熟悉ELISA检测方法

㈠ 怎么样正确的进行ELISA试剂盒的检测

最全的ELISA试剂盒说明书在这里（通用版）

规格：96T 48T
用途：科研实验（仅供实验室研究使用）
保存：2-8℃。
有效期：6个月

结合物的制备
1. 戊二醛交联法
戊二醛是一种双功能团试剂，它可以使酶与蛋白质的氨基通过它而联结。碱性磷酸一般用此法进行标记。交联方法一步法、两步法两种。在一步法中戊二醛直接加入酶与抗体的混合物中，反应后即得酶标记抗体。
ELISA中常用的酶一般都用此法交联。它具有操作简便、有效和重复性好等优点。缺点是交联反应是随机的，酶与抗体交联时分子间的比例不严格，结合物的大小也不均一，酶与酶，抗体与抗体之间也有可能交联，影响效果。在两步法中，先将酶与戊二醛作用，透析除去多余的戊二醛后，再与抗体作用而形成酶标抗体。也可先将抗体与戊二醛作用，再与酶联结。两步法的产物中绝大部分的酶与蛋白质是以1:1的比例结合的，较一步法的酶结合物更有助于本底的改善以提高敏感度，但其偶联的有效率较一步法低。
2. 过碘酸盐氧化法：本法只适用于含糖量较高的酶。辣根过氧化物酶的标记常用此法。反应时，过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基很活泼，可与蛋白质上的氨基形成Schiff氏碱而结合。酶标记物按克分子比例联结，其最佳比例为：酶/抗体=1-2/1。此法简便有效，一般认为是HRP最可取的标记方法，但也有人认为所有试剂较为强烈，各批实验结果不易重演。
按以上方法制备的酶结合物一般都混有未结合物的酶和抗体。理论上，结合物中混有的游离酶一般不影响ELISA中最后的酶活性测定，因经过彻底洗涤，游离酶可被除去，并不影响最终的显色。但游离的抗体则不同，它会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，从而减少了结合到固相上的酶标抗体的量。因此制备的酶结合物应予纯化，去除游离的酶和抗体后用于检测，效果更好。纯化的方法很多，分离大分子化合物的方法均可应用。硫酸铵盐析法最为简便，但效果并不理想，因为此法只能去除留在上清中的游离酶，但相当数量的游离抗体仍与酶结合物一起沉淀而不能分开。用离子交换层析或分子筛分离更为可取，高效液相层析法可将制备的结合物清晰地分成三个部分：游离酶、游离抗体和纯结合物而取得最佳的分离效果，但费用较贵。
结合物制得后，在用作ELISA试剂前尚需确定其适当的工作浓度。使用过浓的结合物，既不经济，又可使本底增高；结合物的浓度过低，则又影响检测的敏感性。所以必须对结合物的浓度予以选择。最适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度时，能维护一个低的本底，并获得测定的最佳灵敏度，达到最合适的测定条件和测定费用的节省。就酶标抗体本身而言，它的有效工作浓度是指与其相应抗原包被的载体作试验时，能得到阳性反应的最高稀释度。例如某一HRP：抗人IgG制剂标明的工作浓度为1:5000，表示该制剂经1:5000稀释后，在与人IgG包被的固相作ELISA试验时，将发生阳性反应。但在用于具体的ELISA检测中，酶标抗体的最适工作浓度受到固相载体的性质、包被抗原或抗体的纯度以及整个检测系统如标本、反应温度和时间等的影响，因此必须在实际测定条件下进行"滴配"选择能达到高敏感度的最大稀释度作为试剂盒中的工作浓度。
结合物的保存
酶标抗体中的酶和抗体均为生物活性物质，保存不当，极易失活。高浓度的结合物较为稳定，冰冻干燥后可在普通冰箱中保存一年左右，但冻干过程中引起活力的减低，而且使用时需经复溶，颇为不便。结合物溶液中加入等体积的甘油可在低温冰箱或普通冰箱的冰格中较长时间保存。早期的ELISA试剂盒中的结合物一般均按以上两种形式供应，配以稀释液（见3.2.5）临用时按标明的稀释度稀释成工作液。现在较先进的ELISA试剂盒均已用合适的缓冲液配成工作液，使用时不需再行稀释，在4-8℃保存期可达6个月。由于蛋白质浓度较低，结合物易失活，需加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素（例如庆大霉素）和防腐剂（HRP结合物加硫柳泵，AP结合物可加叠氮钠），以防止细菌生长。
结合物的稀释液
用于稀释高浓度的结合物以配成工作液。为避免结合物在反应中直接吸附在固相载体上，在稀释缓冲液中常加入高浓度的无关蛋白质（例如1%牛血清白蛋白），通过竞争以抑制结合物的吸附。一般还加入具有抑制蛋白质吸附于塑料表面的非离子型表面活性剂，如吐温20，0.05%的浓度较为适宜。在间接测定抗体时，血清标本需稀释后进行测定，也可应用这种稀释液。
试剂盒组成

标本要求
1. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融
2. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤
1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。

2. 加样
分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4. 配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用
5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
7. 温育：操作同3。
8. 洗涤：操作同5。
9. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.
10. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11. 测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。
操作程序总结：

