檢驗碳祖的血清學方法是什麼

❶ （人）炭疽病怎麼預防

炭疽（anthrax）出自古希臘「anthrakos」一詞。意思是煤炭。炭疽是炭疽桿菌引起的人畜共患急性傳染病。主要因食草動物接觸土生芽孢而感染所導致的疾病。人類因接觸病畜及其產品或食用病畜的肉類二發生感染。炭疽桿菌從皮膚侵入，引起皮膚炭疽，使皮膚壞死形成焦痂潰瘍與周圍腫脹和毒血症，也可以引起肺炭疽或腸炭疽，均可並發敗血症。炭疽呈全球分布，以溫帶、衛生條件差的地區多發。目前人類炭疽的發病率明顯下降，但炭疽芽孢的毒力強、易獲得、易保存、高潛能、可視性低、容易發送，曾被一些國家作為一種生物武器和恐怖行動。
炭疽桿菌是德國獸醫Davaine在1849年首先發現的。Peur在1881年發現了減毒的芽孢疫苗能預防炭疽，使炭疽成為第一個能用有效菌苗預防的傳染病，Sterne在1939年發現的動物疫苗，直至現在仍在使用。炭疽桿菌為致病菌中最大的革蘭氏陽性桿菌，長5-10μm，寬1-3μm，菌體兩端平削，呈竹節狀長鏈排列，無鞭毛。在體內形成莢膜，在體外可形成芽孢，芽孢呈卵圓形，位於菌體中部。在血瓊脂平板上形成較大而凸起的灰白色不透明菌落，邊緣不規則，如毛發狀，不溶血，在肉湯培養基中生長時呈絮狀沉澱而不混濁。本菌繁殖體對日光、熱和常用消毒劑都很敏感，其芽孢的抵抗力很強，在煮沸10min後仍有部分存活，在乾熱150°C可存活30-60min，在濕熱120°C 40min可被殺死。在5%的石炭酸中可存活20-40天。炭疽桿菌的芽孢可在動物、屍體及其污染的環境和泥土中存活多年。
1.傳染源：主要是草食動物牛、馬、羊、騾、駱駝、豬、犬等受染病畜。食草動物因食入水草中的炭疽桿菌芽孢而感染。人與人的傳播很少。
2.傳播途徑：直接或間接接觸病畜和染菌的皮、毛、肉、骨粉或塗抹染菌的脂肪均可引起皮膚炭疽;吸入帶炭疽桿菌的氣溶膠、塵埃可引起肺炭疽;進食帶菌肉類可引起腸炭疽。其中皮膚接觸病畜及食用病畜肉是炭疽的主要原困。
3.人群易感性：各年齡人群普遍易感，病後免疫力較持久。
4.流行特徵：呈全球性分布，主要在南美洲、東歐、亞洲及非洲地區。我國全年均有發生，多數為散發病例。有職業性，多發於牧民、農民、屠宰與肉類加工和皮毛加工工人以及獸醫等。夏季因皮膚暴露多而較易感染。
潛伏期皮膚炭疽一般1-5天。肺炭疽可短至12小時，可長至12個月;腸炭疽24小時。自然感染炭疽以皮膚炭疽為主，生物恐懼相關炭疽以吸人炭疽為主。
皮膚炭疽
最為多見，約占炭疽病例的95%。分為炭疽癰和惡性水腫。
1.炭疽癰：多見於面、頸、肩、手和腳等裸露部位皮膚，初起為丘疹或斑疹，逐漸形成水皰、潰瘍，最終形成黑色似煤炭的干痂，以痂下有肉芽組織，周圍有非凹陷性水腫，堅實，疼痛不顯著，潰瘍不化膿為其特性。發病1-2天後出現發熱、頭痛、局部淋巴結腫大等。
2.惡性水腫：累及部位多為組織疏鬆的眼瞼、頸、大腿等部位，無黑痂形成而呈大塊水腫，擴散迅速，可致大片壞死。局部可有麻木感及輕度脹痛，全身中毒症狀明顯，如治療不及時，可引起敗血症、肺炎及腦膜炎等並發症。在未使用抗生素的情況下，皮膚炭疽病死率為20%-30%。
肺炭疽
只有少數人會得肺炭疽，臨床上亦較難診斷。肺炭疽多為原發吸入感染，偶有繼發於皮膚炭疽，常形成肺炎。通常起病較急，出現低熱、乾咳、周身疼痛、乏力等流感樣症狀。經2-4天後症狀加重，出現高熱、咳嗽加重、痰呈血性，同時伴胸痛、呼吸困難、發紺和大汗。肺部啰音及喘鳴。Ⅹ線胸片顯示肺縱膈增寬，支氣管肺炎和胸腔積液。患者常並發敗血症、休克、腦膜炎。在出現呼吸困難後1-2天死亡，病死率在8O%-100%。
腸炭疽
臨床上較少見。患者出現劇烈腹痛、腹脹、腹瀉、嘔吐，大便為水樣。重者繼之高熱，血性大便，可出現腹膜刺激征及腹水。並發敗血症，因中毒性休克在發病3-4天死亡，病死率為25%-70%。
其他類型
口咽部感染炭疽，出現嚴重的咽喉疼痛，頸部明顯水腫，局部淋巴結腫大。水腫可壓迫食管引起吞咽困難，壓破氣道可出現呼吸困難。
肺炭疽、腸炭疽及嚴重的皮肽炭疽常引起敗血症。除局部症狀加重外，患者全身中毒症狀加重，並因細菌全身擴散，引起血源性炭疽肺炎、炭疽腦膜炎等嚴重並發症，病情迅速惡化而死亡。病死率幾乎100%。
1.接觸史：有與病畜或其皮毛的密切接觸史。
2.臨床表現：皮膚炭疽的焦痂潰瘍，肺炭疽的出血性肺炎，出血性肺炎，腸炭疽的出血性腸炎，敗血症的嚴重全身毒血症與出血傾向等。
3.確診：需要細菌塗片染色檢查，細菌培養以及動物接種等。
鑒別診斷
皮膚炭疽應同癰、蜂窩組織炎、丹毒、恙蟲病、野兔熱等鑒別;肺炭疽應於大葉性肺炎、肺鼠疫、鉤端螺旋體病等鑒別;腸炭疽應同沙門氏菌腸炎、出血壞死性腸炎及其他急性腹膜炎等鑒別;敗血症應
同其他細菌引起的敗血症鑒別。
輔助檢查
1.血常規：白細胞增高，10*109-25*109/L。甚至可高達60*109-80*109/L。中性粒細胞顯著增多，血小板可減少。
2.細菌塗片與培養：根據臨床表現可分別取分泌物、痰液、大便、血液和腦脊液作直接塗片染色鏡檢，可見粗大的革蘭氏陽性桿菌;培養可有炭疽桿菌生長。
3動物接種：將上述標本接種於家兔、豚鼠與小白鼠皮下，24h後出現局部的典型腫脹、出血等陽性反應。接種動物大多於48h內死亡，從其血液與組織中可查出和培養出炭疽桿菌。
4.血清免疫學檢查：有間接血凝試驗，補體結合試驗、免疫熒光法與ELISA法等檢測血中抗莢膜抗體。炭疽患者發病後3天開始產生此抗體，1周後大多呈陽性。恢復期血清抗體較急性期增加4倍以上，即為陽性。EⅡSA、免疫熒光法敏感性和特異性較高，陽性率達80%-I00%。Ascoli沉澱實驗主要用於檢驗動物毛與臟器是否染菌。
炭疽治療原則是嚴格隔離，早診斷，早治療，殺滅機體內細菌。
給予高熱量流質或半流質飲食，必要時靜脈補液。嚴重病例可用激素緩解中毒症狀，一般用氫化可的松100-300mg/d，短期靜脈滴注，但必須同時應用抗生素;對於皮膚炭疽者的局部傷口切忌擠壓及切開引流，否則會引起感染擴散和敗血症，可用1:5000的高錳酸鉀液濕敷，或以1:2000的高錳酸鉀液沖洗後，敷以抗菌軟膏(如紅黴素軟膏)，再用消毒紗布包紮。肺炭疽、頸部皮膚炭疽病病人，應注意保持呼吸道通暢;嚴重者輸血治療。循環衰竭者應在補充血容量的基礎上給予休克治療。
炭疽桿菌對青黴素敏感，臨床作為首選用葯。一般首選青黴素G，孕婦只能使用青黴素，老年人首選多西環素(強力黴素)。青黴素用量:皮膚炭疽240萬-320萬U，分3-4次肌肉注射，療程7-1o天;惡性水腫800萬-1000萬U，分3或4次靜滴，療程2周以上;其他型炭疽1000萬-2000萬U，靜脈滴注，並可合用氨基糖苷類葯物，療程2-3周。青黴素過敏者，可用氯黴素2g，分3次或4次口服。多西環素0.2-0.3g，分2或3次口服。環丙沙星0.5g，每天2次口服(兒童禁用)。紅黴素1.5g，分3次或4次口服。對於恐怖相關炭疽患者，因病情較重、病死率較高，可選用環丙沙星、氨苄西林等聯合用葯治療。先靜脈給予環丙沙星400mg/12h或多西環素100mg/12h，病情穩定後可口服環丙沙星每次500mg，每日2次，或多西環素每次100mg，每日2次，療程60天。
5.炭疽皮膚試驗：用減毒株的化學提取物皮下注射，症狀出現2-3天後，82%的患者出現陽性結果，4周後達99%。
隔離：炭疽病病人應該嚴格隔離至痊癒，其分泌物、排泄物及其污染的物品與場所，均應按殺滅芽孢的消毒方法進行徹底消毒，不可隨意丟棄。患病或病死動物應焚燒或深埋，嚴禁食用。
檢疫與防護：加強對炭疽病的檢疫，防止在動物問傳播。小量實驗操作可用2級生物專櫃，若操作量較大則應用3級生物專櫃。當懷疑有炭疽桿菌氣溶膠廣生時，除一般個人防護外，還I訌佩帶眼罩和呼吸器。戰時，個人應穿防護服、戴防毒面具和防疫口罩;無防護器材時，可用手帕或其他紡織品捂住口鼻，並扎緊袖冂和褲腳，將上衣塞入褲腰，頸部用毛巾圍好，戴手套，外穿雨衣。集體防護可構築工事或利用地形地物等。
疫苗接種：對有關人員接種疫苗。目前採用皮膚劃痕法，每次疫苗用量0.1mL；國外多採用保護性抗原肌注。對密切接觸者應進行醫學觀察8天，必要時盡早進行葯物治療。當前的疫苗具有效力不穩定、對吸人性炭疽的保護率低、免疫程序繁瑣、存在副作用等缺點。近年來人們在改造傳統疫苗的同時又有一些新的發現，如保護性抗原(PA)的抗體，在體內可殺死芽孢;通過黏膜免疫能夠誘導機體分泌IgA抗體；抗多聚谷氨酸（γ-D-GA)抗體可以同炭疽桿菌的繁殖體作用，從而殺死繁殖體，尋找到新的免疫原。DNA疫苗、活載體疫苗的出現為新一代安全、免疫程序簡單、具更高保護率的疫苗奠定了基礎。
炭疽恐懼症的預防：首先，應加強部隊對炭疽桿菌等生物武器襲擊的防護措施訓練，保證部隊在戰時或重大事件後能夠及時採取有效措施，減少傷亡;其次要增強部隊的凝聚力，提倡團結協作、互相關心和奉獻精神，鼓舞官兵鬥志，堅定必勝信心，從而增強對戰時各種威脅的心理承受力，減少恐懼症的發生;第三，平時加強對部隊的科普宣傳，在官兵中普及炭疽桿菌等生物武器的知識及其基本醫學防護知識，以減少恐懼心理。
病人因傷口滲液多, 而腸炭疽病人又不能進食, 因此造成蛋白質的大量丟失。在使用抗生素的同時給予患者補充氨基酸、白蛋白。待病情緩解後, 進食高蛋白容易消化之軟食以補充丟失的蛋白質, 增加病人的抵抗力。不能進食者可鼻飼高蛋白易消化流質飲食。
1.應做好傷口的處理, 避免其分泌物的污染。局部可用 1 2000高錳酸鉀液濕敷並用消毒紗布覆蓋,或塗 1%龍膽紫液。更換病人所有的用物包括衣、褲及傷口敷料, 將更換下來的用物焚毀, 以避免擴散。
2.一般護理: 患者大部分來自邊遠牧區, 語言不通, 衛生條件差, 患者單間病房隔離, 並向患者及家屬講解此病的危害性, 傳播途徑及隔離、預防措施, 以及排泄物、分泌物的處理, 避免因缺乏衛生知識造成其他部位的感染。
3.心理護理: 因患者來自牧區, 生活習慣上的差異, 保健意識淡漠加上語言不通, 經醫護人員講解, 對該病有一定的認識, 同時對該病也產生了恐懼、失望心理, 甚至拒絕治療。針對這些心理因素, 醫護人員應耐心細致地做好每一次治療護理工作。
4.密切觀察病情變化: 密切觀察生命體征的變化, 防止感染性休克的發生, 是治療炭疽病的關鍵。
5.房間床、桌、椅 用的福爾馬林液煮蒸消毒。隔日 1 次, 連續 3 次, 再用漂白粉液擦洗後作細菌培養確定無炭疽桿菌存在空氣時, 方可安置其他人。
畜牧業生產地區為炭疽的多發區。因此，首先做好預防工作是控制和減少炭疽發生的重點。其次應加強宣傳，提高人民群眾對此病的認識，意識到其危害性，進而自覺預防此病發生。第三、畜牧部加強畜間檢疫，並協同做好人畜預防接種，提高人群免疫力。第四、醫護人員應提高對此病的診治水平，做到早診斷、早治療，從而減少此病的誤診、漏診，有一定現實意義。
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❷ 肺炭疽的檢查

