铁蛋白质检测仪使用方法

⑴ 常用的蛋白质含量测定方法有哪些

①凯氏定氮法
原理：蛋白质平均含氮量为16%。当样品与浓硫酸共热，蛋白氮转化为铵盐，在强碱性条件下将氨蒸出，用加有指示剂的硼酸吸收，最后用标准酸滴定硼酸，通过标准酸的用量即可求出蛋白质中的含氮量和蛋白质含量。
②双缩脲法
原理：尿素在180℃下脱氨生成双缩脲，在碱性溶液中双缩脲可与Cu2+形成稳定的紫红色络合物。蛋白质中的肽键实际上就是酰胺键，故多肽、蛋白质等都有双缩脲（biuret）反应，产生蓝色或紫色复合物。比色定蛋白质含量。
缺点：灵敏度低，样品必须可溶，在大量糖类共存和含有脯氨酸的肽中显色不好。其 精确度 较差 (数mg)，且会受样品中 硫酸铵 及 Tris 的干扰，但 准确度 较高，不受蛋白质的种类影响。
③Folin酚法(Lowry)
Folin酚法是biuret 法的延伸，所用试剂由试剂甲和乙两部分组成。试剂甲相当于双缩脲试剂（碱性铜试剂），试剂乙中含有磷钼酸和磷钨酸。
在碱性条件下，蛋白质中的巯基和酚基等可将Cu2+还原成Cu+， Cu+能定量地与Folin－酚试剂反应生成蓝色物质，600nm比色测定蛋白质含量。
灵敏度较高(约 0.1 mg)，但较麻烦，也会受 硫酸铵 及 硫醇化合物 的干扰。 步骤中各项试剂的混合，要特别注意均匀澈底，否则会有大误差。
④紫外法
280nm光吸收法：利用Tyr在280nm在吸收进行测定。
280nm-260nm的吸收差法：若样品液中有少量核酸共存按下式计算：
蛋白质浓度(mg/ml)=1.24E280-0.74E260 （280 260为角标）
⑤色素结合法（Bradford 法）
直接测定法：利用蛋白质与色素分子（Coomassie Brilliant Blue G-250）结合物的光吸收用分光光度法进行测定。
考马斯亮兰（CBG）染色法测定蛋白质含量。CBG 有点像指示剂，会在不同的酸碱度下变色；在酸性下是茶色，在中性下为蓝色。当 CBG接到蛋白质上去的时候，因为蛋白质会提供 CBG一个较为中性的环境，因此会变成蓝色。当样本中的蛋白质越多，吸到蛋白质上的CBG也多，蓝色也会增强。因此，蓝色的呈色强度，是与样本中的蛋白质量成正比。
间接测定法：蛋白质与某些酸性或碱性色素分子结合形成不溶性的盐沉淀。用分光光度计测定未结合的色素，以每克样品结合色素的量来表示蛋白质含量的多少。
⑥BCA法
BCA（Bicinchoninc acid procere，4,4’-二羧-2,2’-二喹啉）法与Lowry法相似，主要差别在碱性溶液中，蛋白质使Cu2+转变Cu+后，进一步以BCA 取代Folin试剂与Cu+结合产生深紫色，在波长562 nm有强的吸收。
它的优点在于碱性溶液中BCA 比Folin试剂稳定，因此BCA与碱性铜离子溶液结合的呈色反应只需一步骤即完成。灵敏度Lowry法相似。
本方法对于阴离子、非离子性及二性离子的清洁剂和尿素较具容忍度，较不受干扰，但会受还原糖 及EDTA的干扰。
⑦胶体金测定法
胶体金(colloidal gold)是氯金酸(chloroauric acid)的水溶胶，呈洋红色，具有高电子密度，并能与多种生物大分子结合。
胶体金是一种带负电荷的疏水胶体遇蛋白质转变为蓝色，颜色的改变与蛋白质有定量关系，可用于蛋白质的定量测定。
⑧其他方法
有些蛋白质含有特殊的 非蛋白质基团，如 过氧化物酶含有 亚铁血红素基团，可测 403 nm 波长的吸光来定量之。 含特殊金属的酶 (如镉)，则可追踪该金属。