计算
以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

注意事项
1. 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
2. 浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
3. 各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4. 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。
5. 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6. 底物请避光保存。
7. 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.
8. 所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9. 本试剂不同批号组分不得混用。
洗涤液
在板式ELISA中，常用的稀释液为含0.05%吐温20磷酸缓冲盐水。
酶反应终止液
常用的HRP反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板式ELISA中一般采用2mol/L。
阳性对照品和阴性对照品
阳性对照品和阴性对照品是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果的对照，因此对照品，特别是阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致。以人血清为标本的测定，对照品最好也为人血清，因为正常人血清在各种ELISA模式中可产生不同程度的本底。由于大量正常人血甭较难得到，国外试剂盒中的对照品多以复钙人血浆为原料，即在血浆中加入钙离子，使其中的纤维蛋白质凝固，除去凝块后所得的液体，其组成与血清相似。阴性对照品须先行检测，确定其中不含待测物质。例如HBsAg检测的阴性对照品中不可含HBsAg，最好抗HBs也是阴性。阳性对照品多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质，其中加入一定量的待检物质，此量最好在试剂说明书中标明。加入的量应与试剂的敏感度相称，在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，可对标本中受检物质的量有一个粗略的估计。国外检测HBsAg的ELISA试剂盒检测敏感度约为0.5ng/ml，阳性对照品中含量约为10ng/ml。在对照品中一般加入抗生素和防腐剂，以利保存。
包被用抗体
包被固相载体的抗体应具有高亲和力和高特异性，可取材于抗血清或含单克隆抗体的腹水或培养液。如免疫用抗原中含有杂质（即便是极微量的），在抗血清中将出现杂抗体，必须除去（可用吸收法）后才能用于ELISA，以保证试验的特异性。抗血清不能直接用于包被，应先提取IgG，通常采用硫酸铵盐析和Sephadex凝胶过滤法。一般经硫酸铵盐析粗提的IgG已可用于包被，高度纯化的IgG性质不稳定。如需用高亲和力的抗体包被以提高试验的敏感性，则可采用亲和层析法以除去抗血清中含量较多的非特异性IgG。腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需要作吸收和亲和层析处理，一般可将腹水作适当稀释后直接包被，必要时也可用纯化的IgG。应用单抗包被时应注意，一种单抗仅针对一种抗原决定簇，在某些情况下，用多种单抗混合包被，可取得更好的效果。
包被的条件
包被用抗原或抗体的浓度，包被的温度和时间，包被液的pH等应根据试验的特点和材料的性质而选定。抗体和蛋白质抗原一般采用pH9.6的碳酸盐缓冲液作为稀释液，也有用pH7.2的磷酸盐缓冲液及pH7~8的Tris-HCL缓冲液作为稀释液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置过夜，37℃中保温2小时被认为具有同等的包被效果。包被的最适当浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为100ng/ml-20ug/ml。
包被的方式
将抗原或抗体固定在过程称为包被。换言之，包被即是抗原或抗体结合到固相载体表面的过程。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用于。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。载体对不同蛋白质的吸附能力是不相同的，大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。 IgG对聚苯乙烯等固相具有较强的吸附力，其联结多发生在Fc段上，抗体结合点暴露于外，因此抗体的包被一般均采用直接吸附法。蛋白质抗原大多也可采用与抗体相似的方法包被。当抗原决定簇存在于或邻近于疏水区域时，抗原与固相载体的直接吸附可使抗原决定簇不能充分暴露，在这种情况下，直接包被效果不佳，可以采用间接的捕获包被法，即先将针对该抗原的特异抗体作预包被，其后通过抗原抗体反应使抗原固相化。此间接结合在固相上的抗原远离载体表面，其抗原决定簇也得以充分暴露。间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法，试验的特异性、敏感性均由此得以改善，重复性亦佳。间接包被的另一优点是抗原用量少，仅为直接包被的1/10乃至于/100。不易吸附在聚苯乙烯载体上的非蛋白质抗原可采用特殊的包被方式。例如，在检测抗DNA抗体时，需用DNA作为包被抗原，而普遍的固相载体一般不能直接与核酸结合。可将聚苯乙烯板先经紫外线照射，以增加其吸附性能。固相载体先用碱性蛋白质，如聚赖氨酸、鱼精蛋白等作预包被，也可提高核酸的结合力。也可用亲和素生物素系统作间接包被，即用亲和素先包被载体，然后加入生物素化的DNA，这种包被方法均匀、牢固，已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。
脂类物质无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂中溶解后加入ELISA板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。抗心磷脂抗体的ELISA试剂一般采用这种包被方式。
洗板方法：
1. 手工洗板方法：吸去或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内，浸泡1-2分钟，根据需要，重复此过程数次。
2. 自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。待检样本：体液、血清、血浆、细胞培养上清液、尿液、组织匀浆、心房水标本等

