非瘟pcr檢測三個片段的方法

㈠ 非洲豬瘟檢測方法是什麼

1、紅細胞吸附試驗：將健康豬的白細胞加上非洲豬瘟豬的血液或組織提取物，37℃培養，如見許多紅細胞吸附在白細胞上，形成玫瑰花狀或桑椹體狀，則為陽性。

2、直接免疫熒光試驗：熒光顯微鏡下觀察，如見細胞漿內有明亮熒光團，則為陽性。

3、動物接種試驗。

4、間接免疫熒光試驗：將非洲豬瘟病毒接種在長滿Vero細胞的蓋玻片上，並准備未接種病毒的Vero細胞對照。試驗後，對照正常，待檢樣品在細胞漿內出現明亮的熒光團核熒光細點可被判定為陽性。

5、酶聯免疫吸附試驗：對照成立時（陽性血清對照吸收值大於0.3，陰性血清吸收值小於0.1），待檢樣品的吸收值大於0.3時，判定為陽性。

6、免疫電泳試驗：抗原於待檢血清間出現白色沉澱線者可判定為陽性。

7、間接酶聯免疫蝕斑試驗：肉眼觀察，或顯微鏡下觀察，蝕斑呈棕色則為陽性，無色則為陰性。

(1)非瘟pcr檢測三個片段的方法擴展閱讀

非洲豬瘟急性病例臨床症狀以高熱、病程短、死亡率高、內臟器官廣泛性出血以及呼吸系統和神經系統功能紊亂為主要特徵。

在無本病的國家和地區應防止ASFV的傳入，在國際機場和港口，從飛機和船舶來的食物廢料均應焚毀。對無本病地區事先建立快速診斷方法和制定一旦發生本病時的撲滅計劃。

㈡ pcr的特異性檢測和敏感性檢測要怎麼做

1. pcr靈敏度檢測

   1.1 樣本准備：以4次方國家一級或者二級標准品為基礎樣本，用陰性血清進行倍比稀釋，稀釋後的樣本濃度分別為1000IU/ml、500IU/ml、250IU/ml、125IU/ml、100IU/ml、50IU/ml、25IU/ml，每份樣本使用1000μl進行檢測。

   1.2 用質檢合格核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)進行檢測，每個濃度每批次試劑盒做5個復管，分析各濃度標本的檢出率（即陽性率）。以標本濃度值對數為橫坐標，對應的檢出率為縱坐標描點，用Origin的Sigmoidal Fit 的方法擬合成曲線，根據軟體給出的曲線公式計算出當檢出率為95%時所對應的濃度，此濃度即為本試劑盒對HBV標本的分析靈敏度。

2. pcr特異性檢測

   2.1 參考樣本選擇：選擇與目的片段相近或者感染方式相似的其他病毒或者細菌高載量樣本，同時應滿足臨床或者其他方法確認目的片段為陰性，做5個副管擴增並且全部為陰性。以乙肝為例：選擇高載量HCV、CMV、EBV、HSV2的陽性標本各1個（乙肝表面抗原為陰性）,分別檢測乙肝表面抗原及乙肝核酸量。每個測5次，全部陰性或者在參考范圍以下為特異性良好。

   希望能夠幫到你，有其他需要可以隨時交流！

㈢ PCR產物的檢測方法有哪些都有什麼原理

1.瓊脂糖凝膠電泳 同時點分子量marker，根據marker條帶判斷產物分子量大小，從而大致判斷是不是你要的
2.酶切 已知你產物的序列，看上面有什麼酶切位點，用一個酶或者兩個酶切斷，看與理論預測的條帶數目和大小是否一致。一般檢測有以上兩步就行了，如果需要知道確切的需要進行3
3.測序 連接到pMD-18t 載體上，轉到大腸桿菌中。拿到公司去測序，測序結果通過gene bank比對看與哪個基因一致，這種方法最准確
4.表達 pcr產物連到真核或者原核表達載體上，適宜條件表達出來以後的蛋白做質譜分析，看與理論產物表達的蛋白是否有一致的片段