⑵ 请专家帮我解答

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⑶ 科学小实验――蛋白质检测怎么做

检测蛋白质可以用最简单的办法就是双缩脲试剂。具体的说就是需要用0.1克每毫升的氢氧化钠和0.01克每毫升的硫酸铜溶液。在使用的时候需要先加氢氧化钠1ml。然后再滴入三到四滴硫酸铜溶液。最后在不加热的情况下会观察到蛋白质显现出紫颜色，由此可以证明蛋白质的存在。

⑷ 检测铁蛋白的方法有哪些

检测血清FER的方法有放射免疫测定法、酶免疫测定法、免疫比浊法、化学发光免疫分析法等。
目前临床主要采用免疫透射比浊法通过全自动生化仪检测和化学发光免疫分析仪进行检测。前者的检测原理是将兔抗人铁蛋白抗体交联于胶乳颗粒上，与待测样品中铁蛋白在液相中相遇，立即形成抗原抗体复合物，并形成一定浊度，与通过同样处理的校准品比较，即可计算出样品中FER的含量。该方法测定范围宽，精密度、准确度高，特异性好，是一种简单、快速、准确的自动化分析方法。
化学发光免疫分析法（以贝克曼公司ACESS全自动化学发光免疫分析仪为例）原理是采用双抗体夹心法检测待测样品中的铁蛋白，包被介质为磁性微粒子，以增大与抗原的接触面积，提高敏感性，标记的酶为ALP，底物为贝克曼研制的AMPPD，经ALP水解后可以长时间持续、稳定发光，除了有免疫透射比浊法的特异性高、精密度高、测定范围宽以外，敏感性也大大提高。

⑸ 乳铁蛋白的检测方法

原理：混有乳铁蛋白(LF) 抗原的琼脂糖倾入平板，凝冻后打一些小孔，接入LF样品。随着抗原呈放射形扩散， 在以小孔为中心的环状区域形成抗原�抗体反应沉淀带， 沉淀带在RID染色液的作用下被染色，环的直径与抗体(LF)的浓度成正比。通过标准曲线，可以测出样品中的(LF) 浓度。
操作步骤：将预涂过的玻璃板置于水平桌面上，在琼脂糖缓冲液中 加入150ml(抗血清，仔细混合后将溶液倒在玻璃板中心。表面张力可以阻止溶液溢出，必要时用试管上缘帮助溶液分散以确保溶液均匀分散到玻璃板的各边。 将凝胶在室温下固化15min，然 后置于恒湿器中在冰箱中保存1h 。将打孔器与抽真空设备连接，并利用带模板的隔板架在凝胶上 打16个小孔。用注射器小心地将12.5ml样品注入玻璃板中，将凝胶置于恒湿器中，室温下在水平桌面上放置48h后清洗凝胶。选择正确角度，2次精确测量环的直径，以此来测定LF浓度。
结果计算：每毫升LF的浓度(×10-6 ) =
式中：A为LF标准溶液(mg/mL) ；
W为质量(mg) 。

⑹ 常用生化检测项目分析方法举例及参数设置

常用生化检测项目分析方法举例及参数设置

常用生化检测项目有哪些你知道吗?你对常用生化检测项目了解吗?下面是我为大家带来的关于常用生化检测项目分析方法举例及参数设置的知识，欢迎阅读。

一、常用生化检测项目

1.终点法检测常用的有总胆红素(氧化法或重氮法)、结合胆红素(氧化法或重氮法)、血清总蛋白(双缩脲法)、血清白蛋白(溴甲酚氯法)、总胆汁酸(酶法)、葡萄糖(葡萄糖氧化酶法)、尿酸(尿酸酶法)、总胆固醇(胆固醇氧化酶法)、甘油三酯(磷酸甘油氧化酶酶法)、高密度脂蛋白胆固醇(直接测定法)、钙(偶氮砷Ⅲ法)、磷(紫外法)、镁(二甲苯胺蓝法)等。以上项目中，除钙、磷和镁基本上还使用单试剂方式分析因而采用一点终点法外，其它测定项目都可使用双试剂故能选用两点终点法，包括总蛋白、白蛋白测定均已有双试剂可用。

2.固定时间法苦味酸法测定肌酐采用此法。

3.连续监测法对于酶活性测定一般应选用连续监测法，如丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、γ谷氨氨酰基转移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。一些代谢物酶法测定的项目如己糖激酶法测定葡萄糖、脲酶偶联法测定尿素等，也可用连续监测法。