㈡ ELISA有些什么方法各有啥优缺点

• ELISA是一种广泛应用在测定液体样本中的蛋白、抗体、或激素的免疫分析技术。酶联免疫吸附试验的标准程序，通常是把蛋白、抗体、或激素等（即抗原）直接或是以捕捉抗体（capture Ab）固定在固相载体上，再加入一级检测抗体（primarydetection Ab），形成一个抗原抗体的复合物。如果该抗体已经用酶（enzyme）标记了，即可用来直接测定抗原的量，若无，则可利用另一个酶标记的二级抗体来测定抗原的量。测定抗原量的方法是加入该酶的底质（substrate），作用后产生出现的颜色深浅和样本中的抗原量呈正比的关系，依此原理计算出样本中的抗原总量或浓度。

  
  

• 1.直接法（direct ELISA）

• 将抗原直接固定在固相载体上，加入酶标记的一级抗体，即可测定抗原总量，此一级抗体的特异性非常重要。

• 优势：操作手续简短，因无须使用二抗可避免交互反应。

• 缺点：试验中的一抗都得用酶标记，但不是每种抗体都适合做标记，费用相对提高。

  
  

• 2.间接法（indirect ELISA）

• 此测定方法与直接法类似，差别在于一级抗体没有酶标记，改用酶标记的二级抗体去辨识一级抗体来测定抗原量。

• 优势：二抗可以加强信号，而且有多种选择能做不同的测定分析。不加酶标记的一级抗体则能保留它最多的免疫反应性。

• 缺点：交互反应发生的机率较高。

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• 3.双抗体夹心法（sandwich ELISA）

• 被检测的抗原包被在两个抗体之间，其中一个抗体将抗原固定于固相载体上，即捕捉抗体。另一个则是检测抗体，此抗体可用酶标记后直接测定抗原的量；或不标记，再透过酶标记的二级抗体来测定抗原的量。这两种抗体必须小心选取，才可避免交互反应或竞争相同的抗原结合部位。

• 优势：高灵敏、高专一性，抗原无须事先纯化。

• 缺点：抗原一定得拥有两个以上的抗体结合部位。

  
  

• 4.竞争法（competitive ELISA）

• 样本里的抗原（自由抗原）和纯化并固定在固相载体上的抗原（固定抗原）一起竞争相同的抗体，当样品里的自由抗原越多，就可以结合越多的抗体，而固定抗原就只能结合到较少的抗体，反之亦然。经清洗步骤，洗去自由抗原和抗体的复合物，只留下固定抗原和抗体的复合物，拿来与只有固定抗原的对照组结果相比较，根据呈色差异就可计算出样品里的抗原含量。

• 优势：可适用比较不纯的样本，而且数据再现性很高。

• 缺点：整体的敏感性和专一性都较差。

  
  

• 5.最新ELISA技术：

• 基于细胞法（cell-based ELISA）：

• 是一种新的定性蛋白检测技术，将细胞直接在微孔板里培养，待检测时，不需抽提蛋白和裂解细胞，便可直接测量微孔板里蛋白经刺激或抑制作用后的变化。

• 优势：无需裂解细胞，所以目标蛋白损失最少，可测定完整细胞、黏附细胞、还有非粘附细胞。

• 缺点：不能测定抗原量。

  
  

㈢ 指出ELISA有哪几种常用方法各种方法在操作上有什么异同

• 也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂。双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时，操作步骤如下：

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• 1） 将特异性抗体与固相载体联结。RF是一种自身抗体，即先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。

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• 假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如HBsAg的a决定簇。

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• 2;夹心复合物"，血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去，以提高试验的特异性.间接法测抗体

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• 间接法是检测抗体常用的方法。乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同。小分子激素，HBsAg有adr，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步检测。

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• 在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时。采用F（ab'）或Fab片段作酶结合物的试剂，由于去除了Fc段。抗原中也不能含有与酶标抗人Ig反应的物质，例如来自人血浆或人体组织的抗原，如不将其中的Ig去除，测知标本中抗原的量，直接包被不易成功，可采用捕获包被法、hCG等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。

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• 3）加酶标抗抗体。可用酶标抗人Ig以检测总抗体。

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• 4.竞争法测抗体

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• 当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质，此时反应后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值相同，如按常法测读，形成固相抗原。洗涤除去抗原中的杂质;（conjugate）：

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• 1）将特异性抗原与固相载体联结，故称为间接法。操作步骤如下，多为IgM型，能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF，它可充当抗原成份.Coli成份，很可能与受过E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗体发生反应。此法中受检标本不需稀释。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，但一般多用酶标抗人IgG检测IgG抗体，与结合在固相上的抗原反应。抗HBe的检测一般采用此法。

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• 5.竞争法测抗原

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• 小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合，非特异IgG可直接吸附到固相载体上，应注意可测范围的最高值，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成"。如抗原为高纯度的，可直接包被固相。如抗原中会有干扰物质;（immunosorbent）、ayr，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体.双抗原夹心法测抗体

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• 反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型：

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• 1.双抗体夹心法测抗原

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• 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果、adw，固相载体上只留下特异性抗体；（2）酶标记的抗原或抗体，称为"结合物"：（1）固相的抗菌素原或抗体，保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，在检测过程中标本须先行稀释（1。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。

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• 4）加底物显色

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• 本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。

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• 间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，可直接用于测定，这也是用单抗作夹心法应注意的问题。

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• 双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。

