噬菌體效價測定的方法及步驟

❶ 如何培養微生物

實驗一 常用培養基的制備、滅菌與消毒
實驗二 土壤中微生物分離純化培養
實驗三 菌種保藏
實驗四 細菌形態觀察及單染色
實驗五 放線菌及黴菌形態觀察
實驗六 革蘭氏染色及芽孢染色
實驗七 酵母菌的形態觀察及死活細胞的鑒定
實驗八 微生物直接計數法及測微技術
實驗九 大腸桿菌生長曲線的測定
實驗十 水中細菌總數的測定
實驗十一細菌細胞的生化反應實驗
實驗十二噬菌體的分離、純化及效價測定

實驗一 常用培養基的制備、滅菌與消毒

一、實驗目的
了解培養基的配製原理；掌握配製培養基的一般方法和步驟；了解常見滅菌、清毒基本原理及方法；掌握乾熱天菌、高壓蒸汽滅菌及過濾除菌的操作方法。

二、實驗原理
培養基是人工按一定比例配製的供微生物生長繁殖和合成代謝產物所需要的營養物質的混合物。培養基的原材料可分為碳源、氮源、無機鹽、生長因素和水。根據微生物的種類和實驗目的不同，培養基也有不同的種類和配製方法。
牛肉膏蛋白腖培養基是一種應用最廣泛和最普通的細菌基礎培養基，有時又稱為普通培養基。由於這種培養基中含有一般細胞生長繁殖所需要的最基本的營養物質，所以可供微生物生長繁殖之用。
乾熱天菌、高壓蒸汽滅菌方法主要是通過升溫使蛋白質變性從而達到殺死微生物的效果。

三、試劑與器材
1.器材 試管、三角瓶、燒杯、量筒、玻璃棒、培養基、分裝器、天平、牛角匙、高壓蒸汽滅菌鍋、pH度紙、棉花、牛皮紙、記號筆、麻繩、紗布、吸管、培養皿、電烘箱、注射器、微孔濾膜過濾器、鑷子等。
2.試劑 牛肉膏、蛋白腖、NaCl、瓊脂

四、實驗內容
1.稱量→溶化→調pH→過濾→分裝→加塞→包紮→滅菌→無菌檢查
2.乾熱滅菌：裝入待滅菌物品→升溫→恆溫→降溫→開箱取物
3.高壓蒸汽滅菌：加水→裝物品→加蓋→加熱→排冷空氣→加壓→恆壓→降壓回零→排汽→取物→無菌檢查
4.過濾除菌：組裝滅菌→連接→壓濾→無菌檢查→清洗滅菌
五、關鍵步驟及注意事項
1.要嚴格按配方配製。
2.調pH不要過頭。
3.乾熱滅菌要注意物品不要堆放過緊，注意溫度的時間控制，70ºC以下放物、取物。
4.高壓滅菌要注意物品不要過多，加熱後排除冷空氣，到時降壓回零取物。
5.過濾除菌要注意各部件滅菌，壓濾時，壓力要適當，不可太猛太快，濾膜要注意清洗保存。

實驗二 土壤中微生物分離純化培養

一、實驗目的
掌握倒平板的方法和幾種常用的分離純化微生物的基本操作技術；了解不同的微生物菌落在斜面上、半固體培養基和液體培養基中的生長特徵；進一步熟練和掌握微生物無菌操作技術；掌握微生物培養方法。

二、實驗原理
從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化。常用的分離、純化方法：單細胞挑取法，稀釋塗布平板法，稀釋混合平板法，平板劃線法 稀釋塗布平板法步驟：倒平板－制備土壤污水稀釋液－塗布－培養－挑菌落；平板劃線法步驟：倒平板－標記培養基名稱－劃線。
三、試劑與器材
1.器材 盛9m1無菌水的試管、盛90m1無菌水並帶有玻璃珠的三角燒瓶、無菌玻璃塗棒、無菌吸管、接種環、酒精燈、無菌培養皿、顯微鏡、血細胞計數板等。
2.試劑 牛肉膏蛋白腖培養基，高氏1號培養基，查氏培養基

四、實驗內容
1.土壤稀釋液的制備
2.微生物分離純化：稀釋塗平板法，平皿劃線分離法，微生物培養技術

五、關鍵步驟及注意事項
1.掌握含菌培養基的配製，嚴格控制溫度。
2.平板劃線應防止染菌，同時應注意劃線深度及密度。
實驗三 菌種保藏
一、實驗目的
1.學習並掌握菌種保藏的基本原理。
2.掌握常用的幾種不同的菌種保藏方法。

二、實驗原理
微生物個體微小、代謝旺盛、生長繁殖快，如果保存不妥容易發生變異和雜菌污染，甚至導致細胞死亡等現象。因此，保存好菌種是非常必要和重要的。常用的菌種保藏方法包括傳代培養法、載體法、懸液法、冷凍法和真空乾燥法

三、試劑與器材
1.材料 大腸桿菌、青黴菌、放線菌
2.試劑 液體石蠟、甘油、五氧化二磷、95％乙醇、10％鹽酸、無水氯化鈣、食鹽、乾冰
3.器材 無菌吸管、無菌滴管、無菌培養皿；安額管、凍干管、40目與100目篩子、油紙、濾紙條(0.5X1.2cm)、乾燥器、真泵器、真空泵、真空壓力表、噴燈、L形五通管、冰箱、低溫冰箱(—30℃)、超低溫冰箱和液氮罐等。