4.透射比浊法透射比浊法可用于测定产生浊度反应的项目，多数属免疫比浊法，载脂蛋白、免疫球蛋白、补体、抗"O"、类风湿因子，以及血清中的其他蛋白质如前白蛋白、结合珠蛋白、转铁蛋白等均可用此法。

二、分析参数设置

分析仪的一些通用操作步骤如取样、冲洗、吸光度检测、数据处理等，其程序均已经固化在存储器里，用户不能修改。各种测定项目的分析参数(analysisparamete)大部分也已设计好，存于磁盘中，供用户使用;目前大多数生化分析仪为开放式，用户可以更改这些参数。生化分析仪一般另外留一些检测项目的空白通道，由用户自己设定分析参数。因此必须理解各参数的确切意义。

一、分析参数介绍

(一)必选分析参数

这类参数是分析仪检测的前提条件，没有这些参数无法进行检测。

1.试验名称 试验名称(test code)是指测定项目的标示符，常以项目的英文缩写来表示。

2.方法类型(也称反应模式) 方法类型(assay)有终点法、两点法、连续监测法等，根据被检物质的检测方法原理选择其中一种反应类型。

3.反应温度 一般有30℃、37℃可供选择，通常固定为37℃。

4.主波长 主波长(primary wavelength)是指定一个与被测物质反应产物的光吸收有关的波长。

5.次波长 次波长(secondary wavelength)是在使用双波长时，要指定一个与主波长、干扰物质光吸收有关的波长。

6.反应方向 反应方向(response direction)有正向反应和负向反应两种，吸光度增加为正向反应，吸光度下降为负向反应。

7.样品量 样品量(sampling volum)一般是2μl～35μl，以0.1μl步进，个别分析仪最少能达到1.6μl。可设置常量、减量和增量。

8. 第一试剂量 第一试剂量(first regengt volum)一般是20～300μl，以1μl步进。

9. 第二试剂量 第二试剂量(second regengt volum)一般也是20～300μl，以1μl步进。

10.总反应容量 总反应容量(total reacting volum)在不同的分析仪有一个不同的规定范围，一般是180～350μl，个别仪器能减少至120μl。总反应容量太少无法进行吸光度测定。

11.孵育时间 孵育时间(incubate time)在终点法是样品与试剂混匀开始至反应终点为止的时间，在两点法是第一个吸光度选择点开始至第二个吸光度选择点为止的时间。

12.延迟时间 延迟时间(delay time)在连续监测法中样品与反应试剂(第二试剂)混匀开始至连续监测期第一个吸光度选择点之间的时间。

13.连续监测时间 连续监测时间(continuous monitoring time)在延迟时间之后即开始，一般为60～120s，不少于4个吸光度检测点(3个吸光度变化值)。

14.校准液个数及浓度 校准曲线线性好并通过坐标零点的，可采用一个校准液(calibrator);线性好但不通过坐标零点，应使用两个校准液;对于校准曲线呈非线性者，必须使用两个以上校准液。每一个校准液都要有一个合适的浓度。

15.校准K值或理论K值 通过校准得到的K值为校准K值(calibrate coefficient)或由计算得出的K值为理论K值。

16.线性范围 即方法的线性范围(linearity range)，超过此范围应增加样品量或减少样品量重测。与试剂/样品比值有关。

17.小数点位数 检测结果的小数点位数(decimal point digit)。

(二)备选分析参数

这类分析参数与检测结果的准确性有关，一般来说不设置这类分析参数，分析仪也能检测出结果，但若样品中待测物浓度太高等，检测结果可能不准确。

1.样品预稀释 设置样品量、稀释剂量和稀释后样品量三个数值，便可在分析前自动对样品进行高倍稀释。

2.底物耗尽值 底物耗尽值(substrate exhaust limit)在负反应的酶活性测定中，可设置此参数，以规定一个吸光度下降限。若低于此限时底物已太少，不足以维持零级反应而导致检测结果不准确。

3.前区检查 免疫比浊法中应用，以判断是否有抗原过剩。将终点法最后两个吸光度值的差别(ΔA)设置一个限值，如果后一点的吸光度比前一点低，表示已有抗原过剩，应稀释样品后重测。