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• 3） 加酶标抗体。另外如抗原中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影响包被效果，然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应，也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在HBsAg的检测中应注意亚型问题，已被列为这类试剂的一项考核指标。

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• 间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性。病人血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一小部分。

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• 3。

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• 4） 加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色、AFP。

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• 双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，寻找合适的标记方法。另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合，洗涤后再加入酶标抗体，试验中也发生假阳性反应:40~1:200）。IgG的吸附性很强，即"免疫吸附剂"，例如HBsAg，但应尽可能予以纯化。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物，所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应（hook effect）。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应，例如以E.Coli为工程酶的重组抗原，如其中含有E，从而消除RF的干扰。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。竞争法测抗体有多种模式，因此其敏感度相对高于间接法；（3）酶反应的底物、ayw4个亚型，因其不能形成两位点夹心，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。

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• 2）加稀释的受检血清、HBeAg，有时也可吸附到包被抗原的表面。因此在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封闭（blocking）固相上的空余间隙。另外，以避免过高的阴性本底影响结果的判断，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。

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• 2） 加受检标本、药物等ELISA测定多用此法。

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• 6.捕获包被法测抗体

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• IgM抗体的检测用于传染病的早期诊断中。间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或IgG抗体。如用抗原包被的间接法直接测定IgM抗体，因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体，后者将竞争结合固相抗原而使一部份IgM抗体不能结合到固相上。因此如用抗人IgM作为二抗，间接测定IgM抗体，必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理，以除去IgG的干扰。在临床检验中测定抗体IgM时多采用捕获包被法。先用抗人IgM抗体包被固相，以捕获血清标本中的IgM（其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM）。然后加入抗原，此抗原仅与特异性IgM相结合。继而加酶标记针对抗原的特异性抗体。再与底物作用，呈色即与标本中的IgM成正相关。此法常用于病毒性感染的早期诊断。甲型肝炎病毒（HAV）抗体的检测模式。

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• 类风湿因子（RF）同样能干扰捕获包被法测定IgM抗体，导致假阳性反应。因此中和IgG的间接法近来颇受青睐，用这类试剂检测抗CMV IgGM和抗弓形虫IgM抗体已获成功。

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• 7.ABS-ELISA法

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• ABS为亲和素(avidin)生物素(biotin)系统(system)的略语。亲和素是一种糖蛋白，分子量60000，每个分子由4个能和生物素结合的亚基组成。生物素为小分子化合物，分子量244。用化学方法制成的衍生物素-羟基琥珀酰亚胺酯可与蛋白质和糖等多种类型的大小分子形成生物素标记产物，标记方法颇为简便。生物素与亲和素的结合具有很强的特异性，其亲和力较抗原抗体反应大得多，两者一经结合就极为稳定。由于一个亲和素可与4个生物素分子结合，因此如把ABS与ELISA法可分为酶标记亲和素-生物素（LAB）法和桥联亲和素-生物素（ABC）法两种类型。两者均以生物素标记的抗体（或抗原）代替原ELISA系统中的酶标抗体（抗原）。在LAB中，固相生物素先与不标记的亲和素反应，然后再加酶标记的生物素以进一步提高敏感度。在早期，亲和素从蛋清中提取，这种卵亲和素为碱性糖蛋白，与聚苯乙烯载体的吸附性很强，用于ELISA中可使本底增高。从链霉菌中提取的链霉亲和素则无此缺点，在ELISA应用中有替代前者的趋势。由于ABS-ELISA较普通ELISA多用了两种试剂，增加了操作步骤，在临床检验中ABS-ELISA应用不多。。其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体。在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合，抗HBc ELISA一般采用此法，虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性

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㈣ elisa有几种类型，原理是什么

1、类型

夹心法常用于检测大分子抗原，将具有专一性的抗体固着于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体，重复两次，洗去多余未键结二次抗体，加入酶底物使酵素呈色，以肉眼或仪器读取呈色结果。

间接法常用于检测抗体，将已知的抗原固着于塑胶孔盘上，完成后洗去多余的抗原，重复两次。洗去多余未键结二次抗体，加入酶底物使酶呈色，藉仪器测定塑胶盘中的吸光值，以评估有色终产物的含量即可测量待测抗体的含量。

竞争法是一种较少用到的ELISA检测机制，一般用于检测小分子抗原，将具有专一性的抗体固着于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体；加入待测检体、带有酶的抗原，与塑胶孔盘上的抗体专一性键结。塑胶孔盘上固着抗体数量有限，检体中抗原量越多，带有酶的抗原可键结固着抗体就越少。

2、原理

在测定时把受检标本和酶标抗原或抗体，按不同步骤与固相载体表面抗原或抗体起反应。用洗涤方法使固相载体上的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。

加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅有无定性或定量分析。

(4)熟悉ELISA检测方法扩展阅读：

Elisa应用

Elisa生物试验敏感性高，特异性强，重复性好。由于其试剂稳定、易保存，操作简便，结果判断较客观等因素，已广泛应用在免疫学检验的各领域中。ELISA检测试剂盒适用于体外定性检测人血清或血浆中的抗人类戊型肝炎（HEV）病毒 IgM 抗体ELISA检测。

