細胞壞死的檢測方法

⑴ 凋亡檢測的方法有哪些呢

細胞發生早期凋亡時，細胞膜表面的磷脂醯絲氨酸（PS）會從細胞膜內轉移到細胞膜外，Annexin V是一種Ca2+依賴的磷脂結合蛋白，對PS具有高度的親和性。因此，該蛋白可充當一敏感的探針檢測暴露在細胞膜表面的PS。PS的外翻不是凋亡細胞所獨特的，也可發生在壞死的細胞中。兩種細胞死亡方式間的差別在於細胞凋亡的初始階段細胞膜是完好的，而細胞壞死在其早期階段細胞膜的完整性就破壞了。PI或7-AAD染料可以通過細胞膜進入胞內與DNA結合。因此，可以建立一種用Annexin V結合在細胞膜表面作為凋亡的指示並結合PI或7-AAD染料來檢測細胞膜的完整性的檢測方法。美國BioGems公司生產的AnnexinV-APC/7-AAD凋亡檢測試劑盒無需調節補償，染色操作簡單，實驗結果更准確，尤其適合於有自發熒光干擾的細胞凋亡檢測。具體可以咨詢蘇州奕賽生物科技有限公司，BioGems品牌在中國的唯一合法代表，網路網友為您解答，望採納。

⑵ tunel法與HE 染色都能檢測細胞壞死與凋亡，具體選擇哪種方法好，兩者有何不同

做凋亡的話一般用TUNEL，HE一般作為一般染色，要根據細胞形態判斷，TUNEL可以標記出凋亡細胞

⑶ 除了改良苯酚品紅染色,還有哪些染色方法可以檢測植物細胞程序性死亡,其原理是

用台盼藍染色，死細胞會被染成藍色，而活細胞不著色，從而判斷細胞死活

死細胞的鑒別一般通過DNA結合染料排除，利用死細胞膜通透性增大、不破膜的情況下DNA染料即可進入的特點區分出死細胞，但所用染料濃度、時間遠遠低於細胞周期所用的濃度，並且不需要固定。

常用的核酸結合死活鑒別染料包括：

碘化丙啶（propidium iodide，PI）

4'，6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽（4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride，DAPI）

7-氨基 - 放線菌素D（7-amino-actinomycin D ，7-AAD）

DRAQ7

SYTOX

不過對於一些胞內抗原（細胞因子、轉錄因子），由於需要固定、破膜，所以上述染料中，除了一些胺類染料（如Live/Dead、Ghost等）和新型蒽醌類染料CyTRAK Orange外，其它染料不再適合此類標本的細胞死活鑒別。

這里，只向大家講解一下用PI、7-AAD、DAPI的染色方法，其它商品化死活染料請按照說明書操作：

1. 用0.5ml 1×PBS重懸細胞。

2. 加入PI或DAPI或7-AAD，終濃度分別為PI（5 µg/ml）、DAPI（500-1000 ng/ml）、7-AAD（2.5 µM）

3. 加入上述染料後，盡快上機，一般不要超過5分鍾（有些廠家說明書寫著10分鍾，可能與濃度有關，可按照說明書操作）。

PI檢測通道：使用488 nm激發，用610/20 BP收集

DAPI檢測通道：最好用355nm激發，用440/40BP收集；也可以用405nm激發，450/50BP收集

7-AAD檢測通道：用488nm激發，用670/14BP收集

下圖是用PI檢測細胞死活的結果圖：

1、細胞死亡：細胞死亡作為生物體的一種常見現象，在動物細胞中有三種方式：凋亡（apoptosis），自噬（autophagy）和壞死（necrosis）。前兩種類型屬於細胞程序性死亡（programmedcelldeath，PCD）。細胞壞死是細胞在遭受極度刺激時引起的細胞死亡，以細胞質膜的破裂為特徵，造成內含物的炎性泄露，是一種非正常死亡。細胞的PCD是細胞的一種「主動性」死亡行為，從形態上和功能上都與細胞壞死有很大的不同。

2、植物中細胞程序性死亡（PCD）：目前可依據液泡膜破裂後，是否在細胞質中發生快速降解將PCD分為兩個大類。第一類為自溶性（autolytic）PCD，與液泡中的水解酶的釋放有關，在液泡破裂後，導致細胞質的快速清除。第二種為非自溶PCD，（non-autolytic），即液泡膜破裂但是沒有出現快速的細胞質的清除。目前鑒定細胞的PCD類型，還是以細胞形態學為主。

3、動植物細胞凋亡標准：動物：凋亡：凋亡小體，或者在細胞表面的水泡，感染病原體後在其他細胞中的降解。自噬：自噬小體，自溶酶體，和小的促進細胞溶解的液泡數目的增加壞死：沒有上面的定義的標准。植物：自溶：植物膜破裂之後對細胞質的快速清理。非自溶：沒有對細胞質的快速清理。其他：染色質濃縮細胞核破裂自我標記信號自食信號細胞膨脹，細胞器膨脹，質膜破裂染色質濃縮。液泡體積增加（細胞質體積減小）需要Ca2+的內流，細胞質皺縮，細胞器膨脹，小泡增多但體積不增加。

