加熱法快速制備：加熱96℃-100℃，五分鍾，然後離心後取上清，可用於PCR反應。

七.鹼變性快速制備：先用NaOH作用20分鍾，再加HCI中和，離心後取上清，含少量DNA。

6. 要做基因多態性分析，哪種方法提取DNA要好點

1．限制性片段度態性（Restriction Fragment Length PolymorphismRFLP）：由DNA 態性致使DNA 限制酶切位點及數目發改變用限制酶切割基組所產片段數目每片段度同即所謂限制性片段度態性導致限製片段度發改變酶切位點稱態性位點早用Southern Blot/RFLP檢測採用聚合酶鏈反應（PCR）與限制酶酶切相結合現採用PCR-RFLP進行研究基限制性片段度態性
2．單鏈構象態性（SSCP）：種基於單鏈DNA構象差別點突變檢測相同度單鏈DNA順序同甚至單鹼基同形同構象電泳泳速度同PCR產物經變性進行單鏈DNA凝膠電泳靶DNA若發單鹼基替換等改變現泳變位（mobility shift）用於鑒定否存突變及診斷未知突變

7. 提取基因組DNA的方法有哪些各有何優缺點

1、苯酚氯仿抽提法

優點是採用了實驗室常見的試劑和葯品，做起來成本比較低廉。

缺點是由於使用了苯酚、氯仿等試劑，毒性較大，長時間操作對人員健康有較大影響，而且核酸的回收率較低，損失量較大，由於操作體系大，不同實驗人員操作重復性差，不利於保護RNA，很難進行微量化的操作。

2、離心柱法

離心柱法DNA提取它的優點是比傳統的酚氯法提取的純度高，有利於RNA保護，而且能進行微量操作，以其低廉的價格和相對便捷的操作，漸逐取代了傳統DNA提取方法，被高校科研所等市場普遍接受。

離心柱法DNA提取的缺點是需要較多的樣本，耗材多，對於珍稀樣本無能為力，特別是在法醫、考古等領域顯得力不從心。

同時離心柱法DNA提取需要反復離心，不便於高通量、自動化操作，與現代生物學實驗的高通量、自動化要求格格不入，特別是在基因診斷、疾病檢測、轉基因檢測等領域，離心柱法DNA提取需要大量的操作人員及儀器設備。

當面對突發疫情時，更是需要有高通量的DNA提取設備與方法才能更有效准確的監測疫情、控制疫情。

3、磁珠法

磁珠法是納米科技與生物技術的完美結合，具有其他DNA提取方法無法比擬的優勢，主要體現在：

（1）能夠實現自動化、高通量操作，配合96孔的核酸自動提取儀，在以往做一個樣品的提取時間內可同時實現對96個樣品的處理，效率直接提高96倍，滿足了當前生物學高通量操作的要求，使得在大規模疫情爆發時能夠進行快速篩查原因，這個優點是其他方法難以趕超的。

（2）操作簡單、用時短，整個提取流程只有裂解、結合、洗滌、洗脫四步短時間內即可完成。

（3）安全無毒，不使用傳統方法中的苯、氯仿等有毒試劑，對實驗操作人員的傷害少，保護了實驗人員的身體健康。

（4）磁珠與核酸的特異性結合使得提取的核酸純度高、濃度大。

（5）靈敏度高，適合法醫樣本等痕量DNA提取。

(7)基因多態性檢測方法提取DNA擴展閱讀：

磁珠法的原理是在磁珠表面修飾有對核酸有吸附作用的特定活性官能基團，通過不同的裂解液結合液洗滌液在特定的條件下能夠與目的物質進行特異性結合，同時利用磁珠自身的磁性，在外磁場的作用下可以方便地實現定向移動與富集，從而達到核酸與雜質分離的目的，進而實現對目標物質的分離純化，獲得純化核酸。

8. 我的試驗是要做一個基因多個位點的多態性，先提取基因組DNA,然後PCR擴增目的片段，之後酶切

酶，是限制性內切酶。每種酶會在DNA上尋找特異的鹼基排列，找到後再在特定位置進行剪切，把DNA雙鏈剪短。跑瓊脂糖電泳時就會看到，含有酶切位點的DNA變小了，而不含的維持原來大小。這種多態性檢測，就是通過觀察片段大小判斷酶切位點鹼基是否有變化。

9. 植物DNA提取中怎樣檢測提取到DNA質量

第一種方法是測量260/280的比例，判斷是否有蛋白質的污染。在260nm和280nm處測定DNA溶液的光吸收，A260與A280之比應在1.75-1.80之間。低於此值表明制備物中殘留蛋白質成分較高或含有酚，高於此值表明有RNA的殘留。

第二種方法是凝膠電泳分析，看有無斷裂降解。

影響DNA提取質量的因素：

如果實驗開始植物樣品不經液氮處理，則提取液中的CTAB濃度需要提高到4%。

在大多數情況下，使用0.1%巰基乙醇，並不能完全抑制葉片中的氧化作用。但這種氧化作用不會影響限制性內切酶的活性。如果使用的巰基乙醇濃度高於0.1%，則會大大降低DNA提取的得率。

(9)基因多態性檢測方法提取DNA擴展閱讀：

DNA的提取方法：

一、酚抽提法：先用蛋酶K、SDS破碎細胞，消化蛋白，然後用酚和酚-氯萃取，高速離心後取上清，所得DNA大小為100-150kb

二、甲醯胺解聚法：破碎細胞同上，然後用高濃度甲醯胺解聚蛋白質與DNA的結合，再透析獲得DNA可得DNA200kb左右。

三、玻璃棒纏繞法：用鹽酸胍裂解細胞，將裂解物鋪於乙醇上，然後用帶鉤或U型玻璃棒在界面輕攪，DNA沉澱液繞於玻棒。生成DNA約80kb。

四、異丙醇沉澱法：基本同1法，僅用二倍容積異丙醇替代乙醇，可去除小分子RNA（在異丙醇中可溶狀態）

五、表面活性劑快速制備法：用Triton X-100A或NP40表面活性劑破碎細胞，然後用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉澱或透析。

六、加熱法快速制備：加熱96℃-100℃，五分鍾，然後離心後取上清，可用於PCR反應。

七、鹼變性快速制備：先用NaOH作用20分鍾，再加HCI中和，離心後取上清，含少量DNA。