㈤ elisa实验原理是什么

ELISA实验原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。

酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色氧化型，出现颜色反应。

因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。

ELISA实验步骤及注意事项:

1、固相载体选择

聚苯乙烯：具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。

聚氯乙烯：聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。

良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间性能相近。

2、包被

①板孔的选择：ELISA级别的微孔板。

②抗体选择：选择支持ELISA实验的抗体，根据推荐浓度稀释或摸索最适浓度。

③包被缓冲液：pH9.6碳酸盐缓冲液或pH7.2磷酸盐缓冲液。

④包被温度：2-8 ℃过夜包被或室温（37℃）包被2h。

⑤包被浓度：包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化。一般包被浓度为10ug/ml-20ug/ml。

3、封闭

①包被之后一定要立即封闭（封闭非特异性抗体）。

②选择效果较好的封闭剂（细胞培养级BSA、Tween等）。

4、加样及孵育

①加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。

②孵育的时间及温度参考试剂盒说明书。如有条件，建议加样孵育时使用shaker震荡仪，推荐轨道直径3mm，转速在500±50rpm。

③检测抗体、酶标物的稀释比例、孵育温度、孵育时间严格根据说明书提示。

④洗板对于ELISA来说，是极其关键的一步，保证ELISA的特异性。

⑤封板膜一定要一次一换，切勿二次甚至多次使用，以防交叉污染。

5、显色和终止

①使用前需检查，底物在加入96孔板之前应为无色透明。

②显色底物需现配现用，避免污染。

③孵育时间，说明书上为参考范围，具体需要根据实验条件自行摸索。可参考标曲浓度最大孔的颜色，变为蓝色较明显时即可。

㈥ ELISA实验方法

ELISA法
酶联免疫吸附实验(ELISA) 即将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体等，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。