1.實驗室檢查
（1）周圍血象 白細胞計數和中性粒細胞增高，可有類白血病反應。
（2）病原學檢查 取患者的病灶性滲出物、痰液、分泌物、血及腦脊液等作塗片或培養，可發現病原菌。可作莢膜染色，特異性熒光抗體染色以進一步鑒定，上述檢材可培養或接種於豚鼠等動物的皮下組織分離炭疽桿菌。
（3）血清學 酶聯免疫吸附測定傳統阿斯可里沉澱試驗敏感性和特異性都不高。間接免疫熒光法熒光抗體檢測有較高的敏感性、特異性。
2.其他輔助檢查
X線表現除顯示肺炎外，胸腔積液，典型表現為縱隔增寬。

❸ 炭疽病的檢查

1.周圍血象
白細胞總數大多增高（10～20）×109/L，少數可高達（60～80）×109/L，分類以中性粒細胞為高。
2.塗片檢查
取水皰內容物、病灶滲出物、分泌物、痰液、嘔吐物、糞便、血液及腦脊液等作塗片，可發現病原菌，塗片中發現病原菌時可作革蘭或莢膜染色，亦可作各種特異性熒光抗體（抗菌體，抗莢膜、抗芽胞、抗噬菌體等）染色檢查。
3.培養
檢材應分別接種於血瓊脂平板、普通瓊脂平板、碳酸氫鈉平板。血標本應事先增菌培養。如見可疑菌落，則根據生物學特徵及動物試驗進行鑒定，如青黴素串珠和抑制試驗、噬菌體裂解試驗等。
4.動物接種
取患者的分泌物、組織液或所獲得的純培養物接種於小白鼠或豚鼠等動物的皮下組織，如注射局部處於24小時出現典型水腫，動物大多於36～48小時內死亡，在動物內臟和血液中有大量具有莢膜的炭疽桿菌存在。
5.鑒定試驗
用以區別炭疽桿菌與各種類炭疽桿菌（枯草桿菌、蠟樣桿菌、蕈狀桿菌、嗜熱桿菌等），主要有串珠濕片法、特異性熒光抗體（抗菌體、抗莢膜、抗芽胞、抗噬菌體等）染色法，W噬菌體裂解試驗、碳酸氫鈉瓊脂平板CO2培養法、青黴素抑制試驗、動物致病試驗、莢膜腫脹試驗、動力試驗、溶血試驗、水楊酸苷發酵試驗等。
6.免疫學試驗
有間接血凝法，ELISA（酶聯免疫吸附實驗）法、酶標-SPA法、熒光免疫法等，用以檢測血清中的各種抗體，特別是莢膜抗體及血清抗毒性抗體，一般用於回顧性診斷和流行病學調查之用。阿斯可里沉澱試驗，對已腐敗或乾涸的標本，作細菌培養有困難時可採用本試驗。如患者、病畜的病灶痂皮、屍體組織及血液、染菌的皮毛及其製品等標本，加水經煮沸或高壓提出抗原成分與炭疽沉澱素血清作環狀沉澱試驗，以間接證明有無炭疽桿菌感染，但本法常出現一些假陽性，對其結果判定應慎重。

❹ 如何防治炭疽

炭疽是一種人畜共患傳染病，以急性、發熱、敗血為特徵，牛易發，一年四季均可發生，以夏季多雨季節和洪泛地區最易發生。

病原

本病的病原為炭疽桿菌。菌體粗大，為革蘭氏陽性菌，呈長鏈或短鏈狀排列，菌體兩端平齊，呈竹節狀。

牛可通過消化道、呼吸道、皮膚外傷、黏膜或昆蟲叮咬等多種途徑感染，但主要是通過被污染的飼料、飲水，由消化道侵入感染。在發生過炭疽的地區，炭疽桿菌芽孢在土壤中可以生存數月至數年。病牛的分泌物、排泄物和天然孔道流出的血液中含有大量病菌，是危險的傳染源，因此本病的屍體應嚴禁焚燒或深埋，禁止剖檢，必要時應嚴密消毒後進行屍檢。

症狀

潛伏期1～3天，有的長達14天。根據臨床症狀和病程可分為以下幾種類型。

（1）最急性

病畜突然倒地，像抽風一樣昏迷不醒，呼吸困難，從嘴和鼻流出泡沫，有時泡沫帶血，可視黏膜藍紫色，天然孔道流出煤焦油樣血液，舌頭變成黑紫色，常在1小時左右死亡。最急性型炭疽多見於流行初期。

（2）急性

病牛發熱，體溫升高到40～42℃，並伴發寒戰、食慾減退，最後出現瘤胃臌氣，反芻停止，先便秘後腹瀉，糞便帶血，或伴有腹痛症狀。尿暗黃色，有時混有血液。可視黏膜呈藍紫色，間有小出血點，呼吸極度困難。一般1～2天死亡，死亡率可達80%。

（3）亞急性

病牛症狀與急性相似，僅病情緩和些，往往在其頸下、胸前、肩胛、腹下、等處發生腫脹，初期硬固有熱痛，逐漸變冷而無痛感。

（4）慢性型

為數甚少，僅表現進行性消瘦，並長達2～3個月。

診斷及治療

為防止屍體內的炭疽桿菌形成芽孢，污染土壤形成永久性疫源地，在一般情況下對炭疽病牛禁止解剖，故確診應以細菌學檢驗和血清學診斷為基礎。病牛屍體迅速腐敗、膨脹，屍僵不全，天然孔出血，血液不易凝固，呈煤焦油樣，皮下及漿膜下有出血性膠樣浸潤，脾臟明顯腫大、松軟，呈黑紅色。

治療可用以下方法：

（1）牛每次皮下或靜脈注射抗炭疽血清100～250毫升。

（2）每千克體重肌肉注射青黴素100萬～300萬國際單位，每日注射4次，連用3天可見效。

（3）如能結合用抗炭疽血清效果更好。也可選用其他抗生素或磺胺類葯物。

預防措施

（1）炭疽桿菌在適宜的溫度下能在體外形成芽孢，在形成芽孢前抵抗力不強，一般的常用消毒葯都能在短時間內將其殺死，在腐敗環境中很快死亡；形成芽孢後具有很強的抵抗力，在土壤中能存活數十年，在皮毛和水中能存活4～5年，煮沸需15～25分鍾才能殺死，但碘溶液、過氧乙酸、高錳酸鉀及漂白粉對芽孢的殺傷力較強，所以臨床上常用10%漂白粉、0.1%碘溶液、0.5%過氧乙酸作為消毒劑。

（2）炭疽常發地區在春季或秋季要進行預防注射，可用炭疽芽孢Ⅱ號苗，大小牛一律皮下注射1毫升或皮內注射0.2毫升。注射14天產生免疫力，免疫期為一年。

（3）可用無毒炭疽芽孢苗，一歲以上牛皮下注射1毫升，1歲以下小牛0.5毫升，注射後14天產生免疫力，免疫期為一年。

（4）發生炭疽後要立即封鎖，禁止家畜外運、外出，禁止畜產品運出，嚴禁解剖炭疽和可疑炭疽病屍，屍體要深埋，最好焚毀。疫點內的牛先用青黴素預防，7天後再接種炭疽芽孢苗。疫區周圍的健康牛也要緊急接種炭疽芽孢苗。

