建立一種糖基化檢測的方法

Ⅰ 糖基化的過程

N-連接的糖鏈合成起始於內質網，完成於高爾基體。在內質網形成的糖蛋白具有相似的糖鏈，由Cis面進入高爾基體後，在各膜囊之間的轉運過程中，發生了一系列有序的加工和修飾，原來糖鏈中的大部分甘露糖被切除，但又被多種糖基轉移酶依次加上了不同類型的糖分子，形成了結構各異的寡糖鏈。糖蛋白的空間結構決定了它可以和那一種糖基轉移酶結合，發生特定的糖基化修飾。
許多糖蛋白同時具有N-連接的糖鏈和O-連接的糖鏈。O-連接的糖基化在高爾基體中進行，通常的一個連接上去的糖單元是N-乙醯半乳糖，連接的部位為Ser、Thr和Hyp的羥基，然後逐次將糖基轉移到上去形成寡糖鏈，糖的供體同樣為核苷糖，如UDP-半乳糖。糖基化的結果使不同的蛋白質打上不同的標記，改變多肽的構象和增加蛋白質的穩定性。
在高爾基體上還可以將一至多個氨基聚糖鏈通過木糖安裝在核心蛋白的絲氨酸殘基上，形成蛋白聚糖。這類蛋白有些被分泌到細胞外形成細胞外基質或粘液層，有些錨定在膜上。

Ⅱ 糖基化蛋白怎麼測定其糖含量

糖基化是在酶的控制下, 蛋白質或脂質附加上糖類的過程
可以用去糖基化沒分離蛋白質與糖基，在進行測量

Ⅲ 糖鏈分析有哪些常規方法和步驟

蛋白質糖基化是人體中最重要的一種蛋白質翻譯後修飾方式,人體中超過50%的蛋白質是糖基化的。研究發現,寡糖在蛋白質結構構造、生物活性中起著至關重要的作用,人類許多疾病的發生和發展都與蛋白上N-糖鏈的結構和表達量的改變有關。因此,發展和建立分析N-糖鏈的方法,對生物和病理學研究具有積極現實意義。目前的研究方法主要是化學衍生法,其缺點是需要引入額外的化學試劑、操作步驟繁瑣以及有副反應發生。化學酶標記法由於沒有化學衍生法的特點,為研究糖蛋白中的N-糖鏈,提供了新的思路。首先,在本實驗室前人工作的基礎上,以Boc-Asn-GlcNAc為基礎結構單元物質合成了同位素標記糖基受體d0/d8-PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc,優化了受體合成方法：以DMT-MM作為反應縮合劑,探索溫度、時間、反應物比例對受體產率的影響,合成受體反應產率達到95-98%。隨後,我們以標准糖肽SGP為反應底物,對比Endo-M酶、(?)Endo-M-N175Q酶的轉糖基活性和水解活性,結果表明Endo-M-N175Q酶的轉糖基活性幾乎是Endo-M酶的2倍,且Endo-M-N175Q酶幾乎喪失對轉糖基產物的水解能力。緊接著我們以標准糖蛋白牛胰核糖核酸酶B為研究對象,對比丙酮富集N-糖鏈和N-糖苷酶F釋放N-糖鏈兩種方法檢測糖鏈的效率,結果表明N-糖苷酶F釋放N-糖鏈簡便、高效。為了檢驗該方法的實用性,我們以卵清蛋白為實際樣品,成功、高效地檢測出一系列N-糖鏈(M5N2、M6N2、M7N2、M4N3、M5N3、M3N4、 M3N5、M4N4、M3N6),和文獻己報到的寡糖數量一致,正離子模式下這些寡糖都是以二價或三價的形式出現。相比於傳統的化學衍生化法,Endo-M-N175Q酶可以一步完成酶解和轉移兩個過程,避免了繁瑣的步驟以及副反應的發生。因此,我們提出的以含有Boc-Asn-G1cNAc結構單元的化學物質作為糖基受體、結合Endo-M-N-175Q酶的特性、以HPLC/ESI-MS為檢測手段,這一全新的分析方法,對分析糖蛋白中的N-糖鏈切實高效可行。…