四、實驗內容
1.斜面保藏法
2.液體石蠟法
3.穿刺保藏法
4.砂土管保藏法
5.冷凍真空乾燥保存法

五、關鍵步驟及注意事項
1.清楚各種保藏方法的優缺點，針對不同要求選擇適宜的保藏方法。
2.熔封安瓶時防止封閉不嚴。
3.液氮凍存操作應防止凍傷。

實驗四 細菌形態觀察及單染色

一、實驗目的
1.了解簡單染色法的原理，並掌握其操作方法。
2.學習並掌握微生物塗片、染色的基本技術和無菌操作技術。
3.鞏固顯微鏡(油鏡)的使用方法。
4.初步認識細菌的形態特徵。

二、實驗原理
細菌個體微小，且較透明，必須藉助染色法使菌體著色，與背景形成鮮明的對比，以便在顯微鏡下進行觀察。根據實驗目的不同，可分為簡單染色法、鑒別染色法和特殊染色法等。簡單染色法是最基本的染色方法，是利用單一染料對細菌進行染色。此法操作簡便，適用於菌體一般形狀和細菌排列的觀察。常用鹼性染料進行簡單染色。

三、試劑與器材
1.材料 大腸桿菌，枯草芽孢桿菌
2.試劑 呂氏鹼性美藍染液(或草酸銨結晶紫染液)、齊氏石炭酸復紅染液。
3.器材 顯微鏡、酒精燈、載玻片、接種環、雙層瓶(內裝香柏油和二甲苯)等。

四、實驗內容
簡單染色法：塗片→乾燥→固定→染色→水洗→乾燥→鏡檢

五、關鍵步驟及注意事項
1.塗片時，生理鹽水及取菌不宜過多，塗片應盡可能均勻，
2.水洗步驟水流不宜過大，過急，以免塗片薄膜脫落。

實驗五 放線菌及黴菌形態觀察

一、實驗目的
1.了解放線菌、黴菌形態觀察的原理。
2.學習並掌握觀察放線菌、黴菌形態的操作方法。
3.初步了解放線菌、黴菌的形態特徵。

二、實驗原理
放線菌是指能形成分枝絲狀體或菌絲體的一類革蘭氏陽性細菌。常見放線菌大多能形成菌絲體，緊貼培養基表面或深入培養基內生長的叫基內菌絲(簡稱「基絲」)，基絲生長到一定階段還能向空氣中生長出氣生菌絲(簡稱「氣絲」)，並進一步分化產生孢子絲及孢子。有的放線菌只產生基絲而無氣絲。在顯微鏡下直接觀察時，氣絲在上層、基絲在下層，氣絲色暗，基絲較透明。孢子絲依種類的不同，有直、波曲、各種螺旋形或輪生。
黴菌可產生復合分枝的菌絲體，分基內菌絲和氣生菌絲，氣生菌絲生長到一定階段分化產生繁殖菌絲，由繁殖菌絲產生孢子。黴菌菌絲體(尤其是繁殖菌絲)及孢子的形態特徵是識別不同種類黴菌的重要依據。黴菌菌絲和孢子的寬度通常比細菌和放線菌粗得多，常是細菌菌體寬度的幾倍至幾十倍，因此，用低倍顯微鏡即可觀察。人們設計了各種培養和觀察方法，這些方法的主要目的是為了盡可能保持放線菌自然生長狀態下的形態特徵。本實驗採用插片法。
插片法：將放線菌接種在瓊脂平板上，插上滅菌蓋玻片後培養，使放線菌菌絲沿著培養基表面與蓋玻片的交接處生長而附著在蓋玻上。觀察時，輕輕取出蓋玻片，置於載玻片上直接鏡檢。這種方法可觀察到放線菌自然生長狀態下的特徵，而且便於觀察不同生長期的形態。

三、試劑與器材
1.材料 黑麴黴、青黴和根霉，細黃鏈黴菌或青色鏈黴菌，滅菌的高氏I號瓊脂和滅菌的查氏培養基。
2.實驗器材 經滅菌的：平皿、玻璃紙、無菌吸管、蓋玻片、玻璃塗棒，以及載玻片、接種環、接種鏟、鑷子、顯微鏡等。

四、實驗內容
倒平板→接種→插片→培養→鏡檢

五、關鍵步驟及注意事項
1.倒平板要厚一些，接種時劃線要密。
2.插片時要有一定角度並與劃線垂直。
3.觀察時，宜用略暗光線；先用低倍鏡找到適當視野，更換高倍鏡觀察。
4.如果用0.1%美藍對培養後的蓋玻片進行染色後觀察，效果會更好。
實驗六 革蘭氏染色及芽孢染色
一、實驗目的
1.了解革蘭氏染色法和芽孢染色法的原理，並掌握其操作方法。
2.了解革蘭氏染色法在細菌分類鑒定中的重要性。
3.學習並掌握微生物塗片、染色的基本技術和無菌操作技術。
4.學習顯微鏡(油鏡)的使用方法。
5.初步認識細菌的形態特徵。