⑷ 判斷細胞死活的方法

鑒定細胞死活的方法
死活細胞的鑒定在生物學和醫學上具有很重要的意義.細胞培養過程中要隨時記錄細胞的生長情況,需要經常測定細胞的存活率；在腫瘤細胞的研究中,為了檢驗各種葯物對腫瘤細胞的殺傷力,也需要測定腫瘤細胞的存活率.在臨床醫學中死活細胞的鑒定也有很大的應用,例如為了檢測某一男子的生育能力,測定精子細胞的存活力是比較常用的辦法.
死活細胞的鑒定方法有很多種,常用的有染色法和儀器分析法.染色法是常用的細胞死活鑒定方法,簡便,易於操作.但是通過直接的形態觀察來鑒別細胞死活,實驗結果很容易受操作者的主觀因素的影響,存在一定的誤差,所以,在實際操作中也常採用一些儀器來進行精確的批量檢測.
不同的死活細胞鑒定方法有各自不同具體的反應機理,但無論採用何種辦法,都是利用了死活細胞在生理機能和性質上的差異.
常用的方法包括染色法和儀器分析法.
1 染色法
染色法分化學染色法和熒光染色法,根據染色機理的不同,染料或使死細胞著色,或使活細胞著色.死活細胞在生理機能和性質上的差異主要包括：
死活細胞細胞膜通透性的差異：活細胞的細胞膜是一種選擇性膜,對細胞起保護和屏障作用,只允許物質選擇性的通過；而細胞死亡之後,細胞膜受損,通透性增加.常用的以台盼藍鑒別細胞死活的方法就是利用了這一性質.台盼藍,又稱錐藍,是一種陰離子型染料,不能透過完整的細胞膜.所以經台盼藍染色後只能使死細胞著色,而活細胞不被著色.甲基藍有類似的染色機理.植物細胞的質壁分離也可鑒定死活.
死活細胞在代謝上的差異：是採用美藍染料鑒定酵母細胞死活的依據.美藍是一種無毒染料,氧化型為藍色,還原型為無色.由於活細胞中新陳代謝的作用,使細胞內具有較強的還原能力,能使美藍從藍色的氧化性變為無色的還原型,因此美藍染色後活的酵母細胞無色；而死細胞或代謝緩慢的老細胞,則因它們的無還原能力或還原能力極弱,使美藍處於氧化態,從而被染成藍色或淡藍色.
熒光素雙醋酸酯（FDA）是一種常用的培養動植物細胞以及植物細胞原生質體的生活力鑒定染料,其染色機理也利用了死活細胞在代謝上的差異：FDA本身不產生熒光,也無極性,能自由滲透出入完整的細胞膜.當FDA進入活細胞後,被細胞內的脂酶分解,生成有極性的、能產生熒光的物質——熒光素,該物質不能自由透過活的細胞膜,積累在細胞膜內,因而使有活力的細胞產生綠色熒光；而無活力的細胞因不能使FDA分解,而無法產生熒光.
除此之外,還有一些細胞器的專有染料.如液泡系的專有染料中性紅.中性紅是一種低毒性染料,可以使活細胞液泡著紅色,而細胞質和細胞核不被著色；死細胞的液泡不被著色或淺染,染料彌散於整個細胞中,細胞核和細胞質被染成紅色.有時侯為了增加染色效果可以將兩種染料結合使用,如甲基藍-中性紅混合染色法.
2 儀器分析法
可採用微電極技術（利用死活細胞膜兩側電位的差異）、全自動分析細胞記數儀和流式細胞儀等,可對細胞的死活進行精確的批量檢測.
德國INNOVATIS出產的全自動Cedex細胞存活率/細胞計數儀/細胞分析儀是世界上第一台高解析度、高清晰度掃描(專利)細胞分析儀,具有全自動台盼藍染色、顯微CCD成象、CEDEX工作站軟體,可用於制葯、醫學、發酵、免疫、病理、毒性測試、生物技術等學科的研究開發和工業生產過程中的細胞計數和分析.自動分析結果,檢測分析數據輸出（11項)：總細胞數目,總細胞濃度 (cells/mL) ；活細胞數目,活細胞濃度 (cells/mL)；死細胞數目,死細胞濃度 (cells/mL) ；細胞存活率 (%) ；細胞的平均圓度 (compactness) ；細胞的平均直徑 (um) ；細胞團比例 （Aggregate Rate）；細胞直徑分布圖 （Diameter Histogram）；細胞團分布圖 （Aggregate Histogram）；細胞圓度分布圖 (Compactness Histogram) ；細胞生長時間曲線（Cultivation Time Chart）.
流式細胞儀法用來判斷細胞死活的常用熒光探針有二大類：一類是能透過活的細胞膜進入細胞內而發出熒光的物質,例如FDA可被活細胞持留而發出黃綠色熒光,若細胞有損傷則會從細胞中流失,觀察不到熒光.另一類是不能透過活細胞膜,但能對固定的細胞及膜有破損的細胞的核進行染色,例如碘化丙啶（ PI,Propidium iodide ）和溴化乙錠（ EB,Ethidium bromide ）就是常用的第二類熒光探針.碘化丙啶(PI)不能穿透細胞膜,對於具有完整細胞膜的正常細胞或凋亡細胞不能染色.而對於壞死細胞,其細胞膜的完整性喪失,碘化丙啶(PI)可以染色壞死細胞.目前常用的一種細胞凋亡與壞死檢測試劑盒則含有Hoechst 33342和碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)兩種熒光染料.細胞發生凋亡時,染色質會固縮,Hoechst 33342可以穿透細胞膜,染色後凋亡細胞熒光會比正常細胞明顯增強.上述兩種染料雙染後,使用流式細胞儀或熒光顯微鏡檢測時,正常細胞為弱紅色熒光＋弱藍色熒光,凋亡細胞為弱紅色熒光＋強藍色熒光,壞死細胞為強紅色熒光＋強藍色熒光.
詳見：
http://hi..com/%D1%A7%CE%DE%D6%B9%BE%B3iewwei/blog/item/44eb4a0c132ade3de924888d.html