㈣ DG55155Tl設置方法

團體標准T/CVMA 5—2018
非洲豬瘟病毒實時熒光PCR檢測方法
Real-time PCR assay for detection ofAfrican swine fever virus
中國獸醫協會發布
前言
本標准按 GB/T 1.1-2009給出的規則起草。
本標准由中國獸醫協會提出並歸口。
本標准起草單位： 中國動物疫病預防控制中心、中國獸醫葯品監察所、中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所、中國農業科學院蘭州獸醫研究所、北京海關。
本標准主要起草人： 倪建強、王傳彬、王琴、仇華吉、殷宏、楊林、辛盛鵬、劉艷華、劉洋、宋曉暉、趙啟祖、羅玉子、劉志傑、張乾義、喬彩霞、夏應菊、楊吉飛、徐璐、顧小雪、亢文華、李碩、畢一鳴。
1、范圍
本標准規定了非洲豬瘟病毒實時熒光PCR檢測方法的試劑、儀器和耗材、操作步驟、結果判定、實驗室生物安全等技術要求。
本標准適用於豬脾臟、淋巴結、血液等組織和血粉中非洲豬瘟病毒核酸的檢測。
2、規范性引用文件
下列文件對於本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用於本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用於本文件。
GB 19489 實驗室 生物安全通用要求
NY/T 541 獸醫診斷樣品採集、保存與運輸技術規范
3、試劑
3.1 DNA提取試劑
DNA提取試劑的配製見附錄A，或選取商品化的病毒DNA提取試劑盒並參照說明書進行DNA提取。
3.2 2 × PCR緩沖液
2 × PCR緩沖液的配製見附錄A。
3.3 引物探針
3.3.1 採用針對非洲豬瘟病毒VP72基因（核苷酸序列見附錄B）的引物及探針：
上游引物ASF-CADC-rPCRF：5'-1528-ATAGAGATACAGCTCTTCCAG-1548-3'
下游引物ASF-CADC-rPCRR：5'-1660-GTATGTAAGAGCTGCAGAAC-1679-3'
熒光探針ASF-CADC-Probe：5'-1638-FAM-TATCGATAAGATTGAT-MGB--3'
3.3.2 可以使用世界動物衛生組織（OIE）在陸生動物診斷技術和疫苗手冊（Manual of Diagnostic Tests andVaccines for Terrestrial Animals）第2.8.1章African Swine Fever中提供的引物和探針，並按照手冊中規定的檢測程序和判定標准操作：
上游引物ASF-OIE-rPCRF：5'-1627-CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA-1651-3'
下游引物ASF-OIE-rPCRR：
5'-1857-GATACCACAAGATCRGCCGT-1876-3'
熒光探針ASF-OIE-Probe：
5'-1761-FAM-CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG-TAMRA-1785-3'
3.3.3 使用國家農業行政主管部門批準的其他引物、探針，應對檢測程序和判定標准作相應調整。
3.4 陰性及陽性對照
陰性及陽性對照的制備方法見附錄C。
3.5 其他試劑
消毒液、5U/μLTaq DNA聚合酶、無菌無核酸酶水、0.01mol/L PBS（pH7.2）。
消毒液配製見附錄A， 0.01mol/L PBS配製見附錄A。
4、儀器和耗材
分析天平（感量0.1mg）、高速台式冷凍離心機（最高離心速度不低於12 000r/min）、冰盒、實時熒光PCR儀及配套反應管（板）、組織研磨器、-20℃冰箱、可調移液器（2 μL，20 μL，200μL，1 000 μL）、1.5mL離心管（無核酸酶）。
5、操作步驟
5.1 樣品採集及運輸
樣品採集及運輸按照NY/T541的規定執行，採集豬的脾臟、淋巴結、血液等組織材料或血粉用於檢測，樣品應在冷藏條件下盡快運輸至實驗室，避免反復凍融。采樣時應穿戴個人生物安全防護裝備，實施現場消毒和廢棄物處理。
5.2 樣品處理
檢測前樣品應在二級生物安全櫃中處理。取0.1g～0.2g組織或血粉，經研磨破碎後加1mL的0.01mol/L PBS（pH7.2）製成勻漿，經12 000 r/min離心2Min取上清；全血、血清樣品直接取1mL，置於1.5 mL離心管內蓋緊管帽。將上述處理的樣品置於60℃條件下滅活30min。
5.3 樣品保存
採集或處理好的樣品在2℃～8℃條件下保存應不超過24 h；如需長期保存，應放置-70℃冰箱，但應避免反復凍融（凍融不超過3次）。
5.4 病毒DNA提取
5.4.1 DNA提取應在樣本制備區內採用以下方法進行，若使用其他等效的病毒DNA提取試劑，則按照試劑說明書操作。
5.4.2 待檢樣品、陽性對照和陰性對照的份數總和用n表示，取n個滅菌1.5 mL離心管，逐管編號。
5.4.3 每管加入200μL DNA提取液1，然後分別加入待測樣品、陰性對照和陽性對照各200μL，1份樣品換用1個吸頭，混勻器上震盪混勻5s。於4℃～25℃條件下，13 000 r/min離心10 min。DNA提取液1見附錄A。
5.4.4 盡可能吸取上清、棄去，吸頭不要碰到沉澱，再加入10 μL DNA提取液2，混勻器上震盪混勻5 s。於4℃～25℃條件下，2 000 r/min離心10s。DNA提取液2見附錄A。