Ⅳ 糖基化血紅蛋白要怎樣測定

實際上1、2次的血糖值並不能真正反映出血糖的階段水平，要想知道血糖的階段值可以測量血糖的糖基化血紅蛋白。糖基化血紅蛋白是葡萄糖與血紅蛋白結合的產物。血糖升高，合成的糖基化血紅蛋白就增加；血糖降低了，新合成的糖基化血紅蛋白就也就隨之降低。但是已經合成的糖基化血紅蛋白在2～3個月內並不減少，而是恆定不變的。因此，該指標穩定性強，不受各種偶然因素影響。近年來，已把它作為評價治療水平的重要指標。但是，糖基化血紅蛋白不能反應血糖的變化規律，所以不能以它替代血糖的測定。正確的作法是血糖與糖基化血紅蛋白結合起來觀察。但要注意的是貧血患者的糖基化血紅蛋白不能准確反應血糖的真實水平。

如果條件允許的話，最好每3個月化驗一次糖基化血紅蛋白。

Ⅳ 請教關於糖基化程度的分析方法

糖基化程度的分析過程大致如下：首先是鑒定糖蛋白，即確定糖蛋白的存在；其次是富集糖蛋白，即糖蛋白的分離存化。

糖蛋白的檢測大致有以下幾種：放射性標記法、分子熒游標記法、電泳法、凝集素標記法、抗體標記法和化學酵素法。

獲得糖基化蛋白的方法主要是電泳法和層析法。電泳法即通過電泳的方法先得到糖蛋白條帶或蛋白點，再通過電洗脫或透析的方法得到糖蛋白。此方法較為費時，且在操作中易使蛋白變性。而層析法則具有快速、准確、解析度高、穩定性好等特點，是分析糖蛋白的理想手段。目前，利用抗體、凝集素進行親和層析已成為分離存化糖蛋白的主要方法。

糖基化氨基酸位點的鑒定中，Edman降解法冗長，需要高超的實驗技巧和較多的蛋白質，且無法處理N－端封閉的蛋白質。因此，隨著質譜技術的發展，此法已不在被廣泛使用。核磁共振技術也可用於糖基化氨基酸位點的鑒定。這種方法可在液態溶液中直接進行蛋白質結構測定。糖鏈結構的鑒定也採用質譜技術、毛細管電泳技術、氣相色譜技術及凝集素親和技術。

Ⅵ 課堂小貼士：糖基化

 所謂糖基化即體內的葡萄糖分子或其他糖類分子錯誤地粘貼到蛋白質上，引起蛋白質變性，這一有害反應與氧化反應一樣對衰老起著推動作用，也是引發糖尿病並發症的重要因素。

  此處我們所講的糖基化，特指血液中的糖和體內細胞粘貼到一起的反應，也是造成糖尿病各類並發症的病因所在。

要了解它的三圍

  一圍「粘上去」：健康的人體也會產生這種反應，但血液中的糖與細胞粘貼到一起後，會隨著血糖濃度下降而自然脫落。（這時此反應的特點是高度可逆化）

二圍「粘上去下不來」）：對於糖尿病患者，由於血糖濃度高於正常水平，血液中的糖與細胞粘貼上，數小時後才能脫落。在這個過程中，糖會越粘越多，並與細胞產生了化學反應，粘貼變得牢固，造成部分細胞被糖化，喪失細胞本身的生理功能。（這是的特點是正反應大於逆反應）

三圍「粘貼在一起」：當細胞表面糖分越積越多，數周後產生一系列化學反應，它的體積就會增大5-10倍。隨著體積增大，兩個細胞就會粘貼在一起，這兩個細胞就會失去功能，這個現象屬於不可逆轉現象，就會產生晚期糖基化末產物AGES，只能等待細胞自然死亡。目前發現AGES與人體衰老有著密切的關系。這時的特點是此反應不可逆，同時細胞失去正常功能，體積增大5-10倍。