4.试剂空白吸光度范围 超过此设定范围表示试剂已变质，应更换合格试剂。

5.试剂空白速率 连续监测法中使用，是试剂本身在监测过程中没有化学反应时的变化速率。

6.方法学补偿系数 用于校准不同分析方法间测定结果的一致性，有斜率和截距两个参数。

7.参考值范围 对超过此范围的测定结果，仪器会打印出提示。

(三)某些参数的特殊意义

1.最小样品量 最小样品量是指分析仪进样针能在规定的误差范围内吸取的最小样品量。一般分析仪的最小样品量是2μl，目前也有小至1.6μl的。在样品含高浓度代谢产物或高活性酶浓度的情况下往往需采用分析仪的最小样品量作为减量参数，从而使分析仪检测范围(与线性范围不同)的上限得以扩大。

2.最大试剂量 方法灵敏度很高而线性上限低的检测项目，如血清白蛋白的溴甲酚氯法测定，以往手工法操作时样品量10μl，试剂量4ml，这样试剂量/样品量比例(R/S)为200，线性上限则为60g/L。此法移植到分析仪上后，R/S却很难达到200，致使线性上限变低。因此对这类检测项目最大试剂量非常重要。

3.弹性速率 在酶活性测定中，当酶活性太高，在连续监测期中已不呈线性反应时，有些仪器具有弹性速率(flexrate)功能，能自动选择反应曲线上连续监测期中仍呈线性的吸光度数据计算结果，使酶活性测定的线性范围得以扩大。如AST可从1000U/L扩展至4000U/L，从而减少稀释及重测次数、降低成本。

4.试剂空白速率 当样品中存在胆红素时，胆红素对碱性苦味酸速率法或两点法测定肌酐有负干扰。因为胆红素在肌酐检测的波长505nm有较高光吸收，而且胆红素在碱性环境中可被氧化转变，因而在肌酐反应过程中胆红素的光吸收呈下降趋势。若在加入第一试剂后一段时间内设置试剂空白速率，因为此段中苦味酸尚未与肌酐反应，而胆红素在第一试剂的碱性环境中已同样被氧化转变，因而以第二试剂加入后的速率变化，减去试剂空白速率变化，便可消除胆红素的负干扰，见图7-8。

二、单波长和双波长方式

(一)概念

采用一个波长检测物质的光吸收强度的`方式称为单波长(mono-wavelength)方式。当反应液中含有一种组分，或在混合反应液中待测组分的吸收峰与其它共存物质的吸收波长无重叠时，可以选用。在吸光度检测中，使用一个主波长和一个次波长的称双波长方式。当反应液中存在干扰物的较大吸收、从而影响测定结果的准确性时，采用双波长方式更好。

(二)双波长的作用

双波长(di-wavelength)测定优点是①消除噪音干扰;②减少杂散光影响;③减少样品本身光吸收的干扰。从光源，到比色杯、单色器、检测器的整个光路系统中，均存在着随时间发生变化的不稳定的检测信号，即噪音，而双波长检测是同时进行的，两种波长检测产生的噪音基本上相同，因而能消除噪音干扰。当样品中存在非化学反应的干扰物如甘油三酯、血红蛋白、胆红素等时，会产生非特异性的光吸收，而干扰测定结果的准确性。采用双波长方式测定可以部分消除这类干扰，提高检测的准确性。

(三)次波长的确定方法

当被测物的主波长确定之后，再选择次波长。如根据甘油三酯等干扰物吸收光谱特征，选择次波长，使干扰物在主、次波长处有尽可能相同的光吸收值，而被测物在主、次波长处的光吸收值应有较大的差异。一般来说，次波长应大于主波长100nm。以主波长与次波长吸光度差来计算结果。

(四)双波长的具体应用

对于某些反应速度快且无法设置为两点终点法的分析项目，尤其是单试剂分析中，可以利用双波长的方式来部分消除样品本身的光吸收干扰。目前用单试剂法测定的项目应用双波长的为血清总蛋白(双缩脲法)主波长500nm，次波长576nm;血清白蛋白(溴甲酚氯法)主、次波长分别为600和700nm;钙(偶氮砷Ⅲ法)主、次波长分别为 660、770nm;磷(紫外比色法)主、次波长为340、405nm，镁(二甲苯胺蓝法)主、次波长为505和 600nm。

