檢測代謝路徑的方法

『壹』 用放射性同位素標記法為什麼能追蹤細胞內物質代謝途徑

用放射性同位素標記法為什麼能追蹤細胞內物質代謝途徑
同位素示蹤法（isotopic tracer method）是利用放射性核素作為示蹤劑對研究對象進行標記的微量分析方法,示蹤實驗的創建者是Hevesy.Hevesy於1923年首先用天然放射性212Pb研究鉛鹽在豆科植物內的分布和轉移.繼後Jolit和Curie於1934年發現了人工放射性,以及其後生產方法的建立（加速器、反應堆等）,為放射性同位素示蹤法的更快的發展和廣泛應用提供了基本的條件和有力的保障.
一、同位素示蹤法基本原理和特點
同位素示蹤所利用的放射性核素（或穩定性核素）及它們的化合物,與自然界存在的相應普通元素及其化合物之間的化學性質和生物學性質是相同的,只是具有不同的核物理性質.因此,就可以用同位素作為一種標記,製成含有同位素的標記化合物（如標記食物,葯物和代謝物質等）代替相應的非標記化合物.利用放射性同位素不斷地放出特徵射線的核物理性質,就可以用核探測器隨時追蹤它在體內或體外的位置、數量及其轉變等,穩定性同位素雖然不釋放射線,但可以利用它與普通相應同位素的質量之差,通過質譜儀,氣相層析儀,核磁共振等質量分析儀器來測定.放射性同位素和穩定性同位素都可作為示蹤劑（tracer）,但是,穩定性同位素作為示蹤劑其靈敏度較低,可獲得的種類少,價格較昂貴,其應用范圍受到限制；而用放射性同位素作為示蹤劑不僅靈敏度,測量方法簡便易行,能准確地定量,准確地定位及符合所研究對象的生理條件等特點：
1.靈敏度高
放射性示蹤法可測到10-14－10-18克水平,即可以從1015個非放射性原子中檢出一個放射性原子.它比目前較敏感的重量分析天平要敏感108-107倍,而迄今最准確的化學分析法很難測定到10-12克水平.
2.方法簡便
放射性測定不受其它非放射性物質的干擾,可以省略許多復雜的物質分離步驟,體內示蹤時,可以利用某些放射性同位素釋放出穿透力強的r射線,在體外測量而獲得結果,這就大大簡化了實驗過程,做到非破壞性分析,隨著液體閃爍計數的發展,14C和3H等發射軟β射線的放射性同位素在醫學及生物學實驗中得到越來越廣泛的應用.
3.定位定量准確
放射性同位素示蹤法能准確定量地測定代謝物質的轉移和轉變,與某些形態學技術相結合（如病理組織切片技術,電子顯微鏡技術等）,可以確定放射性示蹤劑在組織器官中的定量分布,並且對組織器官的定位準確度可達細胞水平、亞細胞水平乃至分子水平.
4.符合生理條件
在放射性同位素實驗中,所引用的放射性標記化合物的化學量是極微量的,它對體內原有的相應物質的重量改變是微不足道的,體內生理過程仍保持正常的平衡狀態,獲得的分析結果符合生理條件,更能反映客觀存在的事物本質. 放射性同位素示蹤法的優點如上所述,但也存在一些缺陷,如從事放射性同位素工作的人員要受一定的專門訓練,要具備相應的安全防護措施和條件,在目前個別元素（如氧、氮等）還沒有合適的放射性同位素等等.在作示蹤實驗時,還必須注意到示蹤劑的同位素效應和放射效應問題.所謂同位素效應是指放射性同位素（或是穩定性同位素）與相應的普通元素之間存在著化學性質上的微小差異所引起的個別性質上的明顯區別,對於輕元素而言,同位素效應比較嚴重.因為同位素之間的質量判別是倍增的,如3H質量是1H的三倍,2H是1H的兩倍,當用氚水（3H2O）作示蹤劑時,它在普通H2O中的含量不能過大,否則會使水的物理常數、對細胞膜的滲透及細胞質粘性等都會發生改變.但在一般的示蹤實驗中,由同位素效應引起的誤差,常在實驗誤差內,可忽略不計.放射性同位素釋放的射線利於追蹤測量,但射線對生物體的作用達到一定劑量時,會改變機體的生理狀態,這就是放射性同位素的輻射效應,因此放射性同位素的用量應小於安全劑量,嚴格控制在生物機體所能允許的范圍之內,以免實驗對象受輻射損傷,而得錯誤的結果.