5.4.5 100℃干浴或沸水浴10 min。
5.4.6 加入90μL無DNA酶的滅菌去離子水，13 000 r/min離心10 min，上清即為提取的DNA，-20℃保存備用。無DNA酶的滅菌去離子水見附錄A。
5.5 實時熒光PCR操作
5.5.1 在反應混合物配製區、樣品制備區和檢測區分別進行5.5.2～5.5.4。
5.5.2 每個檢測反應體系需使用20μL實時熒光PCR反應液。根據5.4.2中設定的n值，按附錄D配製反應液，充分混勻後分裝，每個PCR反應管20μL。轉移PCR反應管至 樣品制備區 。
5.5.3 在上述5.5.2的反應管中分別加入5.4中提取的DNA溶液5μL，使每管總體積達到25 μL，記錄反應管對應的樣品編號。蓋緊管蓋後，瞬時離心。
5.5.4 將5.5.3加樣後的反應管放入實時熒光PCR檢測儀內，記錄反應管擺放順序。選定5-羧基熒光素（FAM）作為報告基團，小溝結合物（MGB）為淬滅基團，反應參數設置如下： 預變性95℃/3 min；95℃/15 s，52℃/10 s，60℃/35 s，45個循環； 在每次循環的60℃退火延伸時收集熒光。試驗結束後，根據收集的Ct值和熒光曲線判定結果。
6、結果判定
6.1 結果分析條件設定
實時熒光PCR檢測閾值設定原則：閾值線超過陰性對照擴增曲線的最高點，且相交於陽性對照擴增曲線進入指數增長期的拐點，或根據儀器雜訊情況進行調整。每個樣品反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數即為Ct值。
6.2 結果描述及判定
當陽性對照Ct值≤28.0且出現典型擴增曲線，陰性對照無Ct值無擴增曲線時，實驗成立，實例參考附錄E。 當被檢樣品出現典型的擴增曲線且Ct值≤38.0時，判為非洲豬瘟病毒核酸陽性 ； 被檢樣品無Ct值，判為非洲豬瘟病毒核酸陰性；對於Ct值＞38.0的樣品且出現典型的擴增曲線，應重檢，重檢仍出現上述結果的判為陽性，否則判為陰性。
7、實驗室生物安全要求
7.1 本方法涉及非洲豬瘟感染性樣品的實驗操作應在（動物）生物安全三級試驗室中進行，實驗室生物安全管理要求見GB 19489。國家農業行政主管部門另有規定的，按其規定執行。
7.2 使用過的實驗器材和液體廢棄物應先經過消毒液浸泡處理，再經高溫高壓處理後廢棄。剩餘樣品等固體廢棄物應在生物安全櫃中密封包裝，經表面消毒後移出，再經高溫高壓處理後廢棄。
一
附錄 A (規范性附錄) 試劑的配製
A.1 DNA提取液1
PEG8000晶體20.74g，NaCL17.53g，加去離子水定容到100 mL。
A.2 DNA提取液2
1mol/LTris.Hcl 2 mL，2 mol/L KCL5 mL，0.5 mol/L EDTA 0.5 mL，NP-40 1 mL，加去離子水定容到100 mL。
即KCL14.912g，Tris鹼12.114g，1.2068 mL濃HCl，EDTA14.612g，NaOH 6g, 加去離子水定容到100 mL。
A.3 2×PCR緩沖液
滅菌去離子水 70 mL
三羥甲基氨基甲烷（Tri s） 0.79 g
氯化鉀 1.865 g
曲拉通X-100 0.5 mL
dATP (100mmol/L) 2.5 mL
dTTP (100mmol/L) 2.5 mL
dGTP (100mmol/L) 2.5 mL
dCTP (100mmol/L) 2.5 mL
六水氯化鎂 0.61 g
鹽酸 調pH至9.0
滅菌去離子水 加至100 mL
A.4 消毒液
8‰氫氧化鈉或3‰福爾馬林或3%鄰苯基苯酚或碘化合物等其他消毒試劑均可。
A.5 磷酸鹽緩沖液（PBS）的配方
A.5.1 A液
0.2mol/L磷酸二氫鈉水溶液：NaH2PO4·H2O 27.6 g，溶於蒸餾水中，最後定容至1 000 mL。
A.5.2 B液
0.2mol/L磷酸氫二鈉水溶液：Na2HPO4·7H2O 53.6 g（或Na2HPO4·12H2O 71.6 g或Na2HPO4·2H2O 35.6 g），加蒸餾水溶解，最後定容至1 000 mL。
A.5.3 0.01 mol/L、pH 7.2 磷酸鹽緩沖液（PBS）的配製
取A液14 mL、B液36 mL，加NaCl 8.5 g，用蒸餾水定容至1 000 mL。經過濾除菌後，無菌條件下分裝。
A.6 無DNA酶的滅菌去離子水
無DNA酶的滅菌去離子水是用1 %DEPC處理後的去離子水，電阻應該大於18.2mΩ。
二
附錄B （資料性附錄）非洲豬瘟病毒VP72基因參考序列
1ATGGCATCAG GAGGAGCTTT TTGTCTTATT GCTAACGATG GGAAGGCCGA CAAGATTATA
61TTGGCCCAAG ACTTGCTGAA TAGCAGGATC TCTAACATTA AAAATGTGAA CAAAAGTTAT
121GGGAAACCCG ATCCCGAACC CACTTTGAGT CAAATCGAAG AAACACATTT GGTGCATTTT
181AATGCGCATT TTAAGCCTTA TGTTCCAGTA GGGTTTGAAT ACAATAAAGT ACGCCCGCAT
241ACGGGTACCC CCACCTTGGG AAACAAGCTT ACCTTTGGTA TTCCCCAGTA CGGAGACTTT
301TTCCATGATA TGGTGGGCCA TCATATATTG GGTGCATGTC ATTCATCCTG GCAGGATGCT
