如何鑒定rna病毒方法

『壹』 RT-PCR檢測方法的具體步驟

RT-PCR檢測方法的具體步驟如下：

（一）RNA提取
1、根據標本數量分裝RLT液：從Kit中取出RLT液，用1.5mL離心管分裝，每管500μL（在體系配製區操作）。
2、在生物安全櫃內將采樣液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培養物（雞胚尿囊液或細胞培養液）取100μL加入RLT液管中，充分混勻。 3、每管分別加入5μL β-巰基乙醇，混勻後依次加入600μL 70%的乙醇，充分混勻。
4、從Kit中取出帶濾柱的2mL收集管，打開包裝將其做好標記。取步驟（3）中的混合液600μL加入濾柱中，12000rpm，離心15s，棄收集管中的離心液。
5、濾柱仍放回收集管上，將步驟（3）剩餘的混合液全部吸入濾柱中，12000rpm，離心15s，棄離心液。
6、於濾柱中加入700μL Wash Buffer RW1液，12000rpm，離心15s。
7、從QIAGEN RNeasy Mini Kit中取一支幹凈的2mL收集管，將離心後的濾柱移到新的收集管上，於濾柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，12000rpm，離心15s。
8、棄收集管中的離心液，再於濾柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，13000~14000rpm，離心2min。
9、將濾柱移到一個干凈的1.5mL eppendorf管上，向濾柱中加入30~50μL的Rnase-free Water，室溫靜置1~3min。
10、12000rpm，離心1min，收集離心液即為提取的病毒RNA，立即做實驗或-20℃以下保存。
注意：Buffer RPE使用之間加44mL無水乙醇。
（二）反應體系配製
1、實驗設計： 檢測標本RNA
陰性對照：無菌水（標本RNA提取時，跟標本同時提取無菌水。） 陽性對照：已知病毒RNA

2、PCR反應體系配製（在體系配製區配反應液） 1）按下表加入試劑： PCR反應體系
對每一個建立的反應確定反應數（n=擬進行的PCR管數，包括陰性，陽性對）。考慮到陰性無模板對照，陽性對照，誤差，制備過量的反應混合物是必要的。具體如下：
（1）如果包括對照，樣品的數量（n）為1到14，那麼N=n+1；
（2）如果包括對照，樣品的數量（n）大於15，那麼N=n+2。
2）將上述反應液混勻，分裝到0.2mL PCR小管中，每管20μL，分別做好標記。

3）加RNA模板（在核酸提取區）
將上述分裝好的PCR小管分別加入模板。首先加入陰性對照管（5μL無菌水），然後分別加標本RNA（每管5μL），最後加入陽性對照RNA（每管5μL）。
3、RT-PCR反應
將上述加好模板的反應管混勻，短暫離心後放入PCR儀進行RT-PCR 擴增。

4、RT-PCR產物檢測
1）2.0％瓊脂糖凝膠制備：稱取2.0g Agarose，倒入耐熱玻璃瓶內，再加入電泳液（1×TBE）100mL，輕輕混勻後加熱，使Agarose完全熔化。待Agarose膠溫度降至50～60℃左右，加入核酸染料，輕輕混勻（不要產生氣泡）。待膠溫度降至50℃左右時，將其倒入制膠板，插好電泳梳子。待膠完全凝固（約30～60min）之後，將梳子拔出。
2）將制備好的電泳膠放入電泳槽（帶梳子孔的一端在陰極），倒入電泳液（1×TBE）浸過膠面即可。
3）PCR產物各取10μL，加入2μL上樣緩沖液（6×Loading Buffer），混勻後加入電泳膠孔內（先加Marker（DL－2000）5μL，然後依次加標本PCR產物，再加陰性對照，最後加陽性對照產物）。 4）電泳電壓100V，約30～40min後看結果。 5）將電泳膠放入凝膠成像系統觀察結果並照相。
5、結果判斷。

『貳』 怎樣鑒定RNA

首先RNA是由 戊糖 磷酸基團 鹼基 組成的 所以只要鑒別出這三樣物質就可以了
製得RNA水解液：在粗製RNA中，加入10%硫酸 ，攪拌均勻，加熱，講RNA水解
鑒定：水解液+苔黑酚—FeCl3試劑 然後加熱直到沸騰1分鍾，若呈現墨綠色 說明 含有 戊糖
水解液+氨水+5%硝酸銀溶液，如果出現絮狀嘌呤銀化合物，說明有鹼基存在
水解液+少量濃硝酸+少量鉬酸銨溶液 若呈現淡黃色 說明有磷酸基團存在