❺ 我懷疑我得了炭疽病

以下是炭疽病毒的各種狀況、治療方法和來源等反應：
炭疽（anthrax）出自古希臘「anthrakos」一詞。意思是煤炭。炭疽是炭疽桿菌引起的人畜共患急性傳染病。主要因食草動物接觸土生芽孢而感染所導致的疾病。人類因接觸病畜及其產品或食用病畜的肉類二發生感染。炭疽桿菌從皮膚侵入，引起皮膚炭疽，使皮膚壞死形成焦痂潰瘍與周圍腫脹和毒血症，也可以引起肺炭疽或腸炭疽，均可並發敗血症。炭疽呈全球分布，以溫帶、衛生條件差的地區多發。目前人類炭疽的發病率明顯下降，但炭疽芽孢的毒力強、易獲得、易保存、高潛能、可視性低、容易發送，曾被一些國家作為一種生物武器和恐怖行動。
炭疽桿菌是德國獸醫Davaine在1849年首先發現的。Peur在1881年發現了減毒的芽孢疫苗能預防炭疽，使炭疽成為第一個能用有效菌苗預防的傳染病，Sterne在1939年發現的動物疫苗，直至現在仍在使用。炭疽桿菌為致病菌中最大的革蘭氏陽性桿菌，長5-10μm，寬1-3μm，菌體兩端平削，呈竹節狀長鏈排列，無鞭毛。在體內形成莢膜，在體外可形成芽孢，芽孢呈卵圓形，位於菌體中部。在血瓊脂平板上形成較大而凸起的灰白色不透明菌落，邊緣不規則，如毛發狀，不溶血，在肉湯培養基中生長時呈絮狀沉澱而不混濁。本菌繁殖體對日光、熱和常用消毒劑都很敏感，其芽孢的抵抗力很強，在煮沸10min後仍有部分存活，在乾熱150°C可存活30-60min，在濕熱120°C 40min可被殺死。在5%的石炭酸中可存活20-40天。炭疽桿菌的芽孢可在動物、屍體及其污染的環境和泥土中存活多年。
1.傳染源：主要是草食動物牛、馬、羊、騾、駱駝、豬、犬等受染病畜。食草動物因食入水草中的炭疽桿菌芽孢而感染。人與人的傳播很少。
2.傳播途徑：直接或間接接觸病畜和染菌的皮、毛、肉、骨粉或塗抹染菌的脂肪均可引起皮膚炭疽;吸入帶炭疽桿菌的氣溶膠、塵埃可引起肺炭疽;進食帶菌肉類可引起腸炭疽。其中皮膚接觸病畜及食用病畜肉是炭疽的主要原困。
3.人群易感性：各年齡人群普遍易感，病後免疫力較持久。
4.流行特徵：呈全球性分布，主要在南美洲、東歐、亞洲及非洲地區。我國全年均有發生，多數為散發病例。有職業性，多發於牧民、農民、屠宰與肉類加工和皮毛加工工人以及獸醫等。夏季因皮膚暴露多而較易感染。
潛伏期皮膚炭疽一般1-5天。肺炭疽可短至12小時，可長至12個月;腸炭疽24小時。自然感染炭疽以皮膚炭疽為主，生物恐懼相關炭疽以吸人炭疽為主。
皮膚炭疽
最為多見，約占炭疽病例的95%。分為炭疽癰和惡性水腫。
1.炭疽癰：多見於面、頸、肩、手和腳等裸露部位皮膚，初起為丘疹或斑疹，逐漸形成水皰、潰瘍，最終形成黑色似煤炭的干痂，以痂下有肉芽組織，周圍有非凹陷性水腫，堅實，疼痛不顯著，潰瘍不化膿為其特性。發病1-2天後出現發熱、頭痛、局部淋巴結腫大等。
2.惡性水腫：累及部位多為組織疏鬆的眼瞼、頸、大腿等部位，無黑痂形成而呈大塊水腫，擴散迅速，可致大片壞死。局部可有麻木感及輕度脹痛，全身中毒症狀明顯，如治療不及時，可引起敗血症、肺炎及腦膜炎等並發症。在未使用抗生素的情況下，皮膚炭疽病死率為20%-30%。
肺炭疽
只有少數人會得肺炭疽，臨床上亦較難診斷。肺炭疽多為原發吸入感染，偶有繼發於皮膚炭疽，常形成肺炎。通常起病較急，出現低熱、乾咳、周身疼痛、乏力等流感樣症狀。經2-4天後症狀加重，出現高熱、咳嗽加重、痰呈血性，同時伴胸痛、呼吸困難、發紺和大汗。肺部啰音及喘鳴。Ⅹ線胸片顯示肺縱膈增寬，支氣管肺炎和胸腔積液。患者常並發敗血症、休克、腦膜炎。在出現呼吸困難後1-2天死亡，病死率在8O%-100%。
腸炭疽
臨床上較少見。患者出現劇烈腹痛、腹脹、腹瀉、嘔吐，大便為水樣。重者繼之高熱，血性大便，可出現腹膜刺激征及腹水。並發敗血症，因中毒性休克在發病3-4天死亡，病死率為25%-70%。
其他類型
口咽部感染炭疽，出現嚴重的咽喉疼痛，頸部明顯水腫，局部淋巴結腫大。水腫可壓迫食管引起吞咽困難，壓破氣道可出現呼吸困難。
肺炭疽、腸炭疽及嚴重的皮肽炭疽常引起敗血症。除局部症狀加重外，患者全身中毒症狀加重，並因細菌全身擴散，引起血源性炭疽肺炎、炭疽腦膜炎等嚴重並發症，病情迅速惡化而死亡。病死率幾乎100%。
1.接觸史：有與病畜或其皮毛的密切接觸史。
2.臨床表現：皮膚炭疽的焦痂潰瘍，肺炭疽的出血性肺炎，出血性肺炎，腸炭疽的出血性腸炎，敗血症的嚴重全身毒血症與出血傾向等。
3.確診：需要細菌塗片染色檢查，細菌培養以及動物接種等。
鑒別診斷
皮膚炭疽應同癰、蜂窩組織炎、丹毒、恙蟲病、野兔熱等鑒別;肺炭疽應於大葉性肺炎、肺鼠疫、鉤端螺旋體病等鑒別;腸炭疽應同沙門氏菌腸炎、出血壞死性腸炎及其他急性腹膜炎等鑒別;敗血症應
同其他細菌引起的敗血症鑒別。
輔助檢查
1.血常規：白細胞增高，10*109-25*109/L。甚至可高達60*109-80*109/L。中性粒細胞顯著增多，血小板可減少。
2.細菌塗片與培養：根據臨床表現可分別取分泌物、痰液、大便、血液和腦脊液作直接塗片染色鏡檢，可見粗大的革蘭氏陽性桿菌;培養可有炭疽桿菌生長。
3動物接種：將上述標本接種於家兔、豚鼠與小白鼠皮下，24h後出現局部的典型腫脹、出血等陽性反應。接種動物大多於48h內死亡，從其血液與組織中可查出和培養出炭疽桿菌。
4.血清免疫學檢查：有間接血凝試驗，補體結合試驗、免疫熒光法與ELISA法等檢測血中抗莢膜抗體。炭疽患者發病後3天開始產生此抗體，1周後大多呈陽性。恢復期血清抗體較急性期增加4倍以上，即為陽性。EⅡSA、免疫熒光法敏感性和特異性較高，陽性率達80%-I00%。Ascoli沉澱實驗主要用於檢驗動物毛與臟器是否染菌。