三、单试剂和双试剂方式

反应过程中只加一次试剂称单试剂方式，加两次试剂便为双试剂方式。目前的生化分析仪大多可用双试剂方式分析，其优点是：①可提高试剂的稳定性，多数双试剂混合成单一工作试剂时，其稳定时间缩短;②能设置两点终点法，来消除来自样品本身的光吸收干扰;③在某些项目检测时能消除非特异性化学反应的干扰。如血清ALT测定，血清中的内源性丙酮酸及其它酮酸也可与试剂中的指示酶(乳酸脱氢酶)起反应，使结果偏高。若先加入缺乏α-酮戊二酸的第一试剂，使其它酮酸与指示酶反应之后再加入含有α-酮戊二酸的第二试剂，启动真正的ALT酶促反应生成丙酮酸，而丙酮酸与乳酸脱氢酶的反应消耗的NAD+能真正反映ALT的活性，从而消除以上副反应的影响。

四、测定过程的自动监测

各种自动生化分析仪或多或少都具有对测定过程进行各种监测的功能，以便在没有人"监督"化学反应的情况下提高检测的准确性。高档分析仪的监测功能更强。

1.试剂空白监测 每种试剂都有一定的空白吸光度范围，试剂空白吸光度的改变往往提示着该试剂的变质：如利用Trinder反应为原理的检测试剂会因酚被氧化为醌而变为红色;碱性磷酸酶、γ-谷氨酰转移酶、淀粉酶等检测试剂会因基质分解出硝基酚或硝基苯胺而变黄;有些试剂久置后变浑浊。这些情况均可使空白吸光度升高。丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶等负反应检测项目，其试剂在放置过程中空白吸光度会因NADH自行氧化为NAD+而下降等。

试剂空白的测定方法有两种：①每瓶试剂在使用前通过对试剂空白校准来确定试剂空白吸光度，这种方式适用于先取样品后加试剂的分析仪。②每个样品测定前均检测试剂空白吸光度，适用于先加试剂后取样品的分析仪。

2.试剂空白变化速率监测 一些酶试剂在反应温度下不稳定，其空白吸光度可随着时间逐渐发生变化，这种变化的主要原因与工具酶或辅酶的纯度有关，且因试剂的组成和生产厂家的不同而不同。这种变化会影响测定结果的准确性，一般使结果偏高。如果设置此项监测，分析仪在结果计算时会自动减去试剂空白变化速率。在以监测NAD(P)H减少为指示反应的酶活性测定中，空白速率可监测并消除由NADH自身氧化所造成的吸光度下降;在色素原为底物的酶活性测定中，空白速率可监测并消除底物自身分解造成的吸光度升高。有关空白速率监测在胆红素对碱性苦味酸速率法测定肌酐负干扰消除中的作用，已如前述。

3.样品信息监测 由于样品的溶血、脂浊、黄疸会对测定结果产生非化学反应的干扰。根据溶血、脂浊、黄疸的光谱吸收特性，用双波长或多波长检测其性质和程度，一般是测定样品在600nm/570nm、700nm/660nm和505nm/480nm吸光度比值的大小来分别判断样品溶血、脂浊和黄疸程度。然后在结果计算时自动减去这部分干扰，这将有利于提高分析结果的可靠性。

4.结果可靠性监测

(1)终点监测：终点法测定要判断所选的测光点是否到达终点或平衡点。一些分析仪在所选终点后再选一个测光点，比较这两点吸光度的差异来判断反应是否到达终点。

(2)线性期监测：连续监测法选择时间-吸光度反应曲线上的线性期来计算酶活性或被测物浓度，因此仪器要确定此连续监测期是否呈线性。其监测方法为①将连续监测到的各吸光度值进行线性回归，计算出各点的方差，根据方差值的大小来判断是否呈线性;②取连续监测期开始若干点的变化速率与连续监测期最后若干点的变化速率进行比较，来判断是否为线性期。

5.底物消耗的监测 在连续监测法测定酶活性时，如果在监测期内吸光度上升或下降超过其底物耗尽值，则说明该样品酶活性非常高，底物将被耗尽，监测期的吸光度将偏离线性，使测定结果不可靠。此时不打印结果或打印结果同时也打印出底物耗尽提示，该样品应稀释一定的倍数重新测定。此监测对于采用负反应分析酶活性的方法甚为重要。见图7-9

6.方法线性范围监测 每种待测物分析都有一个可测定的浓度或活性范围，样品结果若超过此范围，分析仪将显示测定结果超过线性范围的提示，多数分析仪会自动将样品减量或增量重新测定。

