Ⅰ 几种细胞固定方法
选择最佳固定液标准是： （1）最好地保持细胞和组织的形态结构； （2）最大限度地保存抗原的免疫活性。一些含重金属的固定液在免疫组化和细胞化学技术中是禁用的； （3）不要用可能带有自发荧光的固定剂，如带有苦味酸的固定剂，还有甲醛升汞固定液，会使上皮细胞产生非特异性荧光； （4）固定剂的选择、固定时间、温度和PH值都会影响实验结果。 单纯固定液（1）4%中性甲醛固定液：最常用的固定液，能满足常规HE及免疫组化、PCR等工作（Job）。中性甲醛是以PH7.2-7.4的磷酸缓冲液为溶剂配制的，其固定效果及对组织抗原性的保存均优于一般的4%甲醛固定液。此固定液配制后应密封并保存在阴凉处，保存时间不超过一个月。 甲醛（40%） 100ml 无水磷酸氢二钠 6.5g 磷酸二氢钠 4.0g 蒸馏水 900ml （2）乙醇固定液：使用时以80%-95%的浓度为宜，具有硬化、固定、脱水等作用，对组织渗透力较弱，因此很少单独使用，但其保存组织中的核酸强于中性甲醛，故常用于有核酸操作的实验或检查，假如用于证实尿酸结晶和保存糖原，可用于100%乙醇固定组织。 （3）4%多聚甲醛固定液：主要用于培养细胞的固定。 混合固定液（1）乙醇-甲醛（乙醇-福尔马林，AF）固定液：适用于皮下组织中肥大细胞的固定。该固定液有固定兼脱水作用，固定后的标本可直接入95%乙醇脱水。 甲醛（40%） 100ml 95%乙醇 900ml （2）B5（醋酸钠-升汞-甲醛）固定液：多用于固定淋巴组织。染色前应进行脱汞沉淀处理。 无水醋酸钠 1.25g升汞 6.0g蒸馏水 90ml 使用前加入甲醛 10ml （3）Bouin固定液：非凡适用于睾丸活检组织的固定。Bouin液对组织固定较均匀，收缩很少，不会使组织变硬变脆。需现配现用。 饱和苦味酸水溶液（约1.22%） 75ml甲醛 25ml冰醋酸 5ml（4）Carnoy固定液：穿透能力强，可很好的固定细胞质和细胞核，非凡适用于固定外膜致密的组织，也适用于糖原及尼氏小体的固定。 无水乙醇 60ml氯仿 30ml冰醋酸 10ml （5） Zenker固定液：经此液固定的标本，细胞核和细胞质染色颇为清楚，但成本较高且需非凡处理汞。该固定液要避免接触阳光，以免引起化学变化而失效。 升汞 5.0g 重铬酸钾 2.5g 蒸馏水（加至）100ml
Ⅱ PI染色法实验操作指南及注意事项、常见问题及解答
PI染色法实验操作指南及注意事项、常见问题及解答PI染色法实验操作指南
细胞处理：
在进行PI染色实验前，首先需要培养和处理细胞至适当的生长状态。
确保细胞数目和状态适合实验要求，以保证实验结果的准确性。
固定：
将培养的细胞样品进行固定，常用的固定剂包括甲醛和乙醛。
固定的目的是保持细胞结构完整，防止细胞溶解和损伤。
洗涤：
固定后的细胞样品需要进行洗涤，以去除固定剂和其他杂质。
避免固定剂残留对后续染色产生干扰。
染色：
将洗涤后的细胞样品加入PI染液中。
PI染液会与细胞内DNA结合，产生红色荧光。
染色时间和染液浓度要根据实验要求进行优化，以获得最佳的染色效果。
再次洗涤：
染色后的细胞样品需要再次进行洗涤。
去除未结合的PI染料，减少背景干扰。
流式细胞术：
使用流式细胞仪对染色后的细胞进行分析和检测。
通过流式细胞术可以获取细胞数量、荧光强度等信息。
数据分析：
根据流式细胞仪的结果进行数据分析。
得出实验的结果和结论，为科研提供有力支持。
注意事项：
常见问题及解答：
Q：细胞聚集在一起，无法得到准确的流式细胞仪分析结果怎么办？
A：细胞聚集可能是由于染色或洗涤过程中的操作不当导致的。为了避免这种情况，需要在洗涤过程中充分分散细胞，可以使用离心或者轻轻振荡培养瓶来分散细胞。
Q：PI染色实验结果中有很多背景噪音，如何解决？
A：背景噪音可能是未洗净未结合的PI染料导致的。在洗涤过程中要彻底洗净未结合的染料，可以多次进行洗涤，或者使用更低浓度的PI染液。
Q：PI染色实验中得到的荧光信号很弱，怎么提高荧光强度？
A：荧光信号弱可能是由于染液浓度不足或者染色时间不够导致的。可以尝试增加PI染液的浓度或者延长染色时间来提高荧光强度。
Q：PI染色实验中发现细胞死亡率较高，可能影响实验结果，应该怎么办？
A：细胞死亡率较高可能是由于固定或染色过程中使用的化学物质对细胞产生毒性导致的。可以尝试优化固定和染色条件，或者尝试其他更温和的染色方法。
Q：如何区分正常细胞和死细胞？
A：死细胞通常会在流式细胞仪中表现出更高的PI染色信号。可以根据细胞的荧光强度和散射特性来区分正常细胞和死细胞。
Q：流式细胞仪分析结果不稳定，同样的样品反复检测得到不同的结果，怎么解决？
A：建议在每次实验前进行仪器校准，并保持实验条件的一致性，以确保结果的稳定性。
Q：PI染色实验结果中出现了荧光重叠，导致无法准确分析不同细胞群体，怎么处理？
A：可以尝试使用不同的染色剂来标记细胞，或者使用多色标记的方法来区分不同细胞群体。
Q：PI染色实验中发现细胞数量很少，无法得到准确的结果，应该怎么办？
A：可以尝试增加细胞样品的数量或者优化实验条件，以提高实验的成功率。
Q：PI染色实验结果中出现了背景自发荧光，怎么解决？
A：可以使用流式细胞仪的滤光片来排除背景自发荧光，并选择合适的激发波长和检测波长来减少干扰。
Q：细胞在流式细胞仪中聚集在一起，导致分析结果不准确，应该怎么处理？
A：可以在洗涤过程中充分分散细胞，或者尝试其他细胞分散方法来避免细胞聚集。