『貳』 微生物發酵代謝產物途徑中間產物的測定方法

先經分離純化得到你測純物質（≥95%），再進行質譜、核磁、同位素等的檢測，打出圖譜，然後再進行解譜，空間結構的話還需要一些的反應！很復雜！

『叄』 研究微生物代謝途徑常用的方法有哪些

微生物的代謝調節主要有兩種方式：酶合成的調節和酶活性的調節.
酶合成的調節
【酶合成的調節】：微生物細胞內的酶可以分為組成酶和誘導酶兩類.組成酶時微生物細胞內一直存在的酶,它們的合成只受遺傳物質的控制,而誘導酶則時在環境中存在某種物質的情況下才能夠合成的酶.例如,在用葡萄糖和乳糖作碳源的培養基本上培養大腸桿菌,開始時,大腸桿菌只能利用葡萄糖而不能利用乳糖,只有當葡萄糖被消耗完畢以後,大腸桿菌才開始利用乳糖,只有當葡萄糖被消耗完畢以後,大腸桿菌才開始利用乳糖.
酶活性的調節
【酶活性的調節】：微生物還能夠通過改變已有酶的催化活性來調節代謝的速率.酶活性發生主要原因時,代謝過程中產生的物質與酶結合,致使酶的結構產生變化.這種調節現象在核苷酸、維生素的合成代謝中十分普遍.
總結
上述兩種調節方式時同時存在,並且密切配合、協調作用的.通過對代謝的調節,微生物細胞內一般不會累積大量的代謝產物.

『肆』 如何利用KEGG定位基因屬於哪個代謝通路

如何利用KEGG定位基因屬於哪個代謝通路
代謝通路：目前在通路資料庫(PATHWAY database) 中代謝通路是建立得最好的，有大約90個參考代謝途徑的圖形。每個參考代謝途徑是一個由酶或EC號組成的網路。
利用如下方法可通過計算機構建出生物體特有 的代謝通路：
先根據基因的序列相似性和位置相關性確定基因組中酶的基因。
然後合理地安排EC號。
最後將基因組中的基因和參照通路中用EC號編號的基因產物 結合起來。

『伍』 代謝組學 如何查找代謝通路

幫您查了一個編程代碼可以解決：
use my package clusterProfiler
http://bioconctor.org/packages/devel/bioc/html/clusterProfiler.html

> require(clusterProfiler)
> data(gcSample)
> gcSample[[3]]
[1] "4905" "10383" "10953" "645958" "7280" "10381" "5869" "5985"
[9] "23197" "290" "309" "10577" "23071" "121504" "2495" "653226"
[17] "84617"
> x <- enrichKEGG(gcSample[[3]])
Warning messages:
1: 'l2e' is deprecated, use 'list2env' instead
2: 'l2e' is deprecated, use 'list2env' instead
> summary(x)
pathwayID Description GeneRatio BgRatio
05130 hsa05130 Pathogenic Escherichia coli infection 4/17 59/5504
04145 hsa04145 Phagosome 5/17 159/5504
04540 hsa04540 Gap junction 4/17 90/5504
04962 hsa04962 Vasopressin-regulated water reabsorption 2/17 44/5504
pvalue qvalue geneID Count
05130 2.554952e-05 0.005397106 10383/7280/10381/84617 4
04145 8.823916e-05 0.009219728 10383/7280/10381/5869/84617 5
04540 1.352278e-04 0.010247594 10383/7280/10381/84617 4
04962 7.871612e-03 0.376048432 4905/5869 2

『陸』 研究代謝途徑的互補測驗是什麼

需要更具體點，因為生物中的互補實驗有好幾個，
比如酵母雙雜交的互補實驗
又如藍白斑的互補實驗
又如雙分子熒光互補分析技術等等 雙分子熒光互補(bimolecular fluorescence complementation，BiFC)分析技術，是由Hu等在2002年最先報道的一種直觀、快速地判斷目標蛋白在活細胞中的定位和相互作用的新技術。該技術巧妙地將熒光蛋白分子的兩個互補片段分別與目標蛋白融合表達，如果熒光蛋白活性恢復則表明兩目標蛋白發生了相互作用.其後發展出的多色熒光互補技術(multicolor BiFC)，不僅能同時檢測到多種蛋白質復合體的形成，還能夠對不同蛋白質間產生相互作用的強弱進行比較。目前，該技術已用於轉錄因子，G蛋白βγ亞基的二聚體形式，不同蛋白質間產生相互作用強弱的比較以及蛋白質泛素化等方面的研究工作上。該方法利用綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)及其突變體的特性作為報告基因，將熒光蛋白分割成兩個不具有熒光活性的分子片段，再分別與目標蛋白連接。如果兩個目標蛋白因為有相互作用而靠近，就使得熒光蛋白的兩個分子片段在空間上相互靠近，重新形成活性的熒光基團而發出熒光。在熒光顯微鏡下，就能直接觀察到兩目標蛋白是否具有相互作用，並且在最接近活細胞生理狀態的條件下觀察到其相互作用發生的時間、位置、強弱、所形成蛋白質復合體的穩定性，以及細胞信號分子對其相互作用的影響等，這些信息對研究蛋白質相互作用有一定意義。