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糖基化終產物（Advanced Glycation End procts，AGE），是指在非酶促條件下，蛋白質、氨基酸、脂類或核酸等大分子物質的游離態氨基與還原糖的醛基經過縮合、重排、裂解、氧化修飾後產生的一組穩定的終末產物。該反應稱為糖基化反應又稱為美拉德反應，最早由法國食品化學家Maillard於1912年提出。直到1980年AGE的病理生理意義才被發現，體內蓄積的AGE被證明參與多種疾病的病理變化，尤其是糖尿病、炎症、神經退行性疾病和心血管疾病。時刻關注AGE值，對健康具有重要意義！

正常情況下，隨著年齡的增長，AGE在我們體內是緩慢蓄積的，例如在嬰幼兒體內各器官幾乎不含AGEs，可在成人體內卻含有AGEs，並隨著年齡增長而增加。但是在糖尿病（或前期）患者體內，由於血糖處於長期的高水平或劇烈波動狀態，就會導致AGE的加速形成，產生的過量AGE會在我們體內堆積，附著在健康的細胞、關節、器官、皮膚，及身體的其他系統上，通過直接或間接的作用導致糖尿病及其並發症的發展。AGE主要通過以下3個方面促進糖尿病的發生與發展：①AGE導致胰島β細胞凋亡，並直接修飾胰島素，導致胰島素功能異常，還可抑制胰島素信號通路，最終導致胰島素抵抗。②AGE與細胞外基質大分子交聯，阻礙其正常降解；同時使其生成增加，導致基底膜增厚、硬化。③AGE與細胞膜上的受體RAGE結合，改變細胞內信號轉導，發揮多種作用。以糖尿病視網膜病為例，AGEs能顯著減少視網膜血管內皮細胞，並與眼睛的基底膜、角膜等發生糖化引發角膜變性，導致眼睛異常，因此即使是年輕人，也可能患上白內障、視網膜病變等疾病，除此之外，AGEs的蓄積也對眼睛造成許多的不良影響，例如：眼睛疲勞、乾眼症、視力下降等。

除了體內過量的糖與蛋白質相結合會在身體內產生AGEs，基因個體差異性、壓力、疾病、熬夜、不良的生活方式以及生活中過多食用高糖、高AGE和高碳水化合物的食物，也會導致體內AGEs生成和堆積；日常生活中通過膳食攝入的AGE，約有10% 進入血液循環，僅1/3 通過腎臟排出體外，2/3 留在體內，與組織結合蓄積在體內，從而對人體造成傷害，誘發各種疾病的發生。大量研究表明溫度是AGE形成的重要因素，例如烘焙、燒烤和油炸均能導致AGE的大量生成，現代工業加工食品的工藝更利於AGE的形成。在以往的動物實驗中，長期喂養含AGE高的飲食會影響胰島素敏感性和導致2型糖尿病的發生。而在健康肥胖人群中，減少AGE的攝入可以增加機體胰島素的敏感性，是超重人群降低糖尿病和心血管疾病發生率的有效手段！

AGE具有自發熒光特性，積累量越多，熒光強度越強。因此通過檢測皮膚熒光光譜，就能反映皮膚AGE的累積量，最終應用於糖尿病的臨床。作為糖尿病及其並發症的重要治病因子，檢測AGE具有重要意義：①對於健康人群，可以反映將來患糖尿病的風險大小，做到提前預警，早干預，早治療；②對於糖尿病患者，則可以反映糖尿病或相關並發症的嚴重程度，評估糖尿病的治療效果，以便進一步優化治療方案。需要注意的是，檢測AGE並不是要代替檢測糖化血紅蛋白和血糖，一般來說，如果血糖長期處於高水平或劇烈波動狀態，就會導致AGE的加速生成；血糖反映的是即時的血糖水平、變化較大，而AGE變化較為緩慢，兩者並不是線性相關，並不一一對應；糖化血紅蛋白反映的是近2~3月血糖平均水平，而AGE不僅反映長期血糖控制情況，更是相關並發症的重要致病因子，可以直接導致相關並發症的發生發展，其水平的高低可以反映患並發症的嚴重程度和風險大小。所以AGE與血糖、糖化血紅蛋白，三者之間是互補的關系！