⑸ BMG多功能酶標儀實時監測細胞凋亡和細胞壞死

CLARIOstar ACU提供了在可控環境下進行細胞凋亡和細胞壞死的實時監測生理條件

多指標RealTime-Glo™ Annexin V凋亡和壞死分析試劑盒檢測細胞凋亡時的磷脂醯絲氨酸外翻事件以及細胞壞死引起的細胞膜完整性喪失

簡介

雖然細胞死亡是一個重要的、正常的多細胞因素動態平衡的結果，但往往在很多人類疾病中扮演不利角色。對靶向細胞毒性物質和細胞保護劑的了解將有助於對癌症、神經退行性疾病和其它一系列疾病的治療。若要對疾病模型中，引起失調的因素以及外部刺激反應進行充分的了解，構建細胞死亡的作用機制及動力學分析過程很有必要。傳統的實驗方法往往存在耗時、耗費人力、代價昂貴且信息不完整的特點。

這里我們介紹一種實時監測細胞凋亡和細胞壞死的新方法。Promega公司新推出的RealTime-Glo™ Annexin V細胞凋亡和細胞壞死分析試劑盒提供了一種簡單的活細胞樣本「加樣-讀數」的實時監測實驗方法。而由BMG LABTECH公司生產的CLARIOstar ACU提供了實時、同時檢測發光和熒光信號，並同時維持實驗樣品細胞所需的[O2]和[CO2]。兩者的有機組合為您提供了一個完美的無人值守的解決方案：只需加樣完成開始實驗，則可完全由儀器自動實時檢測所需的參數，您將不會錯過任何條件變化引起的重要反應參數。

RealTime-Glo™ Annexin V細胞凋亡檢測

圖1：RealTime-Glo™ Annexin V細胞凋亡和細胞壞死分析試劑盒原理：兩個Annexin V-螢火蟲熒光素酶（NanoBiT™）亞基融合蛋白轉染到細胞中且在健康細胞中不會產生發光信號。當與PS相結合時將生成完整的酶並產生發光信號。而細胞膜的完整性則用改良的細胞壞死檢測熒光探針來檢測。

磷脂醯絲氨酸（PS）位置的改變-從細胞膜內側外翻到細胞膜外側被認為是正常細胞進入凋亡狀態的標志信號。多重分析中利用Annexin V結合於PS來檢定細胞凋亡的開始。

RealTime-Glo™ Annexin V細胞凋亡和細胞壞死分析試劑盒利用了兩個Annexin-螢火蟲熒光素酶（NanoBiT™）亞基融合蛋白並且只有與PS產生親和時才形成有活性熒光素酶的特點。在兩種融合蛋白亞基充足的情況下，完整酶的產生量實時報告了PS的外翻。而細胞壞死檢測試劑則報告因細胞壞死引起的細胞膜膜完整性的改變。兩者結合則構建了一個可實時監測的細胞死亡作用機制（細胞凋亡、原發性壞死或其它原因）。

材料和方法

RealTime-Glo™ Annexin V細胞凋亡和細胞壞死分析試劑盒(Promega, Cat #JA1011)

CLARIOstar ACU（BMG LABTECH）

白色、透明或不透明底96孔板（Costar）

K562細胞（來自ATCC）

陰性選擇自然殺傷細胞（NK）（來自Lonza）

其它試劑購自市場

RealTime-Glo™ Annexin V細胞凋亡和細胞壞死分析試劑盒中所有試劑都按照說明書進行准備和加樣。

對於劑量響應實驗，起始最大濃度為10 μM 的bortezomib進行8個梯度系列稀釋，加入到接種有10,000細胞/孔的K562細胞中，實驗包括葯物溶劑對照處理（Vehicle treatment）和無細胞空白對照。

NK細胞的實驗中，NK細胞用IL-15處理，然後按比率接種到K562細胞中。單獨的NK細胞或K562細胞作為對照。利用CLARIOstar多功能酶標儀進行檢測和培養，儀器設置如下。

結果和討論

在加入bortezomib後的48小時中，每1個小時用CLARIOstar ACU進行發光和熒光的實時雙重檢測（49個循環）。圖8中的PS-外翻響應（發光）領先於細胞壞死響應（熒光）表明治療型蛋白酶體抑制劑達到預期的凋亡作用。

圖2：同時檢測PS陽性（紫色）和膜完整性（橙色）

圖3說明可以從單一的試驗中獲得多個時間-劑量響應曲線。結果進一步說明了應答量中劑量和時間之間的關系。試驗中同時獲得相類似的結果用於測定繼發性壞死引起的細胞膜完整性改變（數據沒有列出）。

最後的實驗探究了經過刺激的自然殺傷性細胞（NK）對靶細胞的先天性能力：參與並誘導了K562癌細胞的凋亡。實驗在細胞混合後的兩小時內每5分鍾檢測一次（25個循環）。數據表明PS-外翻和細胞死亡程度與NK細胞數量成正相關關系（數據沒有列出）。

圖3：不同時間點凋亡的劑量應答曲線。Bortezomib葯物處理（n=4）後不同時間點的劑量應答曲線。作為凋亡信號的PS外翻信號在12小時處可被儀器檢測到並且在12到24小時之間呈現明顯增加的狀態。發光信號大小表明了凋亡發生的程度。