361CCGATTCAGG GCACGTCCCA GATGGGGGCC CATGGGCAGC TTCAAACGTT TCCTCGCAAC
421GGATATGACT GGGACAACCA AACACCCTTA GAGGGCGCCG TTTACACGCT TGTAGATCCT
481TTTGGAAGAC CCATTGTACC CGGCACAAAG AATGCGTACC GAAACTTGGT TTACTACTGC
541GAATACCCCG GAGAACGACT TTATGAAAAC GTAAGATTCG ATGTAAATGG AAATTCCCTA
601GACGAATATA GTTCGGATGT CACAACGCTT GTGCGCAAAT TTTGCATCCC AGGGGATAAA
661ATGACTGGAT ATAAGCACTT GGTTGGCCAG GAGGTATCGG TGGAGGGAAC CAGTGGCCCT
721CTCCTATGCA ACATTCATGA TTTGCACAAG CCGCACCAAA GCAAACCTAT TCTTACCGAT
781GAAAATGATA CGCAGCGAAC GTGTAGCCAT ACCAACCCGA AATTTCTTTC ACAGCATTTT
841CCCGAGAACT CTCACAATAT CCAAACAGCA GGTAAACAAG ATATTACTCC TATCACGGAC
901GCAACGTATC TGGACATAAG ACGTAATGTT CATTACAGCT GTAATGGACC TCAAACCCCT
961AAATACTATC AGCCCCCTCT TGCGCTCTGG ATTAAGTTGC GCTTTTGGTT TAATGAGAAC
1021GTGAACCTTG CTATTCCCTC AGTATCCATT CCCTTCGGCG AGCGCTTTAT CACCATAAAG
1081CTTGCATCGC AAAAGGATTT GGTGAATGAA TTTCCTGGAC TTTTTGTACG CCAGTCACGT
1141TTTATAGCTG GACGCCCCAG TAGACGCAAT ATACGCTTTA AACCATGGTT TATCCCAGGA
1201GTCATTAATG AAATCTCGCT CACGAATAAT GAACTTTACA TCAATAACCT GTTTGTAACC
1261CCTGAAATAC ACAACCTTTT TGTAAAACGC GTTCGCTTTT CGCTGATACG TGTCCATAAA
1321ACGCAGGTGA CCCACACCAA CAATAACCAC CACGATGAAA AACTAATGTC TGCTCTTAAA
1381TGGCCCATTG AATATATGTT TATAGGATTA AAACCTACCT GGAACATCTC CGATCAAAAT
1441CCTCATCAAC ACCGAGATTG GCACAAGTTC GGACATGTTG TTAACGCCAT TATGCAGCCC
1501ACTCACCACG CAGAGATAAG CTTTCAGGAT AGAGATACAG CTCTTCCAGA CGCATGTTCA
1561TCTATATCTG ATATTAGCCC CGTTACGTAT CCGATCACAT TACCTATTAT TAAAAACATT
1621TCCGTAACTG CTCATGGTAT CAATCTTATC GATAAATTTC CATCAAAGTT CTGCAGCTCT
1681TACATACCCT TCCACTACGG AGGCAATGCG ATTAAAACCC CCGATGATCC GGGTGCGATG
1741ATGATTACCT TTGCTTTGAA GCCACGGGAG GAATACCAAC CCAGTGGTCA TATTAACGTA
1801TCCAGAGCAA GAGAATTTTA TATTAGTTGG GACACGGATT ACGTGGGGTC TATCACTACG
1861GCTGATCTTG TGGTATCGGC ATCTGCT
三
附錄C （規范性附錄）非洲豬瘟病毒核酸陽性及陰性對照
C.1陽性對照
陽性對照制備方法：人工合成非洲豬瘟病毒VP72基因片段，序列參見附錄B，將VP72基因連接於pMD20-T載體製成陽性質粒pMD20-T-VP72，使用非洲豬瘟病毒陰性豬的組織研磨液將質粒稀釋至濃度為10 000copies/L，保存於-20℃備用。
C.2 陰性對照
陰性對照為非洲豬瘟病毒陰性豬的組織研磨液。
四
附錄D （規范性附錄）實時熒光PCR反應液配方
實時熒光PCR反應液配方見表D.1。
表D.1 實時熒光PCR反應液配方
組 分
1個檢測體系的加入量
2×PCR 緩沖液a
12.5μL
dNTP（2.5 mmol/L）
1.0 μL
上游引物（10 μmol/L）
1.0 μL
下游引物（10 μmol/L）
1.0μL
探針（10 μmol/L）
1.0 μL
Taq 酶b（5U/μL）
0.5μL
去離子水
3μL
總體積
20μL
2×PCR 緩沖液a: 參見附錄A.1配方。
Taq 酶b：具有5』→3』外切活性。
五
附錄 E （資料性附錄）非洲豬瘟病毒實時熒光PCR擴增實例參考
圖D.1給出了非洲豬瘟病毒實時熒光PCR擴增實例。
圖E.1 非洲豬瘟病毒核酸實時熒光PCR典型擴增曲線示意圖
(資料來源：中國獸醫協會）