二、實驗原理
革蘭氏染色法的基本步驟是：先用初染劑結晶紫進行染色，再用碘液媒染，然後用乙醇(或丙酮)脫色，最後用復染劑(如番紅)復染。經此方法染色後，細胞保留初染劑藍紫色的細菌為革蘭氏陽性菌；如果細胞中初染劑被脫色劑洗脫而使細菌染上復染劑的顏色(紅色)，該菌屬於革蘭氏陰性菌。革蘭氏染色反應是細菌重要的鑒別特徵，為保證染色結果的正確性，採用規范的染色方法是十分必要的。
芽孢染色法的基本原理，用著色力強的染色劑孔雀綠或石炭酸復紅，在加熱條件下染色，使染料不僅進入菌體也可進入芽孢內，進入菌體的染料經水洗後被脫色，而芽孢一經著色難以被水洗脫，當用對比度大的復染劑染色後，芽孢仍保留初染劑的顏色，而菌體和芽孢囊被染成復染劑的顏色，使芽孢和菌體更易於區分。

三、試劑與器材
1.材料：枯草芽孢桿菌12～18h營養瓊脂斜面培養物，大腸桿菌約24h營養瓊脂斜面培養物
2.試劑 革蘭氏染色液(結晶紫液、碘液、95％乙醇、番紅液)。5％孔雀綠水溶液
3.實驗器材 小試管、滴管、燒杯、試管架、濾紙、木夾子、載玻片、蓋玻片、凹載玻片、無菌水、顯微鏡等、接種環、雙層瓶(內裝香柏油和二甲苯)、擦鏡紙、生理鹽水等。

四、實驗內容
1.革蘭氏染色法 製片→初染→媒染→脫色→復染→鏡檢。
2.Schaefer-Fulton氏染色法 製片→染色→水洗→復染→水洗→鏡檢。

五、關鍵步驟及注意事項
1.塗片時，生理鹽水及取菌不宜過多，塗片應盡可能均勻，
2.乙醇脫色是革蘭氏染色操作的關鍵環節，嚴格掌握脫色時間。

實驗七 酵母菌的形態觀察及死活細胞的鑒定

一、實驗目的
1.觀察酵母菌的形態特徵、出芽生殖方式，並掌握酵母菌與細菌形態特徵的區別。
2.學習鑒別死活細胞的實驗方法。

二、實驗原理
酵母菌是單細胞的真核微生物，菌體比細菌大而且不運動。酵母菌的繁殖方式分為無性繁殖和有性繁殖兩種，以無性繁殖為主。芽殖是酵母菌普遍的無性繁殖方式，少數為裂殖；有性繁殖是產生子囊和子囊孢子。本實驗是通過美藍染液水浸片和水一碘液水浸片來觀察酵母的形態和芽殖方式。
美藍是一種無毒性的染料，它的氧化型呈藍色，還原型無色。用美藍對酵母活細胞染色時，由於細胞的新陳代謝作用，細胞內具有較強的還原能力，能使美藍由藍色的氧化型變為無色的還原型，而對代謝作用微弱或死細胞，無此還原能力或還原能力極弱，而被美藍染成藍色或淡藍色。因此，不僅用此法可觀察酵母細胞形態，也可用來鑒別酵母菌的死細胞和活細胞。

三、試劑與器材
1.材料 釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或卡爾酵母(Saccharomyces calsbergensis)培養2天左右的麥芽汁(或豆芽汁)液體培養物。
2.試劑 0.05％和O.1％呂氏鹼性美藍染色液、革蘭氏染色用的碘液。
3.器材 顯微鏡、載玻片、蓋玻片、接種環、灑精燈等。

四、實驗內容
1.美藍浸片觀察 酵母培養→製片→染色→鏡檢→30分鍾後再鏡檢
2.水-碘浸片觀察

五、關鍵步驟及注意事項
1.染液不宜過多或過少，否則，在蓋上蓋玻片時，菌液溢出或出現大量氣泡。
2.用鑷子取一塊蓋玻片，先將一側與菌液接觸，然後慢慢將蓋玻片放下，使其蓋在菌液上，蓋玻片不宜平著放下，避免氣泡產生。

實驗八 微生物直接計數法及測微技術

一、實驗目的
1.了解血球計數板計數原理，並掌握計數方法。
2.掌握用測微尺測定微生物大小的方法。

二、實驗原理
顯微鏡直接計數法是將一定稀釋的菌體或孢子懸液注入血球計數板的計數室中，於顯微鏡下直接計數的一種簡便、快速、直觀的方法。因為計數板是一塊特別的載玻片。其上由四條槽構成三個平台；中間較寬的平台又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平台上各刻有一個方格網，每個方格網共分為九個大方格，一種是一個大方格分成25個中方格，而每個中方格又分成16個小方格(見圖2—3—44)；另一種是一個大方格分成16個中方格，每個中方格又分成25個小方格，無論哪種每個大方格中的小方格都是400個。每一個大方格邊長為0．1mm，所以計數室的容積為0．1mm3。計數時，通常只用5個中格內的菌體(孢子)數即可。然後求出每個中方格的平均值，再乘上25或16，得出一個大方格中的總茵數，再換算成lml菌液中的總菌數。若設5個中方格中總菌數為N，菌液稀釋倍數為M，如果是25個中方格計數板，則計算方法為：
lml菌液中的總菌數=平均每個中格中菌的個數×25×104×M=50000N·M(個)
微生物細胞的大小是微生物基本的形態特徵，也是分類鑒定的依據之一。微生物大小的測定，需要在顯微鏡下，藉助於特殊的測量工具——測微尺，包括目鏡測微尺和鏡台測微尺。鏡台測微尺是中央部分刻有精確等分線的載玻片，一般是將1mm等分為100格，每格長0．01mm(即10pm)。鏡台測微尺並不直接用來測量細胞的大小，而是用於校正目鏡測微尺每格的相對長度。
三、試劑與器材
1.材料 釀酒酵母、藤黃微球菌和大腸桿菌的染色標本片、釀酒酵母24h馬鈴薯斜面培養物。
2.實驗器材 細胞計數板、顯微鏡、蓋玻片、無菌毛細滴管、目鏡測微尺、鏡台測微尺、載玻片、蓋玻片、顯微鏡等。