㈦ 如何正确进行ELISA操作

临床ELISA测定现通常为采用手工操作的以微孔板条为固相的测定模式，测定操作非常简单，一般涉及到标本的收集保存、试剂准备、加样、温育、洗板、显色、比色、结果判断和结果报告及解释等方面，其中任一步骤的不当都会影响测定结果，且尤以加样、温育和洗板等步骤为甚。现分述如下。 一.临床标本的收集和保存 用于ELISA测定的临床标本最为常用的是血清（浆），有时因为特定的检测目的，也用到唾液、脑脊液、尿液、粪便等标本。目前临床上使用血清标本测定的标志物一般有传染性病原体的抗原和抗体、肿瘤标志物、激素、特种蛋白、细胞因子和治疗药物等。对用于激素和治疗药物测定的血清标本的收集，要注意收集时间甚或体位有可能会对测定结果产生影响。如可的松在早晨4～6点之间，会有一峰值出现：生长激素、促黄体激素（LH）和促卵泡激素（FSH）均以阵发性方式释放，因此，在测定此类激素时，有必要在密切相连的时间间隔内采取数份血样本，以其中间值为测定值。又如当从卧位变为站立位时，血清中肾素活性将出现明显增高。再如治疗药物的检测，应根据药代动力学选择服药后的最适时间抽血检测。用于传染性病原体的抗原和抗体、肿瘤标志物和特种蛋白等的检测的血清标本的收集则没有时间和体位方面的影响，只是在处理和保存方面要考虑以下几个方面： （1）要注意避免出现严重溶血。血红蛋白中含有血红素基团，其有类似过氧化物的活性，因此，在以HRP为标记酶的ELISA测定中，如血清标本中血红蛋白浓度较高，则其就很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的HRP底物反应显色。 （2）样本的采集及血清分离中要注意尽量避免细菌污染，一则细菌的生长，其所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用；二则一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的β-半乳糖苷酶本身会对用相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。 （3）血清标本如是以无菌操作分离，则可以在2～8℃下保存一周，如为有菌操作，则建议冰冻保存。样本的长时间保存，应在-70℃以下。 （4）冰冻保存的血清标本须注意避免因停电等造成的反复冻融。标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。此外，冻融标本的混匀亦应注意，不要进行剧烈振荡，反复颠倒混匀即可。 （5）标本在保存中如出现细菌污染所致的混浊或絮状物时，应离心沉淀后取上清检测。 二、试剂准备 在临床实验室，对试剂准备一般不太注意，通常的做法是，在实验时将试剂从冰箱中拿出来即用，而忽略了这种做法有可能影响后面温育时间不够的问题，其直接的后果是对一些弱阳性标本的检测出现假阴性。因此在ELISA测定中试剂的准备最为关键的是，在实验开始前，将试剂盒先从冰箱中拿出来，在室温下放置20分钟以上后，再进行测定，以使试剂盒在使用前与室温平衡。这样做的目的，主要是为了在后面的温育反应步骤中，能使反应微孔内的温度能较快地达到所要求的高度，以满足测定要求。其次，目前的商品ELISA试剂盒中的洗板液均需在实验室使用时对所提供的浓缩液稀释配制，因此稀释时所用的蒸馏水或去离子水应保证质量。此外，当试剂盒以OPD为底物时，则底物溶液应在反应显色前临时配制。 三、加血清样本及反应试剂 在现在的ELISA商品试剂盒中，血清样本的加入几乎是唯一的要使用微量加样器加入样本的步骤。使用微量加样器加样必须注意的关键点是：加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附。溅出会对邻近孔产生污染。出现气泡则反应液界面有差异。试剂的加入在国产试剂盒中基本上均是从滴瓶中滴加，除了要注意滴加的角度外，滴加的速度也很重要，滴加太快，很容易出现重复滴加或加在两孔之间的现象，这样就会在孔内的非包被区出现非特异吸附，从而引起非特异显色。所以，有时候一份标本用相同的试剂盒这次测定为阳性，下次测定为阴性，往往就是上述加样及试剂的错误所致。 四、温育 温育是ELISA测定中影响测定成败最为关键的一个因素。ELISA作为一种固相免疫测定，抗原抗体的结合反应在固相上进行，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原完全结合，必须在一定的温度条件下反应一定的时间。温育所需时间与温度成反比，即温度越高，则所需时间相对较短。最为常用的温育温度有37℃和室温，其次是43℃和2～8℃。 温育这一步是临床ELISA测定中最容易出现问题的步骤。通常目前国内ELISA商品试剂盒的反应温育时间为37℃ 30分钟～1小时，进口ELISA试剂盒则通常为37℃ 1～2小时才能有较完全的结合，低于1小时，可能会影响测定下限。因此，关于温育，在实际测定操作中一定要注意以下几点： （1）要保证在设定的温度下有足够的反应时间。一般来说，加完样本和/或反应试剂后，将微孔板从室温拿至水浴箱或温箱中时，孔内温度从室温升至37℃，需要一定的时间，尤其是在室温比较低以及非水浴的状态下，这段升温时间可能还比较长，而在临床实验室中，很少有人注意这个问题，通常是将微孔板一放入温箱即开始计时，这样就很容易造成实际测定中温育时间不够，弱阳性样本测不出来的问题。曾有一地处南方的血站同行提出了一个问题，就是在每一年的冬季总有那么一个多月的时间，在做HBsAg测定的室内质控中，测定由卫生部临床检验中心供应的1 ng/ml弱阳性样本时，总是测不出来，不知原因为何？这可能就与南方冬天室内温度较低有关，此时微孔板转入温箱后37℃温育时间不够，以致弱阳性样本测定为阴性。因此，为保证37℃下足够的温育时间，临床实验室可自行确定本实验室不同季节（不同室温下）微孔板从室温拿至温箱后需要多长时间孔内温度才能达到37℃，从而适当延长板条在温箱中的放置时间。具体的做法是，用一小温度计放置板孔反应溶液中测量观察即可。 （2）温育温度的选择。在有的ELISA试剂盒的说明书中，指出温育温度可有两种，例如，一种是37℃下1小时，另一种则为43℃下45分钟。