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⑺ 国家标准检测蛋白质含量测定方法

蛋白质含量测定方法就是检测N元素的含量，像三聚氰胺的问题，就是通过增加N的含量使“蛋白质”含量提高的。

国家标准检测蛋白质含量的方法叫做凯氏定氮法，食物中的蛋白质在催化加热条件下分解，导致氨和硫酸结合产生硫酸铵。 碱蒸馏采用无硫，硼酸吸收，用硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定，根据酸耗计算氮含量，再乘以转化系数，即蛋白质含量。

具体操作步骤如下：

1.样品处理

精确称量0.2-2.0g固体样品或2-5g半固体样品或吸收10-20ml液体样品（约30-40mg氮当量）。将其转移至干燥的100毫升或500毫升氮气固定瓶中，加入0.2克硫酸铜，6克硫酸钾和20毫升硫酸，轻轻摇动，在瓶口放置一个小漏斗，将瓶子倾斜石棉网上有45度角，有小孔。

加热小火后，内容物碳化，泡沫完全停止，加强火力，保持瓶内液体稍微沸腾，直至液体呈蓝绿色澄清透明，然后继续加热0.5小时。取出并冷却，小心加入20毫升水，冷却，移入100毫升容量瓶中，用少量水洗净氮气瓶，洗净液放入容量瓶中，然后用水冲洗至刻度，混匀备用。

取相同量的硫酸铜，硫酸钾和浓硫酸作为试剂进行空白试验。然而，这种方法很危险，很难在实验室中证明。大多数实验室都有一个消化器，可以一次处理16个以上的样品和一个可以自行设定温度的呼吸机。它更安全，更可操作。

(7)铁蛋白质检测仪使用方法扩展阅读

除了凯氏定氮法以外，标准的测量方法还有：

• 分光光度法

食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，分解产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，在pH4.8的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氢化吡啶化合物。在波长400nm 下测定吸光度值，与标准系列比较定量,结果乘以换算系数，即为蛋白质含量。

• 燃烧法

样品在900~1200℃下燃烧。在燃烧过程中，产生混合气体。 诸如碳，硫和盐的干扰气体被吸收管吸收，氮氧化物被还原成氮。 形成的氮气流由热导检测器（TCD）检测。

⑻ 铁的测定方法有哪些

1）亚铁嗪比色法原理：血清铁和运铁蛋白结合成复合物，在酸性介质中铁从复合物中解离出来，再被还原剂还原成二价铁，并与亚铁嗪生成紫红色化合物，在波长562nm处有一吸收峰，与同样处理的标准液比较，即可求得血清铁的含量。

2）双联吡啶比色法：在酸性条件下使铁从与蛋白质结合状态中游离出来。用盐酸羟胺作还原剂使血清中三价铁还原成二价铁，后者与双联吡啶显色剂反应生成红色螫合物，在520nm处比色定量。本法简便快速，但灵敏度差，干扰因素较多，尤以铁质污染最为严重。溶血也会影响结果。

3）菲洛嗪比色法：三氯醋酸-盐酸混合液使血清中的铁从运铁蛋白中释放并使蛋白沉淀医学教|育网|收集整理。释放出来的三价铁可用硫代乙醇酸还原成二价铁，后者和菲洛嗪结合成紫红色化合物，吸收峰为562nm。

4）血清总铁结合力（TIBC）：在血清样品中加足量的铁标准液使运铁铁蛋白被铁饱和。过量的铁用MgCO3除出，离心取上清液，按测血清铁的方法求出铁的含量，即为TIBC.

⑼ 血红蛋白仪怎么用

血红蛋白的测定
[实验目的]
掌握用直接测定法和比色法测定动物的血红蛋白的含量。
[实验原理]
血红蛋白的颜色常与氧的结合量多少有关。但当用一定的氧化剂将其氧化时，可使其转变为稳定、棕色的高铁血红蛋白，而且颜色与血红蛋白（或高铁血红蛋白）的浓度成正比。可与标准色进行对比，求出血红蛋白的浓度，即每升血液中含血红蛋白克数（g·L-1）。
血红蛋白被高铁氰化钾氧化为高铁血红蛋白，后者再与氰离子结合形成稳定的氰化高铁血红蛋白（hemoglobin cyanide,HiCN）。HiCN在波长540 nm和液层厚度1cm的条件下具有一定毫摩尔消光系数。可用经校准的高精度分光光度计进行直接定量测定；或用HiCN标准液进行比色法测定，根据标本的吸光度即可求出血红蛋白浓度。
[实验对象]
动物种类不限。
[实验药品]
HiCN转化液（Van Kampen-Zijlstra液，文齐氏液※，标准商品）或1%HCl、HiCN标准液（200 g·L-1，标准商品）、蒸镏水、95%酒精、乙醚、75%酒精.
[仪器与器械]
血红蛋白计（或分光光度计）或沙里氏血红蛋白计、小试管、刺血针或注射器，微量采血管，干棉球。
[实验方法与步骤]
1.使用血红蛋白计直接定量测定
（1）XK-2血红蛋白仪板面结构如图 (6.2-1)：