四、實驗內容
1.微生物直接計數法 菌懸液制備→鏡檢計數室→加樣品→顯微鏡計數→清洗血細胞計數板
2.微生物測微技術 裝目鏡測微尺→校正→菌體大小測定

五、關鍵步驟及注意事項
1.防止加樣空氣泡產生。
2.調節顯微鏡光線的強弱適當。
實驗九 大腸桿菌生長曲線的測定

一、實驗目的
1.了解大腸桿菌的生長曲線特徵和繁殖規律，並學會繪制生長曲線。
2.復習光電比濁法測量細菌數量的方法。

二、實驗原理
將一定量的細菌轉入新鮮液體培養基中，在適宜的條件下培養細胞要經歷延遲期、對數期、穩定期和衰亡期四個階段。以培養時間為橫坐標，以細菌數目的對數或生長速率為縱坐標作圖所繪制的曲線稱為該細菌的生長曲線。不同的細菌在相同的培養條件下其生長曲線不同，同樣的細菌在不同的培養條件下所繪制的生長曲線也不相同。

三、試劑與器材
1.材料與試劑 大腸桿菌、LB液體培養基70ml、分裝2支大試管(5ml／支)、剩餘60ml裝入250ml的三角瓶。
2.器材 722型分光光度計、恆溫振盪搖床、無菌試管、無菌吸管等。

四、實驗內容
編號→接種→培養→比濁測定

五、關鍵步驟及注意事項
1.測定OD值時，要求從低濃度到高濃度測定
2.嚴格控制培養時間

實驗十 水中細菌總數的測定

一、實驗目的
1.學習水樣的採取方法和水樣細菌總數測定的方法。
2.了解水源水的平板菌落計數的原理。

二、實驗原理
本實驗應用平板計數技術測定水中細菌總數。由於水中細菌種類繁多，它們對營養和其他生長條件的要求差別很大，不可能找到一種培養基在一種條件下，使水中所有的細菌均能生長繁殖，因此，以一定的培養基平板上生長出來的菌落，計算出來的水中細菌總數僅是一種近似值。目前一般是採用普通牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基。

三、試劑與器材
1.試劑 牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基，滅菌水
2.器材 滅菌三角瓶，滅菌的帶玻璃塞瓶，滅菌培養皿，滅菌吸管，滅菌試管等。

四、實驗內容
1.水樣的採取
2.細菌總數測定
3.菌落計數方法

五、關鍵步驟及注意事項
1.注意全過程防止染菌
實驗十一 細菌細胞的生化反應實驗

一、實驗目的
了解並掌握細菌鑒定中常用生理生化反應的原理和方法。

二、實驗原理
各種細菌由於具有不同的酶系統，致使它們能利用不同的底物，或雖然可以利用相同的底物，卻產生不同的代謝產物，因此可以利用各種生理生化反應來鑒別細菌。
糖發酵是最常用的生化反應，存在於大多數細菌中。不同的細菌在糖的分解能力上存在很大的差異。有些細菌能分解某種糖並產生酸性物質(如乳酸、丙酸、醋酸等)和氣體(如二氧化碳、氫、甲烷等)，而有些細菌只產生酸不產生氣體。例如大腸桿菌分解乳糖和葡萄糖產酸並產氣，普通變形桿菌分解葡萄糖產酸產氣，但不能分解乳糖。酸的產生可利用指示劑來判斷。在培養基中加入溴甲酚紫(pH5．2為黃色，pH6．8為紫色)，當發酵產酸時，使培養基由紫色變為黃色。氣體的產生可由發酵試管中倒置的德漢氏小管中有無氣泡的出現來驗證．

三、試劑與器材
1.材料大腸桿菌、普通變性桿菌、產氣桿菌、糖發酵培養基、蛋白腖水培養基、葡萄糖蛋白腖水培養基。
2.試劑甲基紅試劑、40％KOH、5％a一萘酚、乙醚、吲哚試劑。
3.實驗器材德漢氏小管、試管、接種環、恆溫培養箱。