圖4說明了NK細胞對靶細胞的比例的增加與凋亡量也就是發光信號強度之間的關系。

圖4：自然殺傷細胞活力分析。RealTime-Glo™ Annexin V細胞凋亡和細胞壞死分析結果表明在低效靶比時NK細胞也存在顯著的殺傷力，且隨著效靶比的增加而顯著提高。

結論

結果表明一種新穎的分析方法和儀器的有機結合，開創了一種無人值守且可獲得出色結果的細胞凋亡和細胞壞死研究解決方案。檢測結果的實時自然屬性讓您輕松獲得以往通過繁重的凋亡分析工作才能獲得的有用信息。

參考資料

1. S.J. Martin et al. (1995) J. Exp. Med. 182, 1545-1556.

2. A. S. Dixon et al. (2016) ACS Chem. Biol. 11, 400-408.

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⑹ 怎樣鑒定細胞凋亡

細胞凋亡的檢測

細胞凋亡與壞死是兩種完全不同的細胞凋亡形式，根據死亡細胞在形態學、生物化學和分子生物學上的差別，可以將二者區別開來。細胞凋亡的檢測方法有很多，下面介紹幾種常用的測定方法。

一、細胞凋亡的形態學檢測
根據凋亡細胞固有的形態特徵，人們已經設計了許多不同的細胞凋亡形態學檢測方法。
1 光學顯微鏡和倒置顯微鏡
（1） 未染色細胞：凋亡細胞的體積變小、變形，細胞膜完整但出現發泡現象，細胞凋亡晚期可見凋亡小體。
貼壁細胞出現皺縮、變圓、脫落。
（2） 染色細胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細胞的染色質濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質分割
成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態。
2 熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡
一般以細胞核染色質的形態學改變為指標來評判細胞凋亡的進展情況。
常用的DNA特異性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三種染料與 DNA的結合是非嵌入式的，主要結合在DNA的A-T鹼基區。紫外光激發時發射明亮的藍色熒光。
Hoechst是與DNA特異結合的活性染料，儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用時用PBS稀釋成終濃度為2~5mg/ml。
DAPI為半通透性，用於常規固定細胞的染色。儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用終濃度一般為0.5 ~1mg/ml。
結果評判：細胞凋亡過程中細胞核染色質的形態學改變分為三期：Ⅰ期的細胞核呈波紋狀（rippled）或呈折縫樣（creased），部分染色質出現濃縮狀態；Ⅱa期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化；Ⅱb期的細胞核裂解為碎塊，產生凋亡小體(圖1)。
3 透射電子顯微鏡觀察
結果評判：凋亡細胞體積變小，細胞質濃縮。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的細胞核內染色質高度盤繞，出現許多稱為氣穴現象（cavitations）的空泡結構(圖2)；Ⅱa期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化；細胞凋亡的晚期，細胞核裂解為碎塊，產生凋亡小體。

二、磷脂醯絲氨酸外翻分析（Annexin V法）

磷脂醯絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位於細胞膜的內側，但在細胞凋亡的早期，PS可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環境中(圖3)。Annexin-V是一種分子量為35~36KD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力特異性結合。將Annexin-V進行熒光素（FITC、PE）或biotin標記，以標記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發生。
碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區分開來。
方法
1 懸浮細胞的染色：將正常培養和誘導凋亡的懸浮細胞（0.5~1×106）用PBS洗2次，加入100ul Binding Buffer和FITC標記的Annexin-V（20ug/ml）10ul，室溫避光30min，再加入PI（50ug/ml）5ul，避光反應5min後，加入400ul Binding Buffer，立即用FACScan進行流式細胞術定量檢測（一般不超過1h）， 同時以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作為陰性對照。
2 貼壁培養的細胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗滌、染色和分析同懸浮細胞。
3 爬片細胞染色：同上，最後用熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡進行觀察。
結果 [圖4、圖5]
注意事項
1. 整個操作動作要盡量輕柔，勿用力吹打細胞。
2. 操作時注意避光，反應完畢後盡快在一小時內檢測。

三、線粒體膜勢能的檢測
線粒體在細胞凋亡的過程中起著樞紐作用，多種細胞凋亡刺激因子均可誘導不同的細胞發生凋亡，而線粒體跨膜電位DYmt的下降，被認為是細胞凋亡級聯反應過程中最早發生的事件，它發生在細胞核凋亡特徵（染色質濃縮、DNA斷裂）出現之前，一旦線粒體DYmt崩潰，則細胞凋亡不可逆轉。
線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽離子熒光染料如Rhodamine 123、3，3-Dihexyloxacarbocyanine iodide[DiOC6（3）]、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide[JC-1]、Tetramethyl rhodamine methyl ester(TMRM)等可結合到線粒體基質，其熒光的增強或減弱說明線粒體內膜電負性的增高或降低。
方法：將正常培養的細胞和誘導凋亡的細胞加入使用終濃度為Rhodamine 123（1mM）或終濃度為DiOC6（25nM），JC-1（1mM），TMRM（100nM），37°C平衡30min，流式細胞計檢測細胞的熒光強度。
注意事項
1． 始終保持平衡染液中pH值的一致性，因為pH值的變化將影響膜電位。
2． 與染料達到平衡的細胞懸液中如果含有蛋白，他們將與部分染料結合，降低染料的濃度，引起假去極化。