（2）仪器的标定
①板面后的电源开关置于断。仪器的底部的支撑架打开。
②打开电源开关，选择键处于测试挡。
③按一下进样键，将蒸溜水吸入，预热30 min
④预热后将文齐试剂吸入，仔细调“调零旋钮”使显示屏上的数字显示为零。
⑤校正：吸入标准液(仪器配带有)后，缓缓旋转校正旋钮使显示屏上数字显示为已知的标准液的数值。定标即结束。以后调零和校正旋钮均不能动。
（3）在小试管中事先加入HiCN转化液(文齐氏液)5 ml。
（4）取血：可吸取从动物的指（尾）端流出的第二滴血，也可取静脉血和心脏血。用拇指和食指轻轻捏扁采血管的乳胶头，将采血管的一端水平接触血滴（若是抗凝血，须注意摇匀后再吸取），轻轻缓慢地松开拇指，利用虹吸现象使血液进入微量采血管至20 μl（第2个刻度）。用棉球擦去微量采血管尖端外周的血液。
（5）血红蛋白转化为氰化高铁血红蛋白：将微量采血管插入小试管HiCN转化液中，置血液于管底，再吸上清液2～3次，洗尽采血管内的残存的血液。用玻棒轻轻搅动管内血液，使之与HiCN转化液混匀。试管须静止5 min。
(6)将混合后的血液吸入血红蛋白仪，显示屏上的数字即为测定值，需稳定后方可读数(g·L-1)。
2.使用HiCN标准液比色法测定
（1）标准曲线绘制和K值计算：将标准HiCN液按梯度50 g·L-1、100 g·L-1、150 g·L-1、200 g·L-1进行稀释后（以此代表标准的血红蛋白浓度梯度），在波长540 nm、光径1.0cm条件下，分别测定各稀释液的吸光度(例如分别测得0.13、0.27、0.405、0.54)，以标准品血红蛋白含量为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。或求出换算常数K。