炭疽治療原則是嚴格隔離，早診斷，早治療，殺滅機體內細菌。
給予高熱量流質或半流質飲食，必要時靜脈補液。嚴重病例可用激素緩解中毒症狀，一般用氫化可的松100-300mg/d，短期靜脈滴注，但必須同時應用抗生素;對於皮膚炭疽者的局部傷口切忌擠壓及切開引流，否則會引起感染擴散和敗血症，可用1:5000的高錳酸鉀液濕敷，或以1:2000的高錳酸鉀液沖洗後，敷以抗菌軟膏(如紅黴素軟膏)，再用消毒紗布包紮。肺炭疽、頸部皮膚炭疽病病人，應注意保持呼吸道通暢;嚴重者輸血治療。循環衰竭者應在補充血容量的基礎上給予休克治療。
炭疽桿菌對青黴素敏感，臨床作為首選用葯。一般首選青黴素G，孕婦只能使用青黴素，老年人首選多西環素(強力黴素)。青黴素用量:皮膚炭疽240萬-320萬U，分3-4次肌肉注射，療程7-1o天;惡性水腫800萬-1000萬U，分3或4次靜滴，療程2周以上;其他型炭疽1000萬-2000萬U，靜脈滴注，並可合用氨基糖苷類葯物，療程2-3周。青黴素過敏者，可用氯黴素2g，分3次或4次口服。多西環素0.2-0.3g，分2或3次口服。環丙沙星0.5g，每天2次口服(兒童禁用)。紅黴素1.5g，分3次或4次口服。對於恐怖相關炭疽患者，因病情較重、病死率較高，可選用環丙沙星、氨苄西林等聯合用葯治療。先靜脈給予環丙沙星400mg/12h或多西環素100mg/12h，病情穩定後可口服環丙沙星每次500mg，每日2次，或多西環素每次100mg，每日2次，療程60天。
5.炭疽皮膚試驗：用減毒株的化學提取物皮下注射，症狀出現2-3天後，82%的患者出現陽性結果，4周後達99%。
隔離：炭疽病病人應該嚴格隔離至痊癒，其分泌物、排泄物及其污染的物品與場所，均應按殺滅芽孢的消毒方法進行徹底消毒，不可隨意丟棄。患病或病死動物應焚燒或深埋，嚴禁食用。
檢疫與防護：加強對炭疽病的檢疫，防止在動物問傳播。小量實驗操作可用2級生物專櫃，若操作量較大則應用3級生物專櫃。當懷疑有炭疽桿菌氣溶膠廣生時，除一般個人防護外，還I訌佩帶眼罩和呼吸器。戰時，個人應穿防護服、戴防毒面具和防疫口罩;無防護器材時，可用手帕或其他紡織品捂住口鼻，並扎緊袖冂和褲腳，將上衣塞入褲腰，頸部用毛巾圍好，戴手套，外穿雨衣。集體防護可構築工事或利用地形地物等。
疫苗接種：對有關人員接種疫苗。目前採用皮膚劃痕法，每次疫苗用量0.1mL；國外多採用保護性抗原肌注。對密切接觸者應進行醫學觀察8天，必要時盡早進行葯物治療。當前的疫苗具有效力不穩定、對吸人性炭疽的保護率低、免疫程序繁瑣、存在副作用等缺點。近年來人們在改造傳統疫苗的同時又有一些新的發現，如保護性抗原(PA)的抗體，在體內可殺死芽孢;通過黏膜免疫能夠誘導機體分泌IgA抗體；抗多聚谷氨酸（γ-D-GA)抗體可以同炭疽桿菌的繁殖體作用，從而殺死繁殖體，尋找到新的免疫原。DNA疫苗、活載體疫苗的出現為新一代安全、免疫程序簡單、具更高保護率的疫苗奠定了基礎。
炭疽恐懼症的預防：首先，應加強部隊對炭疽桿菌等生物武器襲擊的防護措施訓練，保證部隊在戰時或重大事件後能夠及時採取有效措施，減少傷亡;其次要增強部隊的凝聚力，提倡團結協作、互相關心和奉獻精神，鼓舞官兵鬥志，堅定必勝信心，從而增強對戰時各種威脅的心理承受力，減少恐懼症的發生;第三，平時加強對部隊的科普宣傳，在官兵中普及炭疽桿菌等生物武器的知識及其基本醫學防護知識，以減少恐懼心理。
病人因傷口滲液多, 而腸炭疽病人又不能進食, 因此造成蛋白質的大量丟失。在使用抗生素的同時給予患者補充氨基酸、白蛋白。待病情緩解後, 進食高蛋白容易消化之軟食以補充丟失的蛋白質, 增加病人的抵抗力。不能進食者可鼻飼高蛋白易消化流質飲食。
1.應做好傷口的處理, 避免其分泌物的污染。局部可用 1 2000高錳酸鉀液濕敷並用消毒紗布覆蓋,或塗 1%龍膽紫液。更換病人所有的用物包括衣、褲及傷口敷料, 將更換下來的用物焚毀, 以避免擴散。
2.一般護理: 患者大部分來自邊遠牧區, 語言不通, 衛生條件差, 患者單間病房隔離, 並向患者及家屬講解此病的危害性, 傳播途徑及隔離、預防措施, 以及排泄物、分泌物的處理, 避免因缺乏衛生知識造成其他部位的感染。
3.心理護理: 因患者來自牧區, 生活習慣上的差異, 保健意識淡漠加上語言不通, 經醫護人員講解, 對該病有一定的認識, 同時對該病也產生了恐懼、失望心理, 甚至拒絕治療。針對這些心理因素, 醫護人員應耐心細致地做好每一次治療護理工作。
4.密切觀察病情變化: 密切觀察生命體征的變化, 防止感染性休克的發生, 是治療炭疽病的關鍵。
5.房間床、桌、椅 用的福爾馬林液煮蒸消毒。隔日 1 次, 連續 3 次, 再用漂白粉液擦洗後作細菌培養確定無炭疽桿菌存在空氣時, 方可安置其他人。
畜牧業生產地區為炭疽的多發區。因此，首先做好預防工作是控制和減少炭疽發生的重點。其次應加強宣傳，提高人民群眾對此病的認識，意識到其危害性，進而自覺預防此病發生。第三、畜牧部加強畜間檢疫，並協同做好人畜預防接種，提高人群免疫力。第四、醫護人員應提高對此病的診治水平，做到早診斷、早治療，從而減少此病的誤診、漏診，有一定現實意義。
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❻ 敘述炭疽桿菌的微生物學診斷方法