四、DNA片斷化檢測
細胞凋亡時主要的生化特徵是其染色質發生濃縮, 染色質DNA在核小體單位之間的連接處斷裂, 形成50~300kbp長的DNA大片段, 或180~200bp整數倍的寡核苷酸片段, 在凝膠電泳上表現為梯形電泳圖譜(DNA ladder)。細胞經處理後，採用常規方法分離提純DNA，進行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色，在凋亡細胞群中可觀察到典型的DNA ladder。如果細胞量很少，還可在分離提純DNA後，用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）使DNA標記，然後進行電泳和放射自顯影，觀察凋亡細胞中DNA ladder的形成。
1. 大分子染色體DNA片段的測定
細胞凋亡的早期,染色體斷裂成為50~300kbp長的DNA大片段。所有超過一定分子量大小的雙鏈DNA分子在瓊脂糖凝膠中的遷移速度相同。線性DNA的雙螺旋半徑超過凝膠半徑時，即達到分辨力的極限。此時凝膠不再按分子量的大小來篩分DNA，DNA像通過彎管一樣，以其一端指向電場一極而通過凝膠，這種遷移模式稱之為"爬行"。因此，細胞凋亡早期產生的50~300kbp長的DNA大片段不能用普通的瓊脂糖凝膠電泳來分離。通常採用脈沖電泳技術可圓滿地解決這一問題。這個方法是在凝膠上外加正交的交變脈沖電場。每當電場方向改變後，大的DNA分子便滯流在爬行管中，直至新的電場軸向重新定向後，才能繼續向前移動。DNA分子量越大，這種重排所需要的時間就越長。當DNA分子變換方向的時間小於電脈沖周期時，DNA就可以按其分子量大小分開。
參考文獻 Brown,D.G., Sun, X.M., and Cohen, G.M.(1993) Dexamethasone-inced apoptosis involves cleavage of DNA to large fragments prior to internucleosomal fragmentation. J. Biol.Chem. 268, 3037-3039
2． DNA Ladder 測定
方法：收獲細胞（1′107）沉澱?細胞裂解液?13000rpm′5min, 收集上清?1%SDS和RnaseA（5mg/ml）56°C，
2h?蛋白酶K（2.5mg/ml）37°C，2h?1/10體積3M醋酸鈉和2.5倍體積的冷無水乙醇沉澱DNA，4°C過夜?14000rpm′15min?最後將沉澱溶解在TE buffer中，加DNA Loading Buffer?1.2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色並照相。
結果：[圖6]
參考文獻 Herrmannm M, Lorenz HM, Voll R et al. A Rapid and simple method for the isolation of apoptotic DNA fragments. Nucleic Acid Res. 1994; 22:5506-5507
3． 凋亡細胞DNA含量的流式細胞計分析
方法：收集細胞?70%冷乙醇（in PBS）4°C固定過夜?PBS洗滌，1000rpm′10min?RNase A（0.5mg/ml）37°C消化30min?PI（50mg/ml）染色，室溫避光15min?FACScan分析DNA亞二倍體的形成及細胞周期的變化。
結果：[圖7]
4. ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay (CLONTECH)
優點：敏感度高，適合於檢測少量樣本，小部分凋亡細胞。如臨床活組織檢測。

五 TUNEL法
細胞凋亡中, 染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、鹼性磷酸酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3'-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由於正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被染色。TUNEL實際上是分子生物學與形態學相結合的研究方法，對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，能准確地反應細胞凋亡典型的生物化學和形態特徵，可用於石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養的細胞和從組織中分離的細胞的細胞形態測定，並可檢測出極少量的凋亡細胞，因而在細胞凋亡的研究中被廣泛採用。

六、Caspase-3活性的檢測

Caspase家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中caspase-3為關鍵的執行分子，它在凋亡信號傳導的許多途徑中發揮功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在於胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個大亞基（17KD）和兩個小亞基（12KD）組成，裂解相應的胞漿胞核底物，最終導致細胞凋亡。但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞，caspase-3的活性明顯下降。
1 Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及對底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解。
方法：
收集細胞→PBS洗滌→抽提細胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE電泳→硝酸纖維素膜或PVDF膜轉移→5%脫脂奶粉封閉，室溫1.5~2h或4°C過夜→Caspase-3多抗或單抗室溫反應1~2h或4°C過夜→TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗3次，5~10min/次→HRP-標記的羊抗鼠IgG或AP標記的羊抗鼠IgG室溫反應1~2h→ TBS-T洗3次， 5~10min/次?→ECL顯影或NBT/BCIP顯色。
結果：[圖8-1、圖8-2]
2 熒光分光光度計分析
原理：活化的Caspase-3能夠特異切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽鍵。根據這一特點，設計出熒光物質偶聯的短肽Ac-DEVD-AMC。在共價偶聯時，AMC不能被激發熒光，短肽被水解後釋放出AMC，自由的AMC才能被激發發射熒光。根據釋放的AMC熒光強度的大小，可以測定caspase-3的活性，從而反映Caspase-3被活化的程度。
方法：收獲細胞正常或凋亡細胞?PBS洗滌?制備細胞裂解液?加Ac-DEVD-AMC（caspase-3四肽熒光底物）?37°C反應1h?熒光分光光度計（Polarstar）分析熒光強度（激發光波長380nm，發射光波長為430-460nm）。
結果：[圖9]
3 流式細胞術分析
方法：收獲細胞正常或凋亡細胞?PBS洗滌?加Ac-DEVD-AMC?37°C反應1h?UV流式細胞計分析caspase-3陽性細胞數和平均熒光強度。
結果：[圖10]