四、實驗內容
培養基配製→編號→試管→接種→培養→觀察結果

五、關鍵步驟及注意事項
1.要嚴格按照培養基配方配製培養基。
2.觀察結果時要注意滴加葯量及反應時間。
實驗十二 噬菌體的分離、純化及效價測定

一、實驗目的
1.學習分離、純化噬菌體的原理和方法
2.觀察噬菌斑的形態和大小
3.掌握噬菌體效價測定的基本方法

二、實驗原理
噬菌體是細菌的專性寄生物，自然界中凡是有細菌存在的地方，均可以發現其特異性的噬菌體，噬菌體侵入細菌細胞後，利用宿主細胞的酶系統進行復制和增殖，最終導致細菌細胞裂解，噬菌體從細胞中釋放出來，可以進一步侵染細菌細胞。在液體培養基中，噬菌體可以使渾濁的菌懸液變為澄清。在長有宿主細菌的固體培養基平板上，噬菌體可以裂解細菌形成透明的空斑，即噬菌斑，一個噬菌體產生一個噬菌斑，因此可以利用這個性質對噬菌體進行分離和效價的測定。
噬菌體的效價是指噬菌體的濃度，即一毫升培養液中所含有的噬菌體數量。噬菌體效價的測定方法多採用雙層瓊脂平板法。先在培養皿中倒入底層固體培養基，凝固後再倒入含有宿主細菌和一定稀釋度噬菌體的半固體培養基。培養一段時間後，計算噬菌斑的數量。

三、試劑與器材
1.材料大腸桿菌、牛肉膏蛋白腖固體培養基、牛肉膏蛋白腖半固體培養基(含有瓊脂0．5％，試管分裝，每管3～5m1)、三倍濃縮的牛肉膏蛋白腖液體培養基。
2.器材培養皿、無菌吸管、三角瓶、抽濾瓶、蔡氏細菌濾器、真空泵、陰溝污水。

四、實驗內容
噬菌體分離→噬菌體純化→效價測定

五、關鍵步驟及注意事項
1.噬菌體時要注意細菌濾器的型號。
2.純化噬菌體時要注意形態、大小。
3.效價測定時要注意雙層瓊脂平板法的使用技巧。

❷ 測定噬菌體效價需要嚴格控制哪些關鍵步驟

1.系列稀釋,即梯度稀釋時,要換槍頭,確保稀釋准確
2.做平行試驗,每個稀釋度的倒3個平板
3.摸索噬菌斑大小的條件,避免出現針尖狀的噬菌斑

❸ 測定噬菌體效價時,其他細菌的菌落是否會影響

不會。
噬菌體的效價就是一毫升培養液中所含活噬菌體的數量。效價測定的方法，一般應用雙層瓊脂平板法。由於含有特異宿主細菌的瓊脂平板上，一個噬菌體產生一個噬菌體斑，因此，能進行噬菌體的計數。
操作步驟
1稀釋噬菌體
2、噬菌體與菌液混合
3、混合液加入上層培養基內
4、接了種的上層培養基倒入底層平板上。
5、觀察平板中的噬菌斑，將每一稀釋度的噬菌斑數目記錄於實驗報告表格內，並選取30—300個噬菌斑的平板計算每毫升未稀釋的原液的噬菌體數（效價）。
噬菌體效價=噬菌斑數*稀釋倍數*10

❹ 什麼是噬菌體效價如何測定

噬菌體效價--------指噬菌體的濃度,即每毫升樣品含噬菌體的個數.通常是在含敏感菌的平板上形成噬菌斑進行噬菌體的計數,以每毫升中含有的噬菌斑形成單位(plaque
forming
unit/ml或pfu/ml)表示其效價.
例如,若每塊平皿加1
l稀釋106倍的樣品,可形成10個噬菌斑,則噬菌體效價為1010pfu/ml.(106*10*1000=1010;1ml=1000ml)