㈤ 各位高手誰能給我詳細的講解一下PCR技術的過程

聚合酶鏈式反應（英文全稱：Polymerase Chain Reaction）,聚合酶鏈式反應
簡稱PCR.聚合酶鏈式反應（PCR）是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法,由高溫變性、低溫退火（復性）及適溫延伸等幾步反應組成一個周期,循環進行,使目的DNA得以迅速擴增,具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時等特點.它不僅可用於基因分離、克隆和核酸序列分析等基礎研究,還可用於疾病的診斷或任何有DNA,RNA的地方．聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction,簡稱PCR）又稱無細胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴增技術.
編輯本段發展簡史
人類對於核酸的研究已經有100多年的歷史.20世紀60年代末70年代初,人們致力於研究基因的體外分離技術.但是,由於核酸的含量較少,一定程度上限制了DNA的體外操作.Khorana於1971年最早提出核酸體外擴增的設想.但是,當時的基因序列分析方法尚未成熟,對熱具有較強穩定性的DNA聚合酶還未發現,寡核苷酸引物的合成仍處在手工、半自動合成階段,這種想法似乎沒有任何實際意義. 1985年,美國科學家Kary Mullis在高速公路的啟發下,經過兩年的努力,發明了PCR技術,並在Science雜志上發表了關於PCR技術的第一篇學術論文.從此,PCR技術得到了生命科學界的普遍認同,Kary Mullis也因此而獲得1993年的諾貝爾化學獎. 但是,最初的PCR技術相當不成熟,在當時是一種操作復雜、成本高昂、「中看不中用」的實驗室技術.1988年初,Keohanog通過對所使用的酶的改進,提高了擴增的真實性.而後,Saiki等人又在黃石公園從生活在溫泉中的水生嗜熱桿菌內提取到一種耐熱的DNA聚合酶,使得PCR技術的擴增效率大大提高.也正是由於此酶的發現使得PCR技術得到了廣泛地應用,使該技術成為遺傳與分子生物學 分析的根本性基石.在以後的幾十年裡,PCR方法被不斷改進：它從一種定性的分析方法發展到定量測定；從原先只能擴增幾個kb的基因到目前已能擴增長達幾十個kb的DNA片段.到目前為止,PCR技術已有十幾種之多,例如,將PCR與反轉錄酶結合,成為反轉錄PCR,將PCR與抗體等相結合就成為免疫PCR等.
編輯本段技術原理
DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑.雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈,在DNA聚合酶與啟動子的參與下,根據鹼基互補配對原則復製成同樣的兩分子挎貝.在聚合酶鏈式反應
實驗中發現,DNA在高溫時也可以發生變性解鏈,當溫度降低後又可以復性成為雙鏈.因此,通過溫度變化控制DNA的變性和復性,並設計引物做啟動子,加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制. 但是,DNA聚合酶在高溫時會失活,因此,每次循環都得加入新的DNA聚合酶,不僅操作煩瑣,而且價格昂貴,制約了PCR技術的應用和發展.發現耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對於PCR的應用有里程碑的意義,該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活,不需要每個循環加酶,使PCR技術變得非常簡捷、同時也大大降低了成本,PCR技術得以大量應用,並逐步應用於臨床.
編輯本段工作原理
類似於DNA的天然復制過程,其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物.PCR由變性--退火（復性）--延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至94℃左右一定時聚合酶鏈式反應
間後,使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結合,為下輪反應作準備；②模板DNA與引物的退火（復性）：模板DNA經加熱變性成單鏈後,溫度降至40~60℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在DNA聚合酶的作用下,於72℃左右,以dNTP為反應原料,靶序列為模板,按鹼基配對與半保留復制原理,合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈重復循環變性--退火--延伸三過程,就可獲得更多的「半保留復制鏈」,而且這種新鏈又可成為下次循環的模板.每完成一個循環需2～4分鍾,2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍.
編輯本段反應特點
特異性強 PCR反應的特異性決定因素為： ①引物與模板DNA特異正確的結合； ②鹼基配對原則； ③Taq DNA聚合酶合成反應的忠實性； ④靶基因的特異性與保守性. 其中引物與模板的正確結合是關鍵.引物與模板的結合及引物鏈的延伸是遵循鹼基配對原則的.聚合酶合成反應的忠實性及Taq DNA聚合酶耐高溫性,使反應中模板與引物的結合（復性）可以在較高的溫度下進行,結合的特異性大大增加,被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度.再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區,其特異性程度就更高. 靈敏度高 PCR產物的生成量是以指數方式增加的,能將皮克(pg=10-12）量級的起始待測模板擴增到微克（μg=10-6）水平.能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中,PCR的靈敏度可達3個RFU（空斑形成單位）；在細菌學中最小檢出率為3個細菌. 簡便、快速 PCR反應用耐高溫的Taq DNA聚合酶,一次性地將反應液加好後,即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應,一般在2～4 小時完成擴增反應.擴增產物一般用電泳分析,不一定要用同位素,無放射性污染、易推廣. 對標本的純度要求低 不需要分離病毒或細菌及培養細胞,DNA 粗製品及RNA均可作為擴增模板.可直接用臨床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發、細胞、活組織等DNA擴增檢測.
編輯本段反應五要素
參加PCR反應的物質主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 引物：引物是PCR特異性反應的關鍵,PCR 產物的特異性取決於引物與模板DNA互補的程度.理論上,只要知道任何一段模板DNA序列, 就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增. 設計引物應遵循以下原則： ①引物長度：15-30bp,常用為20bp左右. ②引物擴增跨度：以200-500bp為宜,特定條件下可擴增長至10kb的片段. ③引物鹼基：G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴增效果不佳,G+C過多易出現非特異條帶.ATGC最好隨機分布,避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列. ④避免引物內部出現二級結構,避免兩條引物間互補,特別是3'端的互補,否則會形成引物二聚體,產生非特異的擴增條帶. ⑤引物3'端的鹼基,特別是最末及倒數第二個鹼基,應嚴格要求配對,以避免因末端鹼基不配對而導致PCR失敗. ⑥引物中有或能加上合適的酶切位點, 被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點, 這對酶切分析或分子克隆很有好處. ⑦引物的特異性：引物應與核酸序列資料庫的其它序列無明顯同源性.引物量：每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol,以最低引物量產生所需要的結果為好,引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增,且可增加引物之間形成二聚體的機會.
編輯本段反應體系與反應條件
標準的PCR反應體系： 10×擴增緩沖液10ul 4種dNTP混合物各200umol/L 引物各10～100pmol 模板DNA0.1～2ug TaqDNA聚合酶2.5u Mg2+1.5mmol/L 加雙或三蒸水至100ul PCR反應五要素：參加PCR反應的物質主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和緩沖液（其中需要Mg2+)