炭疽的微生物學檢查
1、標本的採集：分泌物、痰、血液、糞便、嘔吐物、腦脊液等，嚴禁宰殺解剖死畜。
2、標本的處理：液體標本取沉渣分離培養；固體標本用生理鹽水浸泡，水浴殺死非芽胞菌；血液、臟器、滲出液增菌或直接分離培養。
3、塗片染色：革蘭陽性大桿菌、竹節狀排列、有明顯莢膜和芽胞—初步報告。莢膜熒光抗體染色或莢膜腫脹試驗
4、核酸檢測：核酸雜交
5、分離培養：BAP或戊烷脒多粘菌素B等選擇性培養基。 2%兔血清肉湯增菌→分離培養
6、鑒定試驗：
①串珠試驗：接種於含青黴素(0.05～0.5U/ml)的肉湯中，37℃培養6h，形成大而均勻成串的圓球狀菌體，與青黴素抑制細菌細胞壁合成有關，類炭疽無此現象。
②青黴素抑制試驗：接種於含青黴素5、10、100U/ml瓊脂平板，37℃培養24h。後兩者不生長，前者生長。
③串珠和青黴素抑制聯合試驗
7、其他試驗
①噬菌體裂解試驗：AP631炭疽噬菌體
②NaHCO3毒力試驗：接種於含0.5%NaHCO3和10%馬血清的平板，10%CO2、37℃、24～48h，有毒株形成莢膜 — 黏液型菌落，無毒株不形成莢膜 — 粗糙型菌落
③毒素動物試驗：小鼠、家兔或豚鼠皮下接種
④植物凝集素試驗：熒光或酶標記PHA與菌體多糖反應
⑤Ascoli 熱沉澱試驗：可作追溯性診斷