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AGEs是蛋白質、脂肪和糖類結合在一起，產生非酶促反應的終產物，會擾亂正常細胞的代謝活動。溫度越高，這種非酶促反應越激烈。因此高溫烹飪，如煎、炸、烤、碳烤、炙烤等方法，會產生大量的AGEs。因為AGEs是糖和蛋白結合的產物，所以富含豐富蛋白和糖分的食物是產生AGEs的上佳原料。AGEs在各種高加工的肉製品，尤其是高溫加工的紅肉中廣泛存在。在甜食和即食產品中，AGEs含量也很高。

除了飲食中的AGEs，我們身體新陳代謝也產生AGEs，但是人體有自動排出有害物質包括AGEs的機制，因此這些AGEs可通過身體代謝處理掉。但如果通過食物攝取過多的AGEs，超過了身體能處理的量，AGEs就會逐漸堆積下來。所有細胞都會受到AGEs的影響，不光引起早衰還會發展成心腦血管疾病、腎病甚至阿爾茨海默疾症。

飲食中的AGEs對糖尿病的影響

要減少AGEs的攝取量，我們就要選擇AGEs含量低的食物。這點對於減少胰島素抵抗和二型糖尿病的發病率特別重要。美國西奈山醫學院研究AGEs 和糖尿病的專家--醫學類教授Jaime Uribarri博士在接受采訪時說：「我們非常確定通過限制飲食來減少AGEs攝取量（對糖尿病）特別重要」。

在2011年的糖尿病護理雜志中，Uribarri博士的研究團隊發現AGEs的攝取可能對二型糖尿病中產生的胰島素抵抗有促進作用，而控制飲食中的AGEs含量則可以提高身體自我功能調節，幫助抗氧化和減少胰島素抵抗。在這項研究中，兩組糖尿病人在接受正常糖尿病治療的前提下，隨機採用高或低AGEs飲食。低AGEs組的病人胰島素抵抗改善程度比只接受常規糖尿病治療的人要好很多。Uribarri博士也說，「這樣顯著的結果讓我們自己也感到十分驚訝！」

Uribarri小組的另一項發表在《現代糖尿病報告》的研究顯示，在二型糖尿病患者中，如果飲食中攝取大量AGEs，血液中的AGEs也會增加。減少飲食中攝取AGEs的量，患者的胰島素敏感性增加了40%。他們總結道：「過量地攝取AGEs是潛在的導致糖尿病的主要因素。」

目前，Uribarri小組正在召集一系列代謝疾病患者，採用為期一年的低AGEs飲食方法，來判斷低AGEs飲食是否能預防糖尿病。Uribarri博士對預期結果表示十分樂觀。

怎樣降低飲食中的AGEs

1

更改烹飪方式

最有效的降低飲食中AGEs含量的方法是更改烹飪方式。在2010年美國糖尿病聯合協會的會刊中發表了Uribarri組開發的一個低AGEs飲食指導。研究人員發現高溫加熱的食品和AGEs攝取量有直接聯系。他們比較了不同的烹飪方法，發現干火高溫的烹飪過程產生的AGEs比未烹飪前增加了10倍甚至100倍。 實驗證明，加熱過程中加水、縮短烹飪時間和降低烹飪溫度，並添加酸性調味品，例如醋或者檸檬汁，可以將產生的AGEs含量控制到最低。

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用蒸、煮代替煎、炸

一組丹麥科學家證實在已經患有肥胖症的女性當中，如果吃高溫烹飪的食物產生的胰島素抵抗比吃水煮或蒸的食物要高很多。

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用酸性調味料

美國推進低AGEs飲食協會的Baird教授推薦特別喜歡吃油炸食物的人可以在烹飪過程放入酸性調味品，例如醋等。酸性環境會降低AGEs的產生量，同時「加入的酸性物質還會提高食品的香味，使得食物更美味。」