編輯本段PCR反應條件的選擇
PCR反應條件為溫度、時間和循環次數. 溫度與時間的設置：基於PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點.在標准反應中採用三溫度點法,雙鏈DNA在90～95℃變性,再迅速冷卻至40 ～60℃,引物退火並結合到靶序列上,然後快速升溫至70～75℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物鏈沿模板延伸.對於較短靶基因（長度為100～300bp時）可採用二溫度點法, 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一,一般採用94℃變性,65℃左右退火與延伸（此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性）. ①變性溫度與時間：變性溫度低,解鏈不完全是導致PCR失敗的最主要原因.一般情況下,93℃～94℃min足以使模板DNA變性,若低於93℃則需延長時間,但溫度不能過高,因為高溫環境對酶的活性有影響.此步若不能使靶基因模板或PCR產物完全變性,就會導致PCR失敗. ②退火（復性）溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素.變性後溫度快速冷卻至40℃～60℃,可使引物和模板發生結合.由於模板DNA 比引物復雜得多,引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高於模板互補鏈之間的碰撞.退火溫度與時間,取決於引物的長度、鹼基組成及其濃度,還有靶基序列的長度.對於20個核苷酸,G+C含量約50%的引物,55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想.引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度： Tm值（解鏈溫度）=4(G+C)+2(A+T) 復性溫度=Tm值-(5～10℃） 在Tm值允許范圍內, 選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合, 提高PCR反應的特異性.復性時間一般為30～60sec,足以使引物與模板之間完全結合. ③延伸溫度與時間：Taq DNA聚合酶的生物學活性： 70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子 70℃ 60核苷酸/S/酶分子 55℃ 24核苷酸/S/酶分子 高於90℃時, DNA合成幾乎不能進行. PCR反應的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間,常用溫度為72℃,過高的延伸溫度不利於引物和模板的結合.PCR延伸反應的時間,可根據待擴增片段的長度而定,一般1Kb以內的DNA片段,延伸時間1min是足夠 的.3～4kb的靶序列需3～4min；擴增10Kb需延伸至15min.延伸進間過長會導致非特異性擴增帶的出現.對低濃度模板的擴增,延伸時間要稍長些.
編輯本段酶及其濃度
目前有兩種Taq DNA聚合酶供應, 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶,另一種為大腸菌合成的基因工程酶.催化一典型的PCR反應約需酶量2.5U（指總反應體積為100ul時）,濃度過高可引起非特異性擴增,濃度過低則合成產物量減少. dNTP的質量與濃度dNTP的質量與濃度和PCR擴增效率有密切關系,dNTP粉呈顆粒狀,如保存不當易變性失去生物學活性.dNTP溶液呈酸性,使用時應配成高濃度後,以1M NaOH或1M Tris.HCL的緩沖液將其PH調節到7.0～7.5,小量分裝, -20℃冰凍保存.多次凍融會使dNTP降解.在PCR反應中,dNTP應為50～200umol/L,尤其是注意4種dNTP的濃度要相等（ 等摩爾配製）,如其中任何一種濃度不同於其它幾種時（偏高或偏低）,就會引起錯配.濃度過低又會降低PCR產物的產量.dNTP能與Mg2+結合,使游離的Mg2+濃度降低. 模板（靶基因）核酸模板核酸的量與純化程度,是PCR成敗與否的關鍵環節之一,傳統的DNA純化方法通常採用SDS和蛋白酶K來消化處理標本.SDS的主要功能是：溶解細胞膜上的脂類與蛋白質,因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜,並解離細胞中的核蛋白,SDS 還能與蛋白質結合而沉澱； 蛋白酶K能水解消化蛋白質,特別是與DNA結合的組蛋白,再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質和其它細胞組份,用乙醇或異丙醇沉澱核酸.提取的核酸即可作為模板用於PCR反應.一般臨床檢測標本,可採用快速簡便的方法溶解細胞,裂解病原體,消化除去染色體的蛋白質使靶基因游離,直接用於PCR擴增.RNA模板提取一般採用異硫氰酸胍或蛋白酶K法,要防止RNase降解RNA. Mg2+濃度Mg2+對PCR擴增的特異性和產量有顯著的影響,在一般的PCR反應中,各種dNTP濃度為200umol/L時,Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜.Mg2+濃度過高,反應特異性降低,出現非特異擴增,濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性,使反應產物減少.
編輯本段工作步驟
PCR反應的基本過程
標準的PCR過程分為三步（如圖所示）： 1.DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下, 氫鍵斷裂,形成單鏈DNA 2.退火（復性）（40℃-65℃）：系統溫度降低,引物與 DNA模板結合,形成局部雙鏈. 3.延伸（68℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活 性）的作用下,以dNTP為原料,從引物的5′端→3′ 端延 伸,合成與模板互補的DNA鏈. 每一循環經過變性、退火和延伸,DNA含量既增加一倍. 現在有些PCR因為擴增區很短,即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時間內復制完成,因此可以改為兩步法,即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行,以減少一次升降溫過程,提高了反應速度.
編輯本段循環參數
1、預變性（Initial denaturation）． 模板DNA完全變性對PCR能否成功至關重要,一般95℃加熱3-5分鍾. 2、引物退火（Primer annealing） 退火溫度一般需要憑實驗（經驗）決定. 退火溫度對PCR的特異性有較大影響. 3、引物延伸 引物延伸一般在72℃進行（Taq酶最適溫度）. 延伸時間隨擴增片段長短及所使用Taq酶的擴增效率而定. 4、循環中的變性步驟 循環中一般95℃,30秒足以使各種靶DNA序列完全變性： 變性時間過長損害酶活性,過短靶序列變性不徹底,易造成擴增失敗. 5、循環數 大多數PCR含25-35循環,過多易產生非特異擴增. 6、最後延伸 在最後一個循環後,反應在72℃維持5-15分鍾．使引物延伸完全,並使單鏈產物退火成雙鏈. PCR-PCR常見問題
編輯本段電泳檢測時間