❼ Ascoli沉澱實驗是怎樣的

vAscoli試驗（炭疽熱沉澱反應）：
炭疽桿菌菌體多糖抗原能耐熱、耐腐敗，對於不適合進行炭疽芽胞桿菌培養的陳舊標本或已腐敗的屍體臟器標本，經長時間煮沸，仍可與相應免疫血清(抗體)發生沉澱反應。
常用於皮革檢疫。

❽ 植物病毒檢測的血清學技術都有哪些

植物病毒的外殼是一種核蛋白，在蛋白的表面帶有抗原決定簇，當植物病毒進入動物體內時，即可產生與抗原相應的抗體，這種帶有抗體的血清即為抗血清。相應的抗原抗體之間可產生專化性的結合，即抗體只能與其相應的抗原結合並產生一定的反應，此即血清反應。這種反應在植物體外也能進行，根據這種反應可以測定兩種病毒間的關系。因而，血清學檢測成為植物病毒的重要鑒定技術。常見的血清反應主要有以下幾種：

中和反應：使含有植物病毒的汁液與相應抗血清中的抗體充分結合，當抗體過量時，可將所有植物病毒抗原全部吸收掉，此時因植物病毒汁液中已沒有病毒粒子存在而失去侵染性。此即為中和反應，不僅可對植物病毒進行定性，還可用於定量測定。

沉澱反應：將一系列稀釋度的抗原（病毒）和一系列稀釋的抗體（抗血清）分別混合，在兩者稀釋比例適宜范圍內可出現沉澱物，此即為沉澱反應。此類反應如：微量沉澱反應，瓊脂雙擴散反應，及免疫電泳等，都是在植物病毒檢驗中最常見的血清學技術。

凝集反應：把病毒的抗體先吸於一種與免疫無關的顆粒表面，然後使其與相應的抗原結合而出現的凝集，即為凝集反應。常用於吸附抗體的顆粒有皂土、乳膠、炭末、血細胞、A蛋白等。

抗體標記：對抗體用熒光素、酶或同位素等進行標記，然後通過對標記物的檢測追蹤抗原，常用的有酶聯免疫吸附、熒光免疫、同位素免疫實驗等，這類檢測技術靈敏度極高，適於對微量抗原的檢測。

現將在植物檢疫中常用的幾種血清學技術介紹於下。

1.微量沉澱反應

在溶有抗原的溶液內按適當比例加入抗血清時，抗原與抗體互相結合而沉澱。其方法如下：

（1）用蠟筆在培養皿底部各劃8條橫豎線形成方格。

（2）取兩排小試驗管，每排7～8個，一排用於抗原，一排用於抗血清，每試管中加0.2ml的緩沖液。

（3）制備1mg/ml純化病毒原液，在抗原稀釋排中加0.2ml原液於第一試管，用1ml的移液管再從中吸0.2ml移至第二管，然後再移0.2ml於第三管，一直移到最後一管，各管的稀釋度分別為原液的1/2至1/128。

（4）在小試管中加1.5ml含0.025%防腐劑NaN3的緩沖液，在緩沖液內混入0.1ml未稀釋的抗血清，制備出1/16稀釋度的抗血清作為原液；在第二排的第一試管中加0.2ml的原液，混合後移0.2ml至第二管，如此一直到最後一管，制備出1/32～1/2048的稀釋系列的抗血清。

（5）用微量移液管從抗血清最高稀釋度（1/2048）開始，在培養皿的第七橫排的每個方格滴加1滴，同樣將1/1024稀釋度的抗血清加到第六橫排，這樣將板上所有的方格均滴加各種稀釋度的抗血清。

（6）用另一移液管從最稀的抗原液開始，在第七縱排每方格內滴加1滴，按同樣方法在第一至第七縱排各方格內滴加各種稀釋度的抗原。在所有第八橫排和縱排的方格內滴一滴緩沖液做對照。隨後在反應液滴上復蓋一層液體石蠟油防止蒸發。

（7）將制備好的培養皿在室溫濕潤環境下孵育2h後，在暗室用雙目解剖鏡觀察，然後在普通冰箱內過夜，第二天繼續觀察結果，此時沉澱已清晰可見。

以最濃的沉澱為四，以下逐漸減弱的梯度分別記為三、二、一，以三為抗原最大稀釋度和產生沉澱的最小血清用量，作為抗原抗體最適比例

微量沉澱技術測定抗原抗體最適反應濃度表

（8）實際測定時，用最適稀釋度的抗血清與其相應的抗原和異種抗原進行反應，或用最適稀釋度的抗原與其相應的抗血清和異種抗血清進行反應，均可觀察它們間的血清學關系。如表0-4-2所示，

微量沉澱技術測定多種抗原間血清學關系表

各供試抗原的稀釋度為1.56mg/ml，與1/4至1/1024的不同稀釋度的抗血清反應結果表明，第一、二、五、六、七橫排的抗原與抗血清的相應抗原是相同的，第三、四兩排抗原與抗血清的相應抗原雖然不同，但有一定親緣關系，第八、十排抗原則與抗血清的相應抗原有遠緣關系或無血清學關系，第九排的抗原則完全無關。

2.瓊脂雙擴散試驗

瓊脂凝膠的含水量極高，允許分子質量20萬u以下的大分子物質自由通過，絕大多數的抗原和抗體分子質量都在20萬u以下，在瓊脂凝膠中的運動所受阻力甚小，可自由擴散，免疫雙擴散就是應用這一原理，在一塊瓊脂凝膠板上打幾個小孔，分別置入抗原及其相應抗體，抗原與抗體分別向凝膠中擴散，形成濃度梯度，在抗原抗體濃度最適比例處，形成肉眼可見的抗原抗體結合物的沉澱帶，帶的大小形狀數量和密度決定於所測試的抗原抗體的特性。本法適於檢測植物粗汁液、澄清液和高度純化的抗原。試驗時需設置健康植物汁液及標准抗原作為陰性和陽性對照。本法的特點是可同時檢測一種抗原對多種抗體，或一種抗體對多種抗原間的血清學關系，對病毒的鑒別極為方便。缺點是靈敏度較低，抗血清用量大，檢測時間長。具體檢測技術如下：

（1）稱取瓊脂加入適當的緩沖液中，用水浴或微波爐加熱至瓊脂溶解，按0.1%加疊氮化鈉。置培養皿或玻璃平板於水平檯面，當瓊脂冷卻至60℃時，倒適當量於板上厚2mm（50mm*9mm的板需9ml，100mm*13mm的板需26ml）。靜置至凝固。

（2）將模式圖置於板下，用打孔器打孔，挑除孔中瓊脂，孔的排列有多種形式，常用的排列，由一個中央孔和周圍六個孔組成，孔的直徑7mm，周圍孔與中央孔的距離為3～4mm。

（3）用緩沖液或生理食鹽水在小試管中稀釋抗原，在周圍孔中加最適稀釋度的抗原，在中央孔中加最適稀釋度的抗血清。外圍孔中加倍比稀釋系列的抗原，中央孔加倍比稀釋系列的抗血清，產生緻密狹窄的沉澱線的組合為最適濃度。