『柒』 代謝組學的研究方法

代謝組學的研究方法與蛋白質組學的方法類似，通常有兩種方法。一種方法稱作代謝物指紋分析 （metabolomic fingerprinting），採用液相色譜-質譜聯用（LC-MS）的方法，比較不同血樣中各自的代謝產物以確定其中所有的代謝產物。從本質上來說，代謝指紋分析涉及比較不同個體中代謝產物的質譜峰，最終了解不同化合物的結構，建立一套完備的識別這些不同化合物特徵的分析方法。另一種方法是代謝輪廓分析（metabolomic profiling）,研究人員假定了一條特定的代謝途徑，並對此進行更深入的研究。
對於代謝產物來說，不僅只有質譜峰這個特徵。更進一步說，質譜（MS）並不能檢測出所有的代謝產物，並不是因為質譜的靈敏度不夠，而是由於質譜只能檢測離子化的物質，但有些代謝產物在質譜儀中不能被離子化。採用核磁共振（NMR）的方法，可以彌補色譜的不足。劍橋大學的Jules Griffin博士，正在使用質譜與核磁共振結合的方法，試圖建立機體中的完整代謝途徑圖譜。Griffin用核磁共振檢測高豐度的代謝產物，由於核磁共振檢測的靈敏度不高，所以只用於分析低豐度代謝產物。
過去，只有毒理學方面的研究使用核磁共振，而質譜只在植物代謝研究中採用。如今，這兩種方法在代謝組學研究中已經普遍使用。為在不同樣品間進行有意義的比較，研究人員必須結合使用這兩種方法獲得的大量數據進行分析。此外，還需要結合基因組學研究獲得的數據。
Gary Siuzdak博士在美國克利普斯研究院（TSRI）從事生物信息學問題的研究，他設計了一個分析來自不同樣品代謝產物變化的實驗方案。研究人員可以通過生物信息學軟體XEMS比較不同的數據，從而識別出代謝產物。軟體提供了所有代謝產物的分子量數據，這些代謝產物濃度因不同的個體而變化。公眾可以從網上免費獲取這些數據。
Siuzdak博士表示，他們正採用綜合研究的方法進行代謝組學研究，試圖檢測出盡可能多的代謝產物，超越人們過去使用方法所能達到的目標。通過個體研究，希望能在一定程度上識別出與應激有關的新分子，這些應激物可能是一種疾病，一種敲除酶，或者是其他的物質。

『捌』 如何查找一個基因參與的代謝通路

代謝通路：目前在通路資料庫(PATHWAYdatabase)中代謝通路是建立得最好的，有大約90個參考代謝途徑的圖形。每個參考代謝途徑是一個由酶或EC號組成的網路。

利用如下方法可通過計算機構建出生物體特有的代謝通路：

1. 先根據基因的序列相似性和位置相關性確定基因組中酶的基因。

2. 然後合理地安排EC號。

3. 最後將基因組中的基因和參照通路中用EC號編號的基因產物結合起來。

   
   

『玖』 研究微生物的某一條代謝途徑，最簡單的方法是什麼是否一定要用到同位素標記法

最簡單的方法是破壞這條代謝途徑所需的酶。
不一定使用同位素標記法，可以使用上述方法。

希望能幫助你。^__^

『拾』 轉錄組分析怎樣尋找代謝通路基因

般的轉錄組測序可以得到大量差異表達基因和調控代謝通路，但由於基因與表型難以直接關聯，導致關鍵信號通路難以確定，因此往往達不到預期研究目的。相信很多做過轉錄組測序的老師都深有體會。總感覺中間缺少了一步？沒錯，就是代謝物！代謝物是基因型與表型之間的橋梁，代謝物的變化更能直接揭示基因的功能，因此能夠更有效地揭示生物學及其生化、分子機理。在植物研究中，目前代謝組+轉錄組的策略已經被廣泛運用於植物生理、生長發育、及逆境脅迫研究中。
那麼如何進行代謝組與轉錄組的關聯分析？總的來說，是基於「參與同一生物過程中的基因或代謝物具有相同或相似的變化規律」這一原理進行分析的。舉個例子，研究不同顏色品種的菊花顏色差異的原因，首先通過代謝物檢測，發現不同顏色品種的菊花積累的花青素類型和含量並不一致；然後進行轉錄組測序，在眾多差異基因及代謝通路中，我們可以重點研究與花青素合成相關的代謝通路上的基因，從而一方面快狠准地找到導致顏色差異的功能基因，另一方面代謝組的結果也相當於是對轉錄組結果的驗證。