一般為48h以內,有些最好於當日電泳檢測,大於48h後帶型不規則甚至消失. 假陰性,不出現擴增條帶 PCR反應的關鍵環節有①模板核酸的制備,②引物的質量與特異性,③酶的質量及, ④PCR循環條件.尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究. 模板：①模板中含有雜蛋白質,②模板中含有Taq酶抑制劑,③模板中蛋白質沒有消 化除凈,特別是染色體中的組蛋白,④在提取制備模板時丟失過多,或吸入酚.⑤模 板核酸變性不徹底.在酶和引物質量好時,不出現擴增帶,極有可能是標本的消化處 理,模板核酸提取過程出了毛病,因而要配製有效而穩定的消化處理液,其程序亦應 固定不宜隨意更改. 酶失活：需更換新酶,或新舊兩種酶同時使用,以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導致假陰性.需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠. 引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱,是PCR失敗或擴增條帶不 理想、容易彌散的常見原因.有些批號的引物合成質量有問題,兩條引物一條濃度 高,一條濃度低,造成低效率的不對稱擴增,對策為：①選定一個好的引物合成單 位.②引物的濃度不僅要看OD值,更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳,一定要有引物條帶出現,而且兩引物帶的亮度應大體一致,如一條引物有條帶,一條引物無條帶,此時做PCR有可能失敗,應和引物合成單位協商解決.如一條引物亮度高,一條亮度低,在稀釋引物時要平衡其濃度.③引物應高濃度小量分裝保存,防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分,導致引物變質降解失效.④引物設計不合理,如引物長度不夠,引物之間形成二聚體等. Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大,濃度過高可降低PCR擴增的特 異性,濃度過低則影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶. 反應體積的改變：通常進行PCR擴增採用的體積為20ul、30ul、50ul.或100ul,應用多 大體積進行PCR擴增,是根據科研和臨床檢測不同目的而設定,在做小體積如20ul 後,再做大體積時,一定要模索條件,否則容易失敗.
編輯本段物理原因
變性對PCR擴增來說相當重要,如變性溫度低,變性時間短,極有可能出現假陰性；退火溫度過低,可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率.有時還有必要用標準的溫度計,檢測一下擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度,這也是PCR失敗的原因之一. 靶序列變異：如靶序列發生突變或缺失,影響引物與模板特異性結合,或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列,其PCR擴增是不會成功的.假陽性出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致,有時其條帶更整齊,亮度更高.引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性,因而在進行PCR擴增時,擴增出的PCR產物為非目的性的序列.靶序列太短或引物太短,容易出現假陽性.需重新設計引物. 靶序列或擴增產物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染,導致假陽性.這種假陽性可用以下方法解決：操作時應小心輕柔,防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外.除酶及不能耐高溫的物質外,所有試劑或器材均應高壓消毒.所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用.必要時,在加標本前,反應管和試劑用紫外線照射,以破壞存在的核酸.二是空氣中的小片段核酸污染,這些小片段比靶序列短,但有一定的同源性.可互相拼接,與引物互補後,可擴增出PCR產物,而導致假陽性的產生,可用巢式PCR方法來減輕或消除. 出現非特異性擴增帶 PCR擴增後出現的條帶與預計的大小不一致,或大或小,或者同時出現特異性擴增帶 與非特異性擴增帶.非特異性條帶的出現,其原因：一是引物與靶序列不完全互補、 或引物聚合形成二聚體.二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低,及PCR循環次數 過多有關.其次是酶的質和量,往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶 則不出現,酶量過多有時也會出現非特異性擴增.其對策有：必要時重新設計引 物.減低酶量或調換另一來源的酶.降低引物量,適當增加模板量,減少循環次 數.適當提高退火溫度或採用二溫度點法（93℃變性,65℃左右退火與延伸）. 出現片狀拖帶或塗抹帶 PCR擴增有時出現塗抹帶或片狀帶或地毯樣帶.其原因往往由於酶量過多或酶的質量 差,dNTP濃度過高,Mg2+濃度過高,退火溫度過低,循環次數過多引起.其對策有：減少酶量,或調換另一來源的酶.②減少dNTP的濃度.適當降低Mg2+濃 度.增加模板量,減少循環次數.
編輯本段克隆PCR產物
1）克隆PCR產物的最優條件是什麼? 最佳插入片段：載體比需實驗確定.1：1（插入片段：載體）常為最佳比,摩爾數比1：8或8：1也行.應測定比值范圍.連接用5ul 2X連接液,50ng質粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶,插入片段共10ul.室溫保溫1小時,或4℃過夜.在這2種溫度下,缺T-凸出端的載體會自連,產生藍斑.室溫保溫1小時能滿足大多數克隆要求,為提高連接效率,需4℃過夜. 2)PCR產物是否需要用凝膠純化? 如凝膠分析擴增產物只有一條帶,不需要用凝膠純化.如可見其他雜帶,可能是積累了大量引物的二聚體.少量的引物二聚體的摩爾數也很高,這會產生高比例的帶有引物二聚體的克隆,而非目的插入片段.為此需在克隆前做凝膠純化. 3）如果沒有回收到目的片段,還需要作什麼對照實驗? A）塗布未轉化的感受態細胞. 如有菌落,表明氨苄失效,或污染上帶有氨苄抗型的質粒,或產生氨苄抗型的菌落. B）轉化完整質粒,計算菌落生長數,測定轉化效率. 例如,將1ug/ul質粒1:100稀釋,1ul用於100ul感受態細胞轉化.用SOC稀釋到1000ul後,用100ul鋪板.培養過夜,產生1000個菌落.轉化率為：產生菌落的總數/鋪板DNA的總量. 鋪板DNA的總量是轉化反應所用的量除以稀釋倍數.具體而言轉化用10ng DNA,用SOC稀釋到1000u後含10 ng DNA,用1/10鋪板,共用1 ng DNA.轉化率為： 1000克隆X10（3次方） ng /鋪板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug 轉化pGEM-T應用10（8次方）cfu/ ug感受態細胞 如沒有菌落或少有菌落,感受態細胞的轉化率太低. C）如用pGEM-T正對照,或PCR產物,產生>20-40藍斑（用指定步驟10（8次方）cfu/ ug感受態細胞）,表明載體失去T.可能是連接酶污染了核酸酶.T4 DNA連接酶（M1801,M1804,M1794）質量標准好無核酸酶污染,不應用其它來源的T4 DNA連接酶替換. D）用pGEM-T或pGEM-T Easy載體,連接pGEM-T正對照,轉化高頻率感受態細胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的實驗步驟,可得100個菌落,其中60%應為白斑,如產生>20-40藍斑,沒有菌落或少有菌落,連接有問題. 4）對照實驗結果好,卻沒有回收到目的片段,實驗出了什麼問題? A）連接用室溫保溫1小時,能滿足大多數克隆,為提高效率,需4℃過夜. B）插入片段帶有污染,使3`-T缺失,或抑制連接,抑制轉化.為此,將插入片段和pGEM-T正對照混合,再連接.如降低了對照的菌落數,插入片段需純化,或重新制備.如產生大量的藍斑,插入片段污染有核酸酶,使pGEM-T或pGEM-T Easy載體3`-T缺失. C）插入片段不適於連接.用凝膠純化的插入片段,因受UV過度照射,時有發生.UV過度照射會產生嘧啶二聚體,不利於連接,DNA必需重新純化. D）帶有修復功能的耐熱DNA聚合酶的擴增產物末端無A,後者是pGEM-T或pGEM-T Easy載體克隆所需.加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A.詳情查pGEM-T pGEM-T Easy載體技術資料（TM042）. E）高度重復序列可能會不穩定,在擴增中產生缺失和重排,如發現插入片段高頻率地產生缺失和重排,需用重組缺陷大腸桿菌菌株,如SURE細胞.
編輯本段PCR反應的分類
SOEing-PCR（重疊PCR）
重疊區擴增基因拼接法,是基於普通PCR 技術衍生出的一種基因融合和定點突變的有效方法.眾所周知,由於引物只需要與模板有效結合,尤其是5』端序列不必與模板完全配對,因此擴增引物的5』端可以添加一種甚至是兩種酶切位點,以便於後期克隆.SOEing 法正是利用這一特點,向兩個獨立基因摻入一段新的序列以達到兩個基因出現一個重疊區的目的,3』端的結合使基因融合或定點突變得以實現.
RT-PCR（逆轉錄PCR）
RT-PCR 為反轉錄RCR（reverse transcription PCR）和實時PCR（real time PCR）共同的縮寫.逆轉錄PCR,或者稱反轉錄PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR）,是聚合酶鏈式反應（PCR）的一種廣泛應用的變形.在RT-PCR中,一條RNA鏈被逆轉錄成為互補DNA,再以此為模板通過PCR進行DNA擴增.