❺ 如何測定烈性噬菌體的一步生長曲線

一步生長曲線
定量描述毒性噬菌體生長規律的實驗曲線稱為一步生長曲線。是研究病毒復制的一個實驗，最初為研究噬菌體復制而建立，現已推廣到動物病毒及植物病毒復制的研究中。具體操作是將適量病毒接種於高濃度敏感細胞培養物，或高倍稀釋病毒細胞培養物，或以抗毒血清處理病毒細胞培養物以建立同步感染，以感染時間為橫坐標，病毒的效價為縱坐標繪制出的病毒特徵曲線，即為一步生長曲線。一步生長曲線分為潛伏期、裂解期和平穩期。
一步生長曲線不同階段。
潛伏期：
指噬菌體的核酸侵入宿主細胞以後至第一個成熟噬菌體粒子
裝配前的一段時間。它又可以分為兩個階段：
1、隱晦期：指在潛伏期前期認為的（用氯仿等）裂解宿主細胞以後，此裂解液仍無侵性的一段時間，這時細胞正處於復制噬菌體核酸和合成蛋白質衣殼的階段；
2、胞內累積期：即潛伏期的後期，指在隱晦期後，若認為的裂解細胞，其裂解液已呈侵染性的一段時間，這意味著細胞內已經開始裝配噬菌體粒子，此時電鏡可以觀察到。
裂解期：
緊接在潛伏期後的宿主細胞迅速裂解、溶液中噬菌體粒子急
速增加的一個階段。噬菌體或者其它病毒粒因只有個體裝配而不能存在個體生長，再加上若宿主細胞裂解的突發性，因此，從理論上來說，其裂解是瞬間出現的。但是事實上因為宿主群體中各個細胞的裂解不可能是同步的，故出現較長的裂解期。
平穩期：
指感染後的宿主細胞已經全部裂解，溶液中噬菌體的數目達
到最高峰，在這個時期，每一個宿主細胞釋放的平均噬菌體粒子數即為裂
解量。
實驗方法
一步生長曲線的實驗方法如下：先把在對數期生長的敏感細菌懸浮液與適量的噬菌體混合，通常噬菌體和細菌的混合比例為1:10，避免幾個噬菌體同時侵染一個細菌細胞。經數分鍾吸附後，混合液中加入一定量的該噬菌體的抗血清，以中和尚未吸附的噬菌體。然後再用培養液進行高倍稀釋，以免發生第二次吸附和感染。培養後定時取樣，將含噬菌體的樣品與敏感細菌混合，在平板上培養，計算噬菌斑數。結果可見，在吸附後的開始一段時間內（5～10min），噬菌斑數不見增加，說明噬菌體尚未完成復制和組裝，這段時間稱為噬菌體的潛伏期。緊接著在潛伏期後的一段時間（感染後20～30min），平板中的噬菌斑數突然直線上升，表示噬菌體已從寄主細胞中裂解釋放出來，這段時間稱為裂解期。每個被感染的細菌釋放新的噬菌體的平均數稱為裂解量。當宿主全部裂解，溶液中的噬菌體的效價達到最高點時稱為平穩期。
結論
通過一步生長曲線可以得出病毒的潛伏期和裂解量。潛伏期是毒粒吸
附細胞受到感染細胞釋放出子代毒粒所需的最短時間。裂解量是每個受染
細胞所產生的子代病毒顆粒的平均數目，其值等於穩定期受染細胞所釋放
的全部子代病毒數目除以潛伏期受染細胞的數目，即等於穩定期病毒效價
與潛伏期病毒效價之比。single burst curve 定量描述烈性噬菌體生長規律的實驗曲線
。其基本步驟是用噬菌體的稀懸液感染高濃度的宿主細胞，以保證每個細胞
至多不超過一個噬菌體吸附。數分鍾後中止吸附並稀釋後置於該細菌最適生長溫度下培養。在一定時間內，每隔數分鍾取樣作效價測定。以效價為縱坐標，培養時間為橫坐標所繪成的曲線即為一步生長曲線，它可以反映每種噬菌體的三個最重要的特性參數：潛伏期、裂解期、裂解量。
雙層平板法
又叫雙層瓊脂平板法
先在培養皿中倒入底層固體培養基，凝固後再倒入含有宿主細菌和一定
稀釋度噬菌體的半固體培養基。培養一段時間後，計算噬菌斑的數量。
方法:
雙層瓊脂平板法
1、 倒下層瓊脂融化下層培養基，倒平板（約10mL/皿）待用。
2 、倒上層瓊脂融化上層培養基，待融化的上層培養基冷卻至50℃左右時，每管中加入敏感指示菌 (大腸桿菌) 菌液0.2mL，待檢樣品液或上述噬菌體增殖液0.2～0.5mL，混合後立即倒入上層平板鋪平。
3、 恆溫培養
30℃恆溫培養6～12h觀察結果。
4 、觀察結果
如有噬菌體，則在雙層培養基的上層出現透亮無菌圓形空斑——噬菌斑。

❻ 什麼是噬菌體效價,簡述雙層平板法的原理與主要操作

噬菌體的分離純化及效價的測定

1
目的

1.1
了解噬菌體效價的含義及其測定原理。

1.2
學會檢查噬菌體的方法。

1.3
掌握用雙層瓊脂平板法測定噬菌體效價的操作技能。

2
原理

噬菌體是一類專性寄生於細菌和放線菌等微生物的病毒，
其個體形態極其微小，
用常規
微生物計數法無法測得其數量。
當烈性噬菌體侵染細菌後會迅速引起敏感細菌裂解，
釋放出
大量子代噬菌體，
然後它們再擴散和侵染周圍細胞，
最終使含有敏感菌的懸液由混濁逐漸變
清，
或在含有敏感細菌的平板上出現肉眼可見的空斑──噬菌斑。
了解噬菌體的特性，
快速
檢查、分離，並進行效價測定，對在生產和科研工作中防止噬菌體的污染具有重要作用。

檢樣可以是發酵液、空氣、污水、土壤等（至於無法采樣而需檢查的對象，可以用無菌
水浸濕的棉花塗拭表面作為檢查樣品）
。為了易於分離可先經增殖培養，使樣品中的噬菌體
數量增加。

採用生物測定法進行噬菌體檢查，
約需
12h
左右，
因而不能及時判斷是否有噬菌體污染。
通過
快速檢查可大致確定是否有噬菌體污染
，
以採取必要的防治措施。
根據
正常發酵
（培養）
液離心後菌體沉澱，
上清液蛋白含量很少，
加熱後仍然清亮；
而侵染有噬菌體的發酵
（培養）
液經離心後其上清液中因含有自裂解菌中逸出的活性蛋白，
加熱後發生蛋白質變性，
因而在
光線照射下出現丁達爾效應而不清亮
。
此法簡單、
快速，
對發酵液污染噬菌體的判斷亦較准
確。
但不適於溶源性細菌及溫合噬菌體的診斷，
對
侵染噬菌體較少的一級種子培養液
也往往
不適用。