（4）將培養皿在保濕環境下進行孵育，次日在暗背景下觀察沉澱線出現情況。在印有排列模式團的紙上，圖記沉澱線的形式，沉澱線圖形可用照相或染色保留。

（5）結果的判斷：根據沉澱線的形狀分析抗原與抗體，及抗原互相間的關系。

對長形病毒進行瓊脂雙擴散檢測時，可在瓊凝膠介質中加入十二烷基磺酸鈉（SDS），此劑為一種陽離子表面活性劑，可將病毒裂解成具有抗原活性的可擴散的片斷利於檢測。

3.對流免疫電泳

在以瓊脂凝膠為介質的情況下，免疫球蛋白帶有微弱負電荷不能抵消電滲作用，故在電泳時向負極遷移，而一般抗原蛋白帶有較強的負電荷，抵消電滲後仍向正極遷移。依此設計的對流免疫電泳是將瓊脂電泳與免疫沉澱相結合的方法，將抗原病毒放在瓊脂凝膠靠近陰極一側，抗體放在靠近陽極一側，在直流電場中，抗原遷向正極，免疫球蛋白遷向負極，相遇後形成免疫沉澱線。具體技術如下：

（1）凝膠床的制備。取定量瓊脂粉用蒸餾水浸泡2～3d，每日換水1～2次，用硼酸緩沖液配成1%～1.2%的瓊脂液，加0.1%疊氮化鈉。將玻璃放在水平台上用吸管將緩沖液瓊脂注到板面，製成2mm厚的凝膠床並打孔。

（2）將制好的凝膠床放在電泳槽內，加緩沖液（用配製瓊脂凝膠的緩沖液稀釋1倍）離床面2～4cm，在瓊脂板陰極一端孔中加入抗原，在靠陽極一端孔中加入特異性抗血清，在瓊脂床的兩端用兩層紗布使瓊脂板與電泳槽中的緩沖液相連，進行電泳。

（3）進行電泳時，電壓、電流和時間，根據緩沖液離子強度、電泳床大小和抗原性質而有所不同。只要不使病毒抗原變性，盡量保持較高的電壓，如電流超過2mA，電泳應在低溫下進行。

（4）電泳完畢後，將電泳板放在黑色背景處觀察，也可將電泳完畢的瓊脂凝膠板先浸在生理食鹽水中30min，然後放在苦味酸溶液中20min，可將背景染成黃色，沉澱為白色，便於觀察。

免疫電泳與瓊脂雙擴散相比有三個優點，快速、靈敏並可用於在瓊脂中擴散慢的長形病毒。

4.乳膠凝集試驗及A蛋白乳膠凝集試驗

用特異性抗血清提純的免疫球蛋白，將其吸附在乳膠粒子上，制備抗體免疫球蛋白致敏乳膠。當與相應的抗原相遇時即可產生凝集反應。這是一種靈敏度高特異性強的血清學技術，但是每次都要特異性抗血清提取抗體γ球蛋白，制備手續繁雜不便應用，如直接用抗血清致敏乳膠則顯著影響效果。其後Querfurth（1979）發現A蛋白可吸附免疫球蛋白且不影響與相應抗原結合。這樣就可先使A蛋白與乳膠粒子結合，再與抗血清中的免疫球蛋白結合，形成A蛋白-乳膠-免疫球蛋白的復合體。這種乳膠凝集試驗可簡化致敏免疫球蛋白的過程，而獲得同樣效果。具體做法如下。

（1）免疫球蛋白致敏乳膠的制備。

將特異抗血清用33%飽和硫酸鹽析法提取球蛋白，懸浮於0.05mol/L、pH7.2的Tris-HCl（含0.02%PVP）緩沖液內，取10%空白乳膠稀釋15倍後與等量適宜濃度的球蛋白液混合，置室溫2h後移入冰箱內過夜。經低速離心（7000r/min，20min）取沉澱懸浮於緩沖液內，經反復離心洗滌2次後將最後沉澱物懸浮於緩沖液內即可得抗體球蛋白的致敏乳膠。

（2）A蛋白乳膠致敏抗體的制備。

將市售A蛋白溶於0.1mol/L、pH8.2的甘氨酸緩沖液內，製成A蛋白溶液，與等量稀釋15倍的空白乳膠液混合，置室溫3h，移入冰箱過夜。低速離心（7000r/min20min）後將沉澱懸浮於甘氨酸緩沖液，反復離心洗滌2次，沉澱懸浮於甘氨酸緩沖液制備A蛋白乳膠溶液，與等量適宜稀釋度的抗血清混合，置室溫下3h後移入冰箱過夜。再反復離心洗滌2次，最後將沉澱懸浮於與抗血清等等量的甘氨酸緩沖液內，即可得A蛋白乳膠致敏抗體。

（3）檢測法。

用0.05mol/L、pH7.2的Tris-HCl緩沖液（含0.02%PVP，0.02%NaN3）按等倍比稀釋抗原，製成20、40、80、160、320、640、1280的系列濃度，在一潔凈玻璃板上，用筆畫好方格，每格加2滴不同稀釋度的抗原，然後再加1滴乳膠致敏抗體（或A蛋白乳膠致敏抗體）用微量血液振盪器以120r/min振盪混合後，用肉眼或10～25倍解剖鏡觀察結果。同時設空白乳膠液和健汁液對照。

陽性反應表現有明顯的絮狀或顆粒狀凝集物，背景清明透亮，陰性反應則仍為均勻的牛乳狀液。也可用濁度計檢測其凝集度。

此法受健康植株蛋白的干擾較小，適於直接采自病株的澄清液，不但適合球狀病毒，對桿菌狀病毒，棒狀病毒，線狀病毒也適用，並有較高的靈敏度。但對效價低的抗血清或含有乳狀膠體的植物不適用。

5.酶聯免疫吸附試驗

酶聯免疫吸附試驗是一種固相吸附和免疫酶技術相結合的方法，將抗原或抗體包被在固相支持物上，使免疫反應在固體表面進行，並藉助標記在抗體上的酶與底物所產生的顏色，檢測相應的抗原。此法靈敏度高，特異性強，快速簡便極適宜植物檢疫應用。常用的檢測方法有以下幾種：

（1）直接法。

將待測樣品抗原（病毒）加入聚乙烯多孔板內，保溫後洗滌，使附著於壁上的抗原與加入的酶標抗體γ球蛋白反應，洗滌後保留與抗原結合的酶標γ球蛋白，加入酶的底物，用分光光度計進行檢測。

（2）間接法。

先用抗兔球蛋白山羊抗體與酶結合制備酶標記抗體，將待檢抗原包被於固相載體，經過孵育洗滌，加入特異性兔抗血清，孵育洗滌後加羊抗兔酶標記抗體，孵育洗滌後加入底物，觀察結果。

（3）雙抗體夾心法。

先將特異抗體免疫球蛋白包被於固相載體，保溫洗滌後，加待測抗原，使與吸附於載體上的抗體反應，保溫洗滌後再加入特異抗體的酶標記物，最後加底物觀察反應結果。

（4）A蛋白酶聯法。

將A蛋白用pH9.6的甘氨酸緩沖液稀釋後包被微板，加入特異性抗血清，使其與已固定在微板上的A蛋白結合，再加入待測抗原使其與特異性抗體反應，再加入特異性抗體，使其與抗原反應，再加酶標記A蛋白，最後加酶的底物測其光密度值。