㈥ PCR的兩步法和三步法有什麼區別

1、步驟不同：兩步法退火和延伸同時在60℃-65℃間進行，以減少一次升降溫過程，而三步法則分兩次完成。

2、用時不同：兩步法減少一次升降溫過程，提高了反應速度，用時較短。而三步法則比兩步法用時更長。

3、適用條件不同：兩步法中，PCR擴增區很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時間內復制完成。三步法的PCR擴增區則較長，需要降低系統溫度，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈。

(6)非瘟pcr檢測三個片段的方法擴展閱讀

三步法的標准步驟與檢測：

1、DNA變性：（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA

2、退火：（60℃-65℃）：系統溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈。

3、延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP為原料，從引物的3′端開始以從5′→3′端的方向延伸，合成與模板互補的DNA鏈。

4、檢測：PCR反應擴增出了高的拷貝數，下一步檢測就成了關鍵。熒光素（溴化乙錠，EB）染色凝膠電泳是最常用的檢測手段。電泳法檢測特異性是不太高的，因此引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判。但因為其簡捷易行，成為了主流檢測方法。近年來以熒光探針為代表的檢測方法，有逐漸取代電泳法的趨勢。

㈦ PCR方法

聚合酶鏈式反應，簡稱PCR，是一種分子生物學技術，用於放大特定的DNA片段。可看作生物體外的特殊DNA復制。
原理是DNA的半保留復制以及可以通過溫度變化控制DNA的變性和復性。
參加PCR反應的物質主要有五種：
引物(PCR引物為DNA片段，細胞內DNA復制的引物為一段RNA鏈）、酶、Taq DNA聚合酶、模板和緩沖液（其中需要Mg2+）。
標準的PCR過程分為三步：
1.DNA變性
（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下， 氫鍵斷裂，形成單鏈DNA
2.退火
（25℃-65℃）：系統溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈。
3.延伸
（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補的DNA鏈。
每一循環經過變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。如圖所示：
現在有些PCR因為擴增區很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時間內復制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行，以減少一次升降溫過程，提高了反應速度。

㈧ 非洲豬瘟的檢測方法有哪些非洲豬瘟疫情防控方法是什麼

熒光定量 PCR 方法，該方法是將光譜技術引入到PCR 反應中，通過熒光信號的強弱變化定量測定特異性擴增產物的量，解決了常規 PCR 方法敏感性低和電泳檢測中溴化乙錠對環境的污染問題。

等溫擴增法，該方法是一種新興的分子生物學檢測方法，等溫擴增方法不需要 PCR 中的變性、退火步驟，即可完成對靶序列的循環擴增，大幅縮短了時間，整個擴增反應時間一般少於 60 min，而常規PCR 方法的反應時間一般需要 2 h 以上。等溫擴增試劑盒適合現場檢測，靈敏度高，能夠大幅提高豬瘟防控的可行性。

要減少場外人員和車輛進入豬場，要對人員和車輛入場前徹底消毒，要對豬群實施全進全出飼養管理，要對新引進生豬實施隔離，要按規定申報檢疫。

非洲豬瘟防控注意事項

養殖場應該堅持全進全出，自繁自育的養殖模式，構建完善的封鎖隔離措施，避免豬和野豬直接接觸。養殖場在生豬調運過程中，盡量不要跨省引進種豬，必須引種時，一定要進行嚴格的產地檢疫、疫情檢測，嚴格執行落地報告制度和隔離觀察制度。

殖場內部如果發現非洲豬瘟可疑疫情，嚴格按照《非洲豬瘟疫情應急預案》進行處置，迅速採取應急措施，預防疫情傳播和蔓延。

㈨ 簡述PCR技術操作步驟

PCR即聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction）的縮寫，它是體外酶促合成特異DNA片段的方法。這一方法的要點是合成兩個分別互補於待擴增DNA片段兩端的小片段引物，在含有引物、待擴增DNA模板核苷酸底物和DNA多聚酶的反應體系中DNA復制反復進行，在短時間內可以取得大量擴增產物。其原理是寡聚核苷酸鏈引物在DNA聚合酶的作用下沿模板延伸，合成兩個與靶DNA兩側序列互補的引物，在體外進行靶DNA的重復合成。
主要的技術步驟是：
（1）DNA變性 加熱使靶DNA序列雙鏈解離成單鏈DNA。
（2）引物與靶DNA退火 適當降低溫度，使兩個引物分別結合成靶DNA兩條的3′末端向5′末端延伸。
（3）引物延伸 在DNA聚合酶的催化下，引物沿著靶DNA3′末端向5′末端延伸。新合成的DNA鏈在變性解離後，又可作為模板與引物雜交，並且在DNA聚合酶的催化下，引導合成新的靶DNA鏈。如此反復進行以上3個步驟，即可使靶DNA片段指數性擴增。

㈩ PCR產物的檢測方法有哪些都有什麼原理

1.瓊脂糖凝膠電泳
同時點分子量marker，根據marker條帶判斷產物分子量大小，從而大致判斷是不是你要的
2.酶切
已知你產物的序列，看上面有什麼酶切位點，用一個酶或者兩個酶切斷，看與理論預測的條帶數目和大小是否一致。一般檢測有以上兩步就行了，如果需要知道確切的需要進行3
3.測序
連接到pMD-18t
載體上，轉到大腸桿菌中。拿到公司去測序，測序結果通過gene
bank比對看與哪個基因一致，這種方法最准確
4.表達
pcr產物連到真核或者原核表達載體上，適宜條件表達出來以後的蛋白做質譜分析，看與理論產物表達的蛋白是否有一致的片段