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用慢燉鍋

Baird教授還建議用中火加熱，避免高溫大火長時間加熱。另外還可以用慢燉鍋，它們可以用更少的油，低溫長時加熱，可以更好的保存營養素。

如果我很喜歡炸雞和烤串怎麼辦？

如果不可能放棄煎炸食品，那麼就減少每次吃的量吧。

2

分辨高AGEs與低AGEs食物

高蛋白質和脂肪的肉類更容易在加工過程產生AGEs，而含有高碳水化合物的食品，例如水果、蔬菜、和全穀物，加熱後仍保持較低的AGEs水平。

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AGEs含量高的食物

  糖類例如糖果、餅干、蛋糕、蘇打和油酥糕點

  深加工食品，包括已經烹飪好的肉類和乳酪

  高脂肪肉（特別是紅色的肉）

  脂肪含量高的食物，包括黃油，人造黃油和油

  油炸食品

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AGEs含量低的食物

  水果和蔬菜

  海產品

  全穀物食品

  低脂麵包

  千層面

  素食漢堡

3

多吃蔬菜「解毒」

事實上，吃更多的蔬菜和水果是另一個很好的減少AGEs攝取量的方法。Baird教授強調道，飲食中的植物營養素實際上對人體有特別多的好處。例如從有顏色的莓類如藍莓、草莓中可以提取出環烯醚萜苷。它作為一種植物營養素，可以降低體內AGEs的循環量。

4

保持健康生活習慣

睡眠缺乏的人體內存在更多的AGEs。睡眠期間，身體大部分組織都在生長、修復、調整到最佳狀態去抵抗AGEs。睡眠質量高（每天晚上保證7到9小時睡眠）、保持日常運動（每周保障鍛煉150分鍾）、減少壓力再加上健康的飲食、積極配合進行肥胖和高血壓的治療，可以顯著減少體內的AGEs。

Ⅶ 哪裡能檢測蛋白質糖基化

蛋白質的糖基化

糖蛋白在細胞內部，細胞膜和細胞外均有發現，實際上大部分蛋白質是糖蛋白。對糖蛋白的檢測和分析發現，糖蛋白中糖組分的結構和功能具有多樣性。糖蛋白中的糖通常是不同種類的，而且是由一些可控數量的單糖組成。糖基化的多樣性與細胞周期，細胞分化和發展的狀態有關。在蛋白組時代中，蛋白質的修飾會引起其理化性質的改變，因此是不容忽視的。

從1D或2D凝膠得到的糖基化蛋白的識別，一般是進行MALDI-MS指紋分析， 或是對MALDI-PAD或ESI-MS/MS得到的碎片譜進行分析。對完整的糖蛋白的研究是非常困難的，所有已知的離子化技術都有其局限性。目前，人們主要研究糖肽，其好處之一就是質量減小了，這就會得到更好的解析度，而且糖肽仍保留了糖基化位點。將分離的糖蛋白用不同的蛋白酶消化後就可進行糖肽的研究。一旦糖肽被識別出，就可以用串連質譜(ESI-MS/MS)來闡明肽序列。當蛋白的序列已知時，計算質量差就可推出其上附著的寡糖的質量。

要將糖部分從糖蛋白中釋放出來，可用化學切割或酶切割。目前，連有結構專一性糖苷酶的質譜在提供序列，分支和鏈接數據方面是最有力的技術。對於N糖基化常用的糖苷內切酶有PNGase-F, PNGase-A, EndoF和EndoH。化學切割也可以用來釋放O-連接和N-連接的多糖，但經常出現的缺點是他會完全破壞所有的肽鍵，因而丟失了關於糖附著位點的信息。而且這些切割不能從糖肽中連續釋放單糖。用肼的化學切割可以除去兩種類型的糖基化。在60℃可專一性的釋放O-連接的糖，而在95℃能釋放N-連接的糖。釋放O-原子更常用的方法是用鹼進行β消除。通常，糖基中加入金屬離子在MALDI和ESI中離子化。用MALDI-MS分析糖類的一個好的選擇是將之與其他一些化合物混合，這樣可以進一步提高靈敏度和解析度。不同的質譜方法可以產生多糖的源後裂解(PSD)和碰撞誘導解離 (CID)譜，這可以給出有關糖的序列，分支及糖間的連接等信息。