七、凋亡相關蛋白TFAR19蛋白的表達和細胞定位分析
TFAR19（PDCD5）是由本研究室在國際上首先報導的一個擁有自己知識產權的人類新基因，前期的功能研究表明，它是促進細胞凋亡的增強劑。利用熒光素（FITC）標記的TFAR19單克隆抗體為探針，對細胞凋亡過程中TFAR19蛋白的表達水平及定位研究發現，凋亡早期TFAR19表達水平增高並出現快速核轉位現象，伴隨著細胞核形態學的變化，持續較長時間，在凋亡小體中仍然可見。同時我們發現，凋亡早期TFAR19蛋白的核轉位早於磷脂醯絲氨酸（PS）外翻和細胞核DNA的片段化，提示TFAR19蛋白的核轉位是細胞凋亡更早期發生的事件之一。進一步的研究證明，凋亡早期TFAR19的核轉位具有普遍意義，不同細胞凋亡早期均出現TFAR19高表達和核轉位。這為研究細胞凋亡早期所發生的事件，提供了一種新的技術和指標。
（一）TFAR19蛋白的細胞定位分析
材料試劑：
FITC標記的單克隆抗體，pH7.4 、0.15Mol/L PBS，3%的多聚甲醛，PBS-T（pH7.4 、0.15Mol/L PBS 含0.2% Tween 20），胎牛血清，熒光細胞洗液：pH7.4 、0.15Mol/L PBS含2%胎牛血清及0.1%NaN3 。FACS管，Tip頭，移液器。
儀器：低溫水平離心機, 37°C水浴箱，熒光顯微鏡，共聚焦激光掃描顯微鏡，流式細胞計
方法：
1 懸浮細胞的染色：
（1）收獲正常和誘導凋亡的細胞（0.5~1′106），PBS洗2次，1000rpm′10min。
（2）3%多聚甲醛冰浴10min，PBS洗2次，1000rpm′10min。
（3）加入PBS-T溶液，37°C孵育15min，PBS洗2次，1000rpm′10min。
（4）加入200ml胎牛血清，室溫反應30min。
（5）加入5ml FITC標記的TFAR19單抗（終濃度為1：40），4°C反應30min
（6）熒光細胞洗液洗2次，1000rpm′10min。
結果觀察：將細胞沉澱滴片，熒光顯微鏡及共聚焦激光顯微鏡下觀察TFAR19在細胞中的定位。同時用流式細胞計定量檢測TFAR19蛋白的平均熒光強度。[圖11]
2：貼壁細胞的原位染色
（1） 貼壁生長的對數期細胞鋪在24孔或6孔板中（內有潔凈蓋玻片），讓其爬片生長，待長到
50%~80%滿時，凋亡誘導劑處理細胞。
（2） 將不同時間點處理的細胞進行免疫熒光染色，染色步驟同上。
（3） 將染色的爬片細胞放於一張滴有少量甘油（5ml）的載玻片上，熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描顯微
鏡觀察TFAR19在細胞中的定位。
結果觀察：[圖12]
3：臨床病理切片的染色、檢測。
4：原代細胞的培養、檢測。
5：分析TFAR19蛋白在人體內各組織器官的分布及定位
（二）TFAR19蛋白的表達與臨床疾病
1． ELISA法檢測正常人和疾病狀態下，以及疾病的不同時期，血清中TFAR19蛋白水平及其TFAR19自身抗體水平。
材料和試劑：
1. 包被Buffer: pH9.6, 0.05Mol/L碳酸鹽Buffer
2. 洗滌液： pH7.4, 0.15Mol/L PBS 含0.05% Tween 20
3. 封閉液： 3%BSA（用洗滌液配製）
4. 酶標抗體的稀釋：用封閉液稀釋
5. OPD底物Buffer：Na2HPO4.12H2O 1.84g
檸檬酸 0.51g
DDW 100ml
6. 顯色液（現配現用）：底物Buffer 10ml
OPD 2mg
30% H2O2 2ml
7. 終止液 2Mol/L H2SO48. 重組人TFAR19, HRP標記的羊抗人IgG9. ELISA板, Tip, 移液器，ELISA
Reader（OD490nm），洗板機
操作步驟
1. 用包被Buffer稀釋的重組人TFAR19（1mg/ml）包被ELISA板, 100ml/well, 37°C孵育2h或4°C過夜（一般24h以上）。
2. 洗滌Buffer洗板三次，加入封閉液，200 ml/well ， 37°C孵育2h或4°C
過夜。
3. 洗滌Buffer洗板三次，加入不同稀釋度的病人血清（3個重復孔）100ml/well ，37°C孵育1h。設包被Buffer、洗滌Buffer 、封閉液為陰性對照。
4. 洗滌Buffer洗板三次，加入1：2500稀釋的HRP標記的抗人IgG, 100ml/well，37°C孵育1h。
5. 洗滌Buffer洗板三次，加入顯色液，100 ml/well，避光反應10~15min。
6. 加入H2SO4終止反應，50 ml/well。
7. ELISA Reader 讀取OD490 光密度值，分析和比較病人血清和正常血 清中TFAR19自身抗體的表達水平。
2． Western blot 分析原發性腫瘤細胞和正常細胞的TFAR19蛋白的表達水平。

來源（北京大學人類疾病研究中心）：
http://gene.bjmu.e.cn/news/apoptosis.htm

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細胞壞死的鑒定

細胞壞死是因病理而產生的被動死亡，如物理性或化學性的損害因子及缺氧與營養不良等均導致細胞壞死。壞死細胞的膜通透性增高，致使細胞腫脹，細胞器變形或腫大，早期核無明顯形態學變化，最後細胞破裂。另外壞死的細胞裂解要釋放出內含物，並常引起炎症反應；在癒合過程中常伴隨組織器官的纖維化，形成瘢痕。