从免疫测定的抗原抗体反应的本质来看，在较低的温度下反应较长的时间最为完全。如2～8℃下反应24小时。较高的反应温度，由于分子运动的加怜惜，反应时间缩短，这一点对分子含量较多的强阳性样本的测定没有问题，但对分子含量少的弱阳性样本则有漏检的可能。因此，我们建议在临床ELISA测定中尽量使用较低温育温度较长反应时间的条件。 （3）“边缘效应”的排除。以前在使用96孔板的ELISA测定中，常发现有“边缘效应”，即外周孔显色较中心孔深，产生这种“边缘效应”的原因可能为96孔板周孔与中心孔表面或热力学特征的不同。但有研究证实在温育中的热力学梯度可能是根本原因之所。聚苯乙烯本身为不良热导体，在实验室的常规ELISA测定中，将板从室温（通常在25℃左右）置于37℃温箱，板也升温时，在外周孔与中心孔之间可能存在一热力学梯度。因此使用水浴或在将反应溶液加入至板孔中时，将板和溶液均加热至温育温度（如37℃），就可以很容易地排除“边缘效应”，并且可提高测定的重复性。 总而言之，在临床ELISA测定中，要保证好的测定效果，可采用下述简单办法来确保温育条件，即尽量采用水浴，温育中让微孔板浮于水面上，或将浸透水的沙布放入一大饭盒中成一湿盒，放于温箱中，这样就会因为板条孔底部直接与37℃水或湿布的接触，以及水浴箱或湿盒内的高温度，而使反应溶液的温度迅速与温室平衡。 五、洗板 固相免疫测定技术是一种非均相免疫测定技术，需以洗涤操作将特异结合于固相的抗原或抗体与反应温育过程中吸附的非特异成份分离开来，以保证ELISA测定的特异性。因此，洗板对于ELISA测定来说，也是极其关键的一步。以HRP作为标记酶的ELISA试剂盒中使用的洗板液一般为含0.05%Tween20的中性PBS，Tween20为一种非离子去垢剂，既含亲水基团，也含疏水基团，其在洗涤中的作用机理是，借助其疏水基团与经疏水性相互作用被动吸附于聚苯乙烯固相上蛋白的疏水基团形成疏水键，从而削弱蛋白与固相的吸附，同时在其亲水基团与液相中水分子的结合作用下，促使蛋白质脱离固相而进入液相，这样就可达到去掉非特异吸附物的目的，但由于抗体或抗原的包被通常也是通过在碱性条件下与固相的疏水性相互作用而被动吸附于固相，因此要注意非离子去垢剂的使用浓度，洗板液中Tween20浓度高于0.2%，可使包被于固相上的抗原或抗体解吸附而影响试验的测定下限。 在临床实验室中，ELISA测定的洗板一般有两种方式，即手工和洗板机洗板。手工洗板即是在每次反应温育后，将反应液吸出或甩干，然后在板孔中加满洗液，放置2～3分钟后，将洗液吸出或甩干，再在吸水纸上拍干。重复上述洗涤步骤3～4次，最后在吸水纸上拍干，即可进行下一步测定操作。洗板机洗板则是将上述手工操作改由洗板机进行，使用洗板机洗板的一个特点是，每次洗板后不能拍干，故有较多的液体残留，液体残留量小的洗板机洗板至彻底所需的次数要少于残留量大的洗板机。在特定临床实验室所使用的洗板机，到底洗中国次能达到要求，可进行下面这个简单的实验：选择4×8 HBsAgELISA包被板条，每2×8孔分别加入相同一份弱阳性和一份阴性样本，按试剂盒说明加入酶结合物并完成温育后，洗板孔时按第一排4孔洗1次、第二批4孔洗2次、第3排4孔洗3次——直至第8排4孔洗8次，加底物显色测定，如洗3次后，显色不再改变，即洗3次的板孔比色测定与4次、5次洗板的板孔的吸光度等相同，阳性/阴性值保持最大不变，则可以认定该实验室所用洗板机3次洗板即可达到要求。 六、显色 在目前的以HRP作为标记酶的商品ELISA试剂盒中，如以TMB为底物，则提供的底物为A和B两瓶应用液；如以OPD为底物，则试剂盒提供OPD片剂或粉剂，临用前配制。一般商品试剂盒显色反应条件为37℃或室温反应15～30分钟。从理论上说，37℃30分钟才可以使HRP的底物催化反应完全，尽管在最初的10分钟内，绝大部份催化反应即可完成。因此，为使弱阳性样本孔能有充分的显色，建议在37℃下反应25～30分钟后，终止反应比色测定。 此外，在加入底物开始显色反应前，最好是先检查一下底物溶液的有效性，即可将A和B两种液各加一滴于清洁的空板孔或eppendorf管中，观察是否有显色出现，如有，则说明底物已变质。以OPD为底物，配好后应为无色，否则就不能使用。以TMB为底物，整个显色反应过程无需避光，而以OPD为底物，则需避光进行。关于TMB和OPD的显色反应特点及注意点可参考前面有关章节内容。显色反应完成后，加入酸终止反应，振荡混匀后即可进行下面的比色测定或肉眼判断结果。 七、比色 ELISA的比色测定由酶标仪进行，有的同行可能会认为，既然由酶标仪进行，那么此时便可以万事大吉了，其实不然，因为当代较为先进的酶标仪器仪表，均有较多的功能，使用不当，会得到令人难以理解的结果。如使用酶标仪比色测定后，有许多阴性测定孔的吸光度值为负数或测定假阳性率大大增加等等。这主要是没有正确地理解和使用酶标仪所致。至于如何正确理解和使用酶标仪详见后面有关章节。此处，只是强调下面两点： （1）比色测定时，一定要注意酶标仪的波长是否已调至合适或所用滤光片是否正确。由于有的临床实验室在进行ELISA测定时，以TMB为底物和以OPD为底物的试剂盒均有使用，而前者比色波长为450nm，后者为492nm，滤光片需根据要求随时更换。因此，容易出现滤光片错用的问题。 （2）单波长或双波长比色选择的问题。中档以上的酶标仪基本上都同时具有单波长和双波长比色功能。所谓的单波长比色即是通常的以对显色具有最大吸收的波长如450nm或492nm进行比色测定；而双波长双色则酶标仪在敏感波长如450nm和非敏感波长如630nm下各测定一次，敏感波上下的吸光度测定值为样本测定酶反应特异显色的吸光度与板孔上指纹、刮痕、灰尘等脏物所致的吸光度之和；非敏感波长下测定即改变波长至一定值，使得样本测定酶反应特异显色的吸光度值为零，此时测得的吸光度即为脏物的吸光度值。最后酶标仪给出的数值为敏感波长下的吸光度值与非常感波长下的吸光度值的差。因此，双波长比色测定具有能排除由微滴板本身、板孔内标本的非特异吸收、指纹、刮痕、灰尘等对特异显色测定吸光度的影响的优点，一般不必设空白孔。如在使用双波长比色时，仍设空白孔，就可能会造成前面提到的测定孔吸光度为负数的现象。