『叄』 常用的植物病毒分子檢測診斷技術有哪些

1 RT-PCR技術

RT-PCR是英文Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction的簡寫，中文稱之為反轉錄聚合酶鏈式擴增反應。在反轉錄酶M-MLV或AMV的作用下，以RNA為模板、以20個左右的核苷酸為引物，反轉錄合成cDNA。再以cDNA為模板，兩個3和5端互補寡核苷酸引物，由Taq聚合酶從5→3進行一系列DNA聚合反應，擴增出所需要的目的DNA，可將極微量的靶DNA特異性地擴增上百萬倍，從而大大提高了對DNA分子的分析和檢測能力。

利用PCR技術，可以檢測到單分子核酸或對每10萬個細胞中僅含1個靶核酸分子的樣品。因此，該技術創立至今十年來，迅速地形成為常規的標准程序，為生物科學提供了從微量微生物材料中快速得到大量特定的遺傳物質的實驗手段。PCR在植物病毒的檢測、鑒定和植物病毒的檢疫工作中也將具有重要意義。如果病毒核酸是DNA類型，不需要反轉錄（RT），直接可以進行聚合酶鏈式擴增（PCR）。而大多數植物病毒的核酸類型為RNA，因此，需要先進行反轉錄（RT），再進聚合酶鏈式（PCR）擴增。用1%瓊脂糖和5%聚丙烯醯胺進行電泳，即可檢出擴增片段。

這里以香石竹斑駁病毒為例，介紹RT-PCR檢測香石竹斑駁病毒的實驗技術。

用已知病毒核酸保守序列設計引物，分別提取病、健植物總RNA為模板，進行RT-PCR反應，瓊脂糖或PAGE電泳檢測擴增結果。感病材料會出現特異擴增帶。如香石竹斑駁病毒（Carnation mottle virus，CarMV）。根據該病毒的RNA序列設計引物，P1引物（5′端引物，與CarMV RNA的2516～2538同源）：5′-〔TTA，GTT，TGC，CCC，CGT，TGG，TAA，CC〕-3′。P2引物（3′端互補引物，與CarMV RNA的3100～3124對應）：5′-〔AAG，CGT，CAT，CGT，TGA，ATC，CCA，GAG〕-3′。目標片段大小為608nt。對病健材料進行了RT-PCR，從感病材料中可以擴增出了大約600bp的特異片段，而健康植物無此擴增帶。用此方法可以快速、准確地檢測香石竹斑駁病毒。操作如下：

（1）RNA提取

分別取感病及健康葉片0.2～0.5g，加液氮研成粉末，按1g∶2ml的比例懸浮於RNA抽提緩沖液（20mmol/L Tris-HC1 pH8.0，1mmol/L EDTA，1%SDS，0.2%巰基乙醇）。按1∶1比例加入水飽和苯酸—氯仿—異戊醇（25∶24∶1）混合液，抽提數次，乙醇沉澱總RNA。溶入20～50μl TE緩沖液中，-70℃冰箱保存備用。

（2）cDNA合成反應體系組分為

待檢測材料總RNA或健康材料總RNA各0.5/μg，20pmol/L引物P21μl，5×MMLV緩沖液4μl，ddH2O7μl，該混合液於88℃處理10min後冰上迅速冷卻，然後加入10mmol/L dNTPs 1μl，40U/μl Rnasin 0.5μl，100mmol/L DTT 2μl，200U/μl MMLV逆轉錄酶1μl，混合後經42℃處理lh，合成cDNA。

（3）PCR擴增

取上述的cDNA各0.5μg，分別加入10×PCR緩沖液5μl，20pmol/L引物P1和引物P2各1μl，10mmol/LdNTPs 1μl，88℃10min之內加2U/μl Taq DNA聚合酶1μl，加ddH2O至50/μl。然後在液面上加三滴石蠟油，進行如下PCR熱循環：94℃3min，60℃1min，72℃1min，1次循環；94℃40s、60℃1min，72℃1min，35次循環，最後72℃延伸10min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢查。攜帶CarMV的樣品會出現600bp的特性擴增帶。如圖1。

圖1 CarMV PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳結果