⑺ 如何用流式檢測細胞凋亡

前言

細胞凋亡通常稱為細胞程序性死亡，是由基因控制的主動性細胞死亡過程。越來越多數據發現，細胞凋亡與多種疾病密切相關，如癌細胞具有連續增殖、抵抗細胞凋亡能力，利用流式細胞儀分析細胞凋亡可為腫瘤診斷，療效評價和預後預測提供了重要的參考指標。然而很多實驗的同學們，常會碰到上機檢測時細胞死亡太多卻檢測不出凋亡，多次重復結果不一致等現象，本文就一起看看如何把細胞凋亡的數據變的更加漂亮，准確！

首先，明確一下細胞凋亡和壞死的區別

細胞凋亡(apoptosis) 是一件主動性細胞死亡事件，它涉及一系列基因的激活、表達以及調控，是細胞為更好地適應環境而主動爭取的一種死亡過程。 具體表現為： 出芽形成凋亡小體、核小體間DNA的切割，凋亡小體被吞噬和消化等幾個連續過程等[1]（如下圖所示）。

圖1：細胞凋亡的發生過程[1]

細胞壞死（necrosis） 則是一件被動的過程，是細胞受到強烈理化或生物因素作用引起細胞無序變化的死亡過程，即病理條件下，自體損傷的一種現象。 具體表現為： 細胞脹大，胞膜破裂，細胞內容物外溢，核變化較慢，DNA降解不充分，會引起局部嚴重的炎症反應（如下圖所示）。

圖2：細胞壞死的發生過程[1]

一、流式檢測細胞凋亡的原理

Annexin V和PI雙染法是流式檢測細胞凋亡的經典方法 ，它是基於凋亡的早期細胞膜上的磷脂醯絲氨酸（phosphotidylserine, PS）從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面這一原理來實現的（如下圖3）。

圖3：凋亡早期 PS從細胞膜的內側外翻

該方法簡便、快速、准確區分活細胞、凋亡細胞和壞死細胞，具體原理如下：

因此，將Annexin V與PI聯合使用時，便可用來鑒別活細胞，凋亡細胞及死亡細胞。

二、實驗操作步驟

三、數據分析

Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒是用FITC標記的Annexin V作為探針，FITC最大激發波長為488 nm，最大發射波長525 nm，FITC的綠色熒光在FL1通道檢測；PI-DNA復合物的最大激發波長為535 nm，最大發射波長為615 nm，PI的紅色熒光在FL2或FL3通道檢測。通過軟體分析，繪制雙色散點圖，FITC為橫坐標，PI為縱坐標。

如下圖所示：細胞可以分為4個象限：

圖4：4個象限的細胞分布圖

舉例：如常用於研究葯物或者基因等對細胞凋亡的影響。 通過比較Control組和葯物組，發現化合物可以誘導前列腺癌細胞系PC-3M的細胞凋亡，處理組（20μM）的晚期凋亡細胞比例與Control組（0μM）相比，從1.79%上升到11.39%。進而還可根據每個象限的數據計算出活細胞、凋亡細胞和壞死細胞百分率。

圖5. 葯物濃度梯度依賴性的誘導PC-3M細胞凋亡[2]

四、常見問題解答

1. 如何避免出現假陽性結果？

2. 為什麼必須收集細胞上清？

因為凋亡的細胞可能會脫壁，懸浮於培養基，所以必須收集上清再離心取沉澱，合並胰酶消化下來的細胞，不然檢測出來的凋亡比例可能會減少。

3. 為什麼在染色後1h內就要上機檢測？

由於細胞凋亡是一個快速的過程，建議樣品在染色後1小時之內進行分析；PI受時間的影響很大，因標記了PI後會加大細胞毒性，特別是檢測早期凋亡時，如果時間延長除了會導致在流式細胞儀上的細胞分群差距加大外，誤差會明顯加大，所以建議在一個小時內檢測。

4. 其他注意事項

參考文獻：

[1]Elmore S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicol Pathol 2007;35:495-516.

[2]Qin M, Peng S, Liu N, et al. LG308, a Novel Synthetic Compound with Antimicrotubule Activity in Prostate Cancer Cells, Exerts Effective Antitumor Activity.[J]. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 2015,355(3): 473-483.

⑻ 細胞凋亡的形態學檢測方法有哪些

形態學觀察方法:
1、HE染色、光鏡觀察：凋亡細胞呈圓形,胞核深染,胞質濃縮,染色質成團塊狀,細胞表面有「出芽」現象.
2、丫啶橙（AO）染色,熒光顯微鏡觀察：活細胞核呈黃綠色熒光,胞質呈紅色熒光.凋亡細胞核染色質呈黃綠色濃聚在核膜內側,可見細胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體.
3、台盼藍染色：如果細胞膜不完整、破裂,台盼藍染料進入細胞,細胞變藍,即為壞死.如果細胞膜完整,細胞不為台盼藍染色,則為正常細胞或凋亡細胞.此方法對反映細胞膜的完整性,區別壞死細胞有一定的幫助.
4、透射電鏡觀察：可見凋亡細胞表面微絨毛消失,核染色質固縮、邊集,常呈新月形,核膜皺褶,胞質緊實,細胞器集中,胞膜起泡或出「芽」及凋亡小體和凋亡小體被臨近巨噬細胞吞噬現象。