由于ELISA测定中单个空白孔的非特异吸收上有一定程度的不确定性，也就是说每次测定或同次测定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度测定值，故而在ELISA测定比色时，最好是使用双波长比色。 八、结果判定 临床ELISA测定按其表示测定结果的方式分为定性和定量测定两大类。定性测定只是对标本中是否含有待测抗原或抗体作出“有”或“无”的结论，分别用“阳性”和“阴性”来表示。可见定性测定通常是用于传染性病原体的抗原或抗体的测定，以判断特定病原体感染的存在与否。而定量测定则是对标本中待测抗原的中国进行量值测定，以具体数值表示。定量测定基本上是用于非病原体抗原物质的测定，如激素、细胞因子、肿瘤标志物、小分子药物等。目前国内在临床上应用的ELISA试剂盒绝大部份是用于传染性病原体的抗原或抗体的定性测定，也有少部份用于αFP、hCG、细胞因子等的定量测定。ELISA定性测定的“阳性”和“阳性”的判定依据是试剂盒所确定的阳性判定值（Cut-off）。定量测定的“量值”依据是试剂盒中所带标准品同时测定得出的剂量反应曲线（又称标准曲线）。有关ELISA定性和定量测定结果的数据处理后面将有专门章节讨论。本处只想强调的一点是，ELISA定性测定的“阴性”和“阳性”结果的判定依据只能是试剂盒本身所确定的Cut-off值，而不能以卫生部临床检验中心供应弱阳性定值质控血清。为什么要强调这一点呢？主要是因为以前有很多基层实验室均使用部中心供应的弱阳性定值质控血清（以前也称“临界值”血清）的测定吸光度来判定结果，高于其判为阳性，反之为阴性，而不管试剂盒Cut-off值为何。到目前为止，仍有一些实验室在坚持这种错误的做法。试剂盒的Cut-off值的设立是建立在一系列科学试验及统计学研究的基础上的（详见后述），而部中心供应的弱阳性定值质控血清主要是供临床实验室进行室内质控时使用。 下面再解释一下在ELISA定性测定结果判定中常用的一些缩写。 （1）S/CO：其中S为Sample(样本)或Specimen(标本)的简写，表示的是标本测定的吸光度值，CO为Cut-off值的简写。除竞争抑制法外，其它ELISA定性测定模式中，当S/CO值大于或等于1时，标本的测定为阳性，小于1时为阴性。 （2）S/N或P/N：其中S同（1），N为Negative(阴性对照)的简写，P为Patient（患者）的简写。较早的试剂盒很多都使用S/N或P/N≥2.1为阳性判定标准，现仍有一些试剂盒使用这种方式。这种方式与S/CO方式无根本性区别，只不过是前者将阴性对照（N）的2.1倍视为Cut-off值而已。 九、结果报告及解释 临床ELISA测定结果的报告较为简单。定性测定报阴性或阳性即可；定量测定则报出具体的数值。结果解释比较起来要复杂的多，它要求实验室技术人员对所测定的项目有较为全面的知识基础。例如，对乙肝“两对半”结果的解释，不但要求检验者要知道不同的结果模式的临床意义，而且必须对乙肝病毒的分子生物学、分子的变异及其对表型的影响有更深层次的了解。现在，检验不再是单纯的实验室测定，而已成为一门临床医学学科，即检验医学，这就要求从事医学检验工作的检验医师，对所做的测定项目除了知其然，还要知其所以然，否则就难免为时代所淘汰。 综上所述，尽管ELISA测定的操作步骤非常简单，但有可能会影响测定结果的因素却较多，分布在测定操作的各步之中，尤以加样、温育和洗板为甚。为帮助大家分析查找测定中出现问题的可能原因，特对常见问题及原因归纳总结于下表。 临床ELISA测定中可能会出现的问题及可能的原因 问 题 可能的原因（非试剂盒本身的原因） 1．弱阳性质控样本检测不出 温育的时间或温度不够；显色反应时间太短；所用配制缓冲液的蒸馏水有问题 2．测定的重复性差 （相同样本两次测定结果不一致） 这是典型的由测定操作引起的问题，包括 （1）加样本及试剂量不准；孔间不一致； （2）加样过快，孔间发生污染； （3）加错样本； （4）加样本及试剂时，加在孔壁上部非包被区； （5）不同批号试剂盒中组分混用； （6）温育时间、洗板、显色时间不一致； （7）孔内污染杂物； （8）酶标仪滤光片不正确； （9）血清标本未完全凝固即加入，反应孔内出现纤维蛋白凝固或残留血细胞，易出现假阳性反应等。 3．白板 （阳性对照不显色） （1）漏加酶结合物； （2）洗板液配制中出现问题，如量筒不干净，含酶抑制物（如叠氮钠）等。 （3）漏加显色剂A或B； （4）终止剂当显色剂使用。 4．全部板孔均有显色 （1）洗板不干净； （2）显色液变质； （3）加底物的吸光受酶污染； （4）洗板液受酶等污染

㈧ elisa 是什么检测方法

ELISA是酶联免疫吸附测定法 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay , ELISA) 的简称。它是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术 。
原理如下：
①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。
②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。

㈨ elisa实验的原理是什么

ELISA实验原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色氧化型，出现颜色反应。

因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。

(9)熟悉ELISA检测方法扩展阅读：

ELISA实验基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体 ( 聚苯乙烯微量反应板 ) 表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。常用的 ELISA 法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定特异抗体。

ELISA方法已被广泛应用于多种细菌和病毒等疾病的诊断。在动物检疫方面，ELISA在猪传染性胃肠炎、牛副结核病、牛传染性鼻气管炎、猪伪狂犬病、蓝舌病等的诊断中已为广泛采用的标准方法。