（2）以上述同样的方法取血，并使血红蛋白转化为氰化高铁血红蛋白。然后以转化液作空白，测定标本吸光度A。
（3）通过标准曲线查出待测样本的血红蛋白浓度或用K值来计算血红蛋白浓度，即
Hb（g·L-1）=K×A (6.2-2)
3.使用沙里氏血红蛋白计测定
沙里氏比色法是用HCl使血红蛋白酸化形成棕色的高铁血红蛋白，然后和标准比色板进行比色。
（1）沙里血红蛋白计 主要具有标准褐色玻璃比色箱和1只方形刻度测定管组成。比色管两侧通常有两行刻度；一侧为血红蛋白量的绝对值，以g·dl-1(每100 ml血液中所含血红蛋白的克数)表示，从2～22 g；另一侧为血红蛋白相对值，以%（即相当于正常平均值的百分数）来表示，从10%～160%。为避免所使用的平均值不一致，因此一般采用绝对值来表示。
（2）具体测定方法如下：
①用滴管加5～6滴，0.1mol·L-1 HCl到刻度管内,(约加到管下方刻度”2”或多或10%处)。
②用微量采血管吸血至20 μl(方法同上述)，仔细揩去吸管外的血液。
③将吸血管中的血液轻轻吹到比色管的底部，再吸上清液洗吸管3次。操作时勿产生气泡,以免影响比色。用细玻棒轻轻搅动，使血液与盐酸充分混合，静置10 min，使管内的盐酸和血红蛋白完全作用，形成棕色的高铁血红蛋白。
④把比色管插入标准比色箱两色柱中央的空格中。
⑤使无刻度的两面位于空格的前后方向，便于透光和比色。用滴管向比色管内逐滴加入蒸馏水，并不断搅匀，边滴，边观察、边对着自然光进行比色，直到溶液的颜色与标准比色板的颜色一致为止。
⑥读出管内液体面所在的克数，即是每100 ml血中所含的血红蛋白的克数。比色前，应将玻棒抽出来，其上面的液体应沥干净，读数应以溶液凹面最低处相一致的刻度为准。换算成每升血液中含血红蛋白克数（g·L-1）。
[注意事项]
1.取血前要做好充分的消毒。
2.血液要准确吸取20 μl，若有气泡或血液被吸入采血管的乳胶头中都应将吸管洗涤干净，重新吸血。洗涤方法是：先用清水将血迹洗去，然后再依次吸取蒸馏水、95%酒精、乙醚洗涤采血管1～2次，使采血管内干净、干燥。作为学生练习，微量采血管可反复使用。
3.使用血红蛋白仪测定时，吸样管应插入试管底部，避免吸入气泡，否则会影响测试结果。仪器连续使用时，每隔4小时要观察一次零点，即吸入文齐试剂，用“调零旋钮”使仪器恢复到零点。仪器用完后，关机前要用清洗液清洗。否则会影响零点的调整。
[实验结果]
报告该实验动物的血红蛋白浓度。并将全班的结果加以统计,用平均值±标准差表示。
[思考题]
血红蛋白的含量与年龄的关系？
影响血红蛋白含量的主要因素？
[附]：
※1.HiCN转化液：即文齐氏液，有标准商品出售。也可配制： 高铁氰化钾(K3Fe（CN）6)200 mg，氰化钾（KCN）50 mg，无水磷酸二氢钾（KH2PO4）140 mg，Triton X-100 1.0 ml，蒸馏水加至1000 ml。过滤后为淡黄色透明液体，pH 7.0～7.4，置有色瓶中加盖、冷暗处保存。如发现试剂变绿、变浑浊则不能使用。
2.用分光光度计直接测定血红蛋白
（1）取血、血红蛋白转化和比色同前述1、2的方法，得到标本的吸光度A。
（2）根据标本吸光度A直接计算出血红蛋白浓度：

式中 A：为波长540nm处标本吸光度。
44：为HiCN在波长540nm，光径1.0cm条件下的毫摩尔消光系数（L· mmol-1· cm-1）。
64485（mg）：为Hb的毫克分子量，即1 mmol·L-1 Hb溶液中的Hb毫克数。
1000：为将mg转变为g。
251：为血液稀释倍数。
因是通过分光光度计比色直接计算出血红蛋白浓度，因此分光光度计的波长和光程必须准确、灵敏度要高、线性好、无杂光，否则会影响结果的准确性。故仪器的校正在测定中十分重要。
上述介绍的几种方法中，以分光光度计直接测定和比色法测定血红蛋白较为精确，但对分光光度计的精密程度要求较高，分光光度计校正起来较为麻烦。沙里氏血红蛋白计测定操作简便适于基层单位，但准确性稍差。血红蛋白计操作较为简便，因有标准的商品试剂出售，因此也比较精确，目前普遍被医疗单位使用。

⑽ 测定蛋白质分子量的常用方法

蛋白定量的测试方法有很多种，其中较为常见的有五种，分别是Bradford法、Bradford斑点试验、Coomassie 斑点试验、紫外分光度检测法及BCA法这五种。

在生化实验中，对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析，是经常进行的一项非常重要的工作。蛋白质是一种十分重要的生物大分子，它的种类很多，结构不均一，分子量又相差很大，功能各异，这样就给建立一个理想而又通用的蛋白质定量分析的方法带来了许多具体的因难。

(10)铁蛋白质检测仪使用方法扩展阅读

蛋白定量分析也就涉及到生产科研的多个领域及行业，也是生物学科、食品检验及掺假掺伪、临床检验、诊断疾病和质量检验中最常见的方法。

蛋白定量是生物学实验不可缺少的一部分。为验证细胞裂解是否成功，或为了将多个样品进行平行实验比较或标准化保存，需对细胞裂解液进行蛋白定量。

为了判定蛋白的产量，需对纯化好的蛋白进行定量。为了将纯化好的蛋白用生物素或者报告酶进行标记，同样需首先对蛋白样品进行定量，以保证标记反应在适当的化学浓度下进行。