⑼ 最常用的細胞凋亡檢測方法是什麼

細胞死亡的方式主要有兩種，包括 細胞壞死（necrosis）和細胞凋亡（apoptosis） 。細胞壞死是早已被認識到的細胞死亡方式，而細胞凋亡是近年來逐漸被認識且越來越受到重視的細胞死亡方式。兩種死亡方式最重要的區別是細胞壞死會釋放出細胞內溶物， 引起炎性反應 ，而細胞凋亡不會暴露細胞內溶物，一般被吞噬細胞吞噬清除， 不引起炎性反應 。

細胞凋亡，也稱 細胞程序性死亡，是指在一定的生理或者病理條件下，細胞主動的、高度有序的、自己結束其生命的過程 。細胞凋亡是生物體中一種普遍存在的現象，胚胎形成、個體發育、衰老和損傷細胞的清除等都與細胞凋亡密切相關。細胞凋亡在免疫學中也非常重要，如T細胞在胸腺內發育的過程，經過陰性選擇和陽性選擇後，95%的胸腺細胞發生凋亡，只有5%的胸腺細胞發育為成熟T細胞進入外周。

檢測細胞凋亡的方法很多，如電子顯微鏡或者光學顯微鏡下的形態學觀察、細胞DNA提取物的DNA梯狀帶電泳實驗等。而流式細胞術是非常重要的檢測細胞凋亡的方法，不僅可以定性，也可以定量。流式細胞術檢測細胞凋亡的方法也有很多，其中最重要是annexinV/PI雙染色法。其他的還有SYTO/PI雙染色法、細胞DNA含量分析法、線粒體損傷檢測法、活化的caspase-3檢測法、FLICA標記法、甲醯胺誘導ssDNA單抗檢測法、TUNEL法等。今天主要介紹一下annexinV/PI雙染色法。

Annexin V/PI雙染色法

正常細胞膜的磷脂分布是不對稱的，活細胞中 磷脂醯絲氨酸(phosphatidylserine,PS） 位於 細胞膜的內表面 ，細胞凋亡時，細胞膜發生變化， PS從細胞膜的內表面翻轉到細胞膜的外表 面。 annexinV是一種對PS有高度親和力的、鈣依賴性的磷脂結合蛋白 ，annexinV可以特異性地識別凋亡細胞表面的PS，而 活細胞的PS位於細胞膜的內表面 ，無法與annexinV特異性結合。所以可以用FITC偶聯的annexinV鑒別凋亡細胞和活細胞。

壞死細胞的PS也會從細胞膜的內表面翻轉到細胞膜的外表面，annexinV也能識別壞死細胞表面的PS，所以 annexinV無法區分壞死細胞和凋亡細胞 。而 PI染料能夠與細胞內的DNA結合 ， 區分壞死細胞和活細胞 。凋亡細胞和活細胞的細胞膜仍然完整，PI染料無法自由通過細胞膜進入細胞內與DNA結合，所以 PI染料無法標記凋亡細胞和活細胞 ，而PI染料卻能夠通過壞死細胞的細胞膜與細胞內的DNA結合，壞死細胞內PI染料被488nm激光激發後會發射紅熒光，被FL2或FL3通道接收。所以 annexinV和PI同時使用，就可以區分活細胞、凋亡細胞和壞死細胞 ，這就是annexinV/PI雙染色法檢測細胞凋亡的原理。

標記方法與常規標記熒光抗體的方能一樣：加入適量的FITC­annexinV和PI，4℃靜置30min即可。注意 標記PI的方法與PI染色檢測細胞內DNA含量的方法不同，不需提前固定細胞 ，因為本方法標記PI是為了檢測細胞膜的通透性從而鑒別細胞是活細胞還是死細胞，而用PI檢測DNA含量時必須先破壞活細胞的細胞膜的完整性使PI進入細胞內與DNA結合。

下圖是用annexinV/PI雙染色法檢測細胞凋亡得到的一張散點圖。圖中大致可以分為三大細胞群：右上象限的細胞表型為annexinV+PI+，代表的是壞死細胞；右下象限的細胞表型為annexinV＋PI-，代表的是凋亡細胞；左下象限的細胞表型為annexinV-PI-，代表的是活細胞。通過annexin V/PI雙染色法可以非常明確地區分活細胞、凋亡細胞和壞死細胞，並且可以定量分析各自所佔的比例。

例：

下圖引自［1］，作者用annexinV/PI雙染色法檢測肺癌細胞系「H1299」和「A549」細胞凋亡，證明肺癌細胞表面的TLR4受體與LPS結合後，能夠增強其抵抗TNFα和TRAIL誘導的凋亡。

從圖中可以看出，TRAIL誘導後，H1299肺癌細胞系的凋亡比例從3.36%上升到13.7%，被TNF-α/CHX誘導後，凋亡比例上升到16.9%；如果在誘導前加入LPS，活化H1299表面TLR4信號，被TRAIL誘導後凋亡比例只有3.8%，被TNF-α/CHX誘導後凋亡比例只有3.93%,說明H1299表面TLR4信號的活化能夠促進其抵抗凋亡。另一個肺癌細胞系A549的結果也相似，LPS活化TLR4信號後，TRAIL誘導凋亡比例從16%下降到3.09%，而TNF-α/CHX誘導凋亡比例從17%下降到11.8%。

［1］Weigang He, Qiuyan Liu, Li Wang, et al. 2007. TLR4 signaling promotes immune escape ofhuman lung cancer cells by incing immunosuppressive cytokines and apoptosis resistance.Molecular Immunology, 44:2850-2859.