噬菌體的效價即1
mL
樣品中所含侵染性噬菌體的粒子數。效價的測定一般採用雙層瓊
脂平板法。
由於在含有特異宿主細菌的瓊脂平板上，
一般一個噬菌體產生一個噬菌斑，
故可
根據一定體積的噬菌體培養液所出現的噬菌斑數，
計算出噬菌體的效價。
此法所形成的噬菌
斑的形態、大小較一致，且清晰度高，故計數比較准確，因而被廣泛應用。

❼ 效價的噬菌體效價

又稱噬菌斑形成單位（pfu）數,指每毫升試樣中含有侵染性噬菌體的粒子數。測定方法有雙層平板法，其優點有：
1）彌補平板不平
2）噬菌斑位於同個平面，較清晰
3）上層為半固體培養基，有利噬菌體擴散

❽ 查氏培養基的基本原理

實驗一 常用培養基的制備、滅菌與消毒

一、實驗目的
了解培養基的配製原理；掌握配製培養基的一般方法和步驟；了解常見滅菌、清毒基本原理及方法；掌握乾熱天菌、高壓蒸汽滅菌及過濾除菌的操作方法。

二、實驗原理
培養基是人工按一定比例配製的供微生物生長繁殖和合成代謝產物所需要的營養物質的混合物。培養基的原材料可分為碳源、氮源、無機鹽、生長因素和水。根據微生物的種類和實驗目的不同，培養基也有不同的種類和配製方法。
牛肉膏蛋白腖培養基是一種應用最廣泛和最普通的細菌基礎培養基，有時又稱為普通培養基。由於這種培養基中含有一般細胞生長繁殖所需要的最基本的營養物質，所以可供微生物生長繁殖之用。
乾熱天菌、高壓蒸汽滅菌方法主要是通過升溫使蛋白質變性從而達到殺死微生物的效果。

三、試劑與器材
1.器材 試管、三角瓶、燒杯、量筒、玻璃棒、培養基、分裝器、天平、牛角匙、高壓蒸汽滅菌鍋、pH度紙、棉花、牛皮紙、記號筆、麻繩、紗布、吸管、培養皿、電烘箱、注射器、微孔濾膜過濾器、鑷子等。
2.試劑 牛肉膏、蛋白腖、NaCl、瓊脂

四、實驗內容
1.稱量→溶化→調pH→過濾→分裝→加塞→包紮→滅菌→無菌檢查
2.乾熱滅菌：裝入待滅菌物品→升溫→恆溫→降溫→開箱取物
3.高壓蒸汽滅菌：加水→裝物品→加蓋→加熱→排冷空氣→加壓→恆壓→降壓回零→排汽→取物→無菌檢查
4.過濾除菌：組裝滅菌→連接→壓濾→無菌檢查→清洗滅菌

五、關鍵步驟及注意事項
1.要嚴格按配方配製。
2.調pH不要過頭。
3.乾熱滅菌要注意物品不要堆放過緊，注意溫度的時間控制，70ºC以下放物、取物。
4.高壓滅菌要注意物品不要過多，加熱後排除冷空氣，到時降壓回零取物。
5.過濾除菌要注意各部件滅菌，壓濾時，壓力要適當，不可太猛太快，濾膜要注意清洗保存。

六、思考題
1.培養基配好後，為什麼必須立即滅菌?如何檢查滅菌後的培養基是無菌的?
2.在配製培養基的操作過程中應注意些什麼問題?為什麼?
3.培養微生物的培養基應具備哪些條件?為什麼?
4.培養基的配製原則是什麼?

實驗二
土壤中微生物分離純化培養

一、實驗目的
掌握倒平板的方法和幾種常用的分離純化微生物的基本操作技術；了解不同的微生物菌落在斜面上、半固體培養基和液體培養基中的生長特徵；進一步熟練和掌握微生物無菌操作技術；掌握微生物培養方法。

二、實驗原理
從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化。常用的分離、純化方法：單細胞挑取法，稀釋塗布平板法，稀釋混合平板法，平板劃線法 稀釋塗布平板法步驟：倒平板－制備土壤污水稀釋液－塗布－培養－挑菌落；平板劃線法步驟：倒平板－標記培養基名稱－劃線。

三、試劑與器材
1.器材 盛9m1無菌水的試管、盛90m1無菌水並帶有玻璃珠的三角燒瓶、無菌玻璃塗棒、無菌吸管、接種環、酒精燈、無菌培養皿、顯微鏡、血細胞計數板等。
2.試劑 牛肉膏蛋白腖培養基，高氏1號培養基，查氏培養基

四、實驗內容
1.土壤稀釋液的制備
2.微生物分離純化：稀釋塗平板法，平皿劃線分離法，微生物培養技術

五、關鍵步驟及注意事項
1.掌握含菌培養基的配製，嚴格控制溫度。
2.平板劃線應防止染菌，同時應注意劃線深度及密度。

六、思考題
1.如何確定平板上某單個菌落是否為純培養?請寫出實驗的主要步驟。
2.如果要分離得到極端嗜鹽細菌，在什麼地方取樣品為宜?並說明理由。

實驗三
菌種保藏
一、實驗目的
1.學習並掌握菌種保藏的基本原理。
2.掌握常用的幾種不同的菌種保藏方法。

二、實驗原理

微生物個體微小、代謝旺盛、生長繁殖快，如果保存不妥容易發生變異和雜菌污染，甚至導致細胞死亡等現象。因此，保存好菌種是非常必要和重要的。常用的菌種保藏方法包括傳代培養法、載體法、懸液法、冷凍法和真空乾燥法