（5）異種動物雙抗體夾心法。

先將第一抗體（兔血清抗體）包被微量反應板，加待測抗原後，加適宜濃度的第二抗體（鼠腹水抗體），再加入市售羊抗鼠酶標記物，最後加底物觀察反應，一般8h即可得出結果。此法保持了雙抗體夾心法快速准確靈敏度高的特點，對球狀病毒、桿狀病毒、線狀病毒、棒狀病毒均可應用。抗體不必純化可直接使用（但未純化的抗血清需先選擇其最適工作濃度），使用市售酶標記物，可省去制備酶標記抗體的復雜手續，還可克服間接法非特異性反應干擾大的弱點。

（6）生物素抗生物素酶聯法。

生物素具有很強的親和力，是抗原抗體反應的1萬倍，兩者一旦結合就難以離解，且不受酸鹼變性劑蛋白溶解酶及有機溶劑的影響，具有高度穩定性，生物素一經活化可與蛋白質呈偶聯結合，即一個大分子可結合多個生物素分子，生物素又可大量結合在酶標記物上，使酶標記物成為多價，而抗生物素本身又是一個多價分子，每一亞基均可結合一個生物素分子，因此，這種方法可產生多級放大，使靈敏度提高10倍以上，並降低非特異性反應，把酶聯免疫吸附技術又提高一步。具體方法如下：

先將第一特異抗體（兔抗體或鼠腹水抗體）包被在固相載體，加待檢抗原，加第二特異性抗體（鼠腹水抗體或兔抗體），再加入相應生物素化（羊抗鼠或羊抗兔）免疫球蛋白，再加抗生物素酶結合物，最後加入底物觀察O.D.值。

（7）膜上斑點酶聯法。

先用軟鉛筆在一張適宜大小的硝酸纖維素膜上劃好邊長1cm的方格網，把纖維素膜浸入TBS緩沖液漂洗30min，然後將膜放在兩張濾紙之間，在室溫下風干，用移液器將抗原抽提液滴在各方格中央，室溫下風干，用TBS-T緩沖液（含0.5%Tween的TBS液）洗膜5min，取出後放在濾紙上至膜表面水滴消失，然後浸入封閉液（含1%牛血清蛋白，和2%聚乙烯吡咯烷酮的TBS-T液），在37℃下保溫1h，取出晾乾後，浸在用封閉液稀釋的第一抗體溶液，在37℃下保溫1h，用TBS-T液洗膜10次，每5min換液一次。將膜浸入稀釋度1/200的酶聯球蛋白，室溫保溫1h，用上法洗膜後，用鹼性磷酸酯酶緩沖液沖洗兩次，每次10min，將膜浸入酶底物溶液內，室溫下避光5～15min，顯色完全後棄去底物液，用終止液（10mmol/LTris-HCl，pH7.5，5mmol/LEDTA）洗膜30min，置膜於濾紙內徹底風干後觀察結果。

此法可克服塑料板的不足，只用目測就可對結果定性，不需要復雜的儀器，所需抗原抗體量均很少，靈敏度比常規酶聯法高10倍以上，適合大量抗原的檢測。

6.免疫電鏡

電鏡檢測可快速確定病毒粒子的形狀，是鑒定病毒不可缺少的技術，但有的樣品濃度很低，用普通的電鏡技術不易觀察，如將病毒粒子包被後，抗體可把病毒粒子捕捉成聚集物便於觀察。同時還可從病毒粒子與抗體的結合情況，觀察兩者間的血清學關系。通常使用的有以下幾種方法：

（1）葉片浸沾血清技術。

把一滴稀釋的抗血清，滴在有膜的銅網上，將葉片的新鮮切口浸入血清滴中1～2s，置於室溫下5～10min，使血清與相應的病毒聚集並裝飾起來，再進行負染檢鏡。

（2）Derrick氏法。

把火棉膠膜銅網在24℃下，置於按1∶10比例稀釋於Tris緩沖液的抗血清內，然後將銅網用緩沖液沖洗後使用。把病毒的粗提液稀釋於含HCl的Tris緩沖液內，將已用血清包被的銅網浮於0.1ml的病毒稀釋液內1h（24℃），先用Tris-HCl液再用水沖洗，然後乾燥噴鍍。

（3）聚集法。

把抗血清用磷酸緩沖液稀釋到1/100的濃度，取10μl滴於載玻片，將切成2mm見方的病葉在血清滴中壓碎，在濕室中保濕15min，用鑷子持有膜銅網蘸取液滴，用20倍磷酸緩沖液沖洗後，再用蒸餾水洗，最後用5滴醋酸氧鈾染色觀察。

（4）修飾法。

取2mm見方的病葉在載玻片上的10μl蒸餾水中壓碎，持有膜銅網沾此液滴，將病毒粒子吸附於銅網上，然後將銅網用20滴的磷酸緩沖液沖洗，吸去水分後加1滴稀釋成1/100的抗血清，在濕室中保濕15min後，將銅網用20滴磷酸緩沖液和30滴蒸餾水沖洗，最後用醋酸氧鈾染色檢鏡。

（5）誘捕修飾法。

先將銅網用稀釋1/10或1/100的特異性抗血清包被，再把病毒樣品滴於銅網，保濕15min，用緩沖液及蒸餾水沖洗吸干，再加1滴稀釋成1/100的特異性抗血清，孵育15min後，用緩沖液和蒸餾水沖洗，吸干染色檢鏡。

（6）羊抗兔血清誘捕修飾法。

在誘捕修飾法未染色以前，再加1滴稀釋1/20的羊抗兔血清，孵育15min，洗滌後染色鏡檢。此法因病毒粒子外殼包被有兩層血清，明顯加粗，在2000倍的低倍電鏡下即可清晰地看到病毒粒子。

（7）A蛋白誘捕修飾法。

在福爾馬膜的銅網上滴1滴50mg/ml的A蛋白液，孵育後洗去多餘的A蛋白，再包被稀釋100倍的特異性抗血清，滴加抗原，再滴加特異性抗血清，最後染色鏡檢。此法比一般誘捕修飾法靈敏度高，能捕捉更多病毒粒子。

❾ 臨床上常用的血清學檢查方法有哪幾種

主要有沉澱試驗、凝集試驗、補體結合試驗、中和試驗及與標記抗體有關的試驗。

（1）凝集試驗

包括玻板凝集法、全血平板凝集法、試管凝集法和瓊脂擴散法。

①全血平板凝集反應

此法常用於傳染性鼻炎、雞白痢、雞傷寒、雞慢性呼吸道病等禽病的檢疫和監測。

②瓊脂擴散反應

當適當比例的抗原抗體在含有電解質的瓊脂網狀基質中自由擴散相遇時，形成肉眼可見的白色沉澱線。此法常用於雞傳染性法氏囊病、雞馬立克氏病、禽流感、禽腦脊髓炎、禽腺病毒感染等病的診斷，還常用於抗體監測和血清學流行病學調查。

（2）血凝與血凝抑制試驗

試驗原理：某些病毒能夠與人或動物的紅細胞發生凝集，稱為血凝反應（HA）。這種凝集反應可被加入的特異性血清所抑制，稱為紅細胞凝集抑制試驗，即血凝抑制反應（HI）。

此方法常用於雞新城疫、禽流感、雞產蛋下降綜合征等病毒的診斷和血清學監測。