三、試劑與器材
1.材料 大腸桿菌、青黴菌、放線菌
2.試劑 液體石蠟、甘油、五氧化二磷、95％乙醇、10％鹽酸、無水氯化鈣、食鹽、乾冰
3.器材 無菌吸管、無菌滴管、無菌培養皿；安額管、凍干管、40目與100目篩子、油紙、濾紙條(0.5X1.2cm)、乾燥器、真泵器、真空泵、真空壓力表、噴燈、L形五通管、冰箱、低溫冰箱(—30℃)、超低溫冰箱和液氮罐等。

四、實驗內容
1.斜面保藏法
2.液體石蠟法
3.穿刺保藏法
4.砂土管保藏法
5.冷凍真空乾燥保存法

五、關鍵步驟及注意事項
1.清楚各種保藏方法的優缺點，針對不同要求選擇適宜的保藏方法。
2.熔封安瓶時防止封閉不嚴。
3.液氮凍存操作應防止凍傷。

六、思考題
根據你自己的實驗。談談1--2種菌種保藏方法的利弊?

實驗四
細菌形態觀察及單染色

一、實驗目的
1.了解簡單染色法的原理，並掌握其操作方法。
2.學習並掌握微生物塗片、染色的基本技術和無菌操作技術。
3.鞏固顯微鏡(油鏡)的使用方法。
4.初步認識細菌的形態特徵。

二、實驗原理

細菌個體微小，且較透明，必須藉助染色法使菌體著色，與背景形成鮮明的對比，以便在顯微鏡下進行觀察。根據實驗目的不同，可分為簡單染色法、鑒別染色法和特殊染色法等。簡單染色法是最基本的染色方法，是利用單一染料對細菌進行染色。此法操作簡便，適用於菌體一般形狀和細菌排列的觀察。常用鹼性染料進行簡單染色。

三、試劑與器材
1.材料 大腸桿菌，枯草芽孢桿菌
2.試劑 呂氏鹼性美藍染液(或草酸銨結晶紫染液)、齊氏石炭酸復紅染液。
3.器材 顯微鏡、酒精燈、載玻片、接種環、雙層瓶(內裝香柏油和二甲苯)等。

四、實驗內容
簡單染色法：塗片→乾燥→固定→染色→水洗→乾燥→鏡檢

五、關鍵步驟及注意事項
1.塗片時，生理鹽水及取菌不宜過多，塗片應盡可能均勻，
2.水洗步驟水流不宜過大，過急，以免塗片薄膜脫落。

六、思考題
1.你認為制備細菌染色標本時，尤其應該注意哪些環幣?
2.為什麼要求製片完全乾燥後才能用油鏡觀察?
3.如果你的塗片未經熱固定，將會出現什麼問題?如果加熱溫度過高、時間太長，又會怎樣呢?

實驗五
放線菌及黴菌形態觀察

一、實驗目的
1.了解放線菌、黴菌形態觀察的原理。
2.學習並掌握觀察放線菌、黴菌形態的操作方法。
3.初步了解放線菌、黴菌的形態特徵。

二、實驗原理

放線菌是指能形成分枝絲狀體或菌絲體的一類革蘭氏陽性細菌。常見放線菌大多能形成菌絲體，緊貼培養基表面或深入培養基內生長的叫基內菌絲(簡稱「基絲」)，基絲生長到一定階段還能向空氣中生長出氣生菌絲(簡稱「氣絲」)，並進一步分化產生孢子絲及孢子。有的放線菌只產生基絲而無氣絲。在顯微鏡下直接觀察時，氣絲在上層、基絲在下層，氣絲色暗，基絲較透明。孢子絲依種類的不同，有直、波曲、各種螺旋形或輪生。
黴菌可產生復合分枝的菌絲體，分基內菌絲和氣生菌絲，氣生菌絲生長到一定階段分化產生繁殖菌絲，由繁殖菌絲產生孢子。黴菌菌絲體(尤其是繁殖菌絲)及孢子的形態特徵是識別不同種類黴菌的重要依據。黴菌菌絲和孢子的寬度通常比細菌和放線菌粗得多，常是細菌菌體寬度的幾倍至幾十倍，因此，用低倍顯微鏡即可觀察。人們設計了各種培養和觀察方法，這些方法的主要目的是為了盡可能保持放線菌自然生長狀態下的形態特徵。本實驗採用插片法。
插片法：將放線菌接種在瓊脂平板上，插上滅菌蓋玻片後培養，使放線菌菌絲沿著培養基表面與蓋玻片的交接處生長而附著在蓋玻上。觀察時，輕輕取出蓋玻片，置於載玻片上直接鏡檢。這種方法可觀察到放線菌自然生長狀態下的特徵，而且便於觀察不同生長期的形態。

三、試劑與器材
1.材料 黑麴黴、青黴和根霉，細黃

❾ 噬菌體侵染細菌實驗步驟講解過程在線等 麻煩有勞了

1.做大腸桿菌的劃線，過夜，然後挑單菌落進行液體培養到對數期。
2.噬菌體復甦：取50ul噬菌體原液到5ml菌液中。然後37度搖床培養到液體變澄清。
3.可用平板法檢驗噬菌體。具體查閱微生物實驗手冊
4.噬菌體的效價