植物病毒检测方法

Ⅰ 病毒的血清学技术有什么作用

这是检测病毒的有效办法。血清学诊断和鉴定病毒的方法很多，常见的有ELISA（酶联免疫吸附法）、免疫电镜、琼脂双扩散、免疫电泳等。其中，ELISA（酶联免疫吸附法）为世界公认的植物病毒检测方法。应用抗血清鉴定植物病毒的亲缘关系，检测花卉的种子、鳞球茎和苗木中传带的病毒，是植物病毒检疫和检测上常用的快速鉴定和检验技术，经常和生物学、电镜技术等配合使用。

血清学反应的原理是人或高等动物对于侵入自身的有些异体物质产生免疫反应，即异体物质刺激淋巴组织产生相应的球蛋白称为抗体，能刺激机体产生抗体的异物称为抗原，抗原与其相对应抗体可以在机体内或机体外进行特异性反应，这种反应可以被用来预防疾病（人或动物）、鉴定和检测病原物。

抗原的分子具有许多化学活性基团，称为抗原决定簇，它们的一定结构决定了抗原的特异性。一般来说，抗原决定簇数目愈多，抗原性就愈强。植物病毒是核蛋白，外壳由许多亚基组成，抗原决定簇位于亚基上。植物病毒是良好的抗原，其蛋白外壳，尤其是外壳的表面起着抗原的作用；单链核酸虽不能作为抗原，但它与外壳蛋白同时存在时，能增强外壳在动物体内的免疫反应；一般来说，植物病毒比其寄主的正常植物蛋白有更强的抗原性。

抗体是动物机体受到抗原刺激后，由动物机体的免疫活性细胞产生的免疫球蛋白，通常以“Ig”来表示。在抗体中至少含有5种免疫球蛋白，即IgG，IgM，IgD和IgE，其中以IgG最主要，约占70%～90%。IgG为易弯曲的Y形分子。由4条多肽链（2条重链和2条轻链）借4个2硫链连接组成。链的一端为氨基端，另一端为羧基端，酶可以降解IgG成为断片。常用木瓜酶和胃酶。前者将IgG降解成Fab和Fc两种片段；后者降解为F（ab）2和FC两种片段。Fab片段有抗体活性，1个Fab与1个抗原分子结合；F（ab）2为双体，可与2个抗原分子结合。抗体存在于免疫动物的血清或体液中。

植物病毒的抗血清，是将病毒的提纯液作为抗原，一般以家兔，有时也以小鼠或母鸡等为免疫动物，通过静脉、肌肉或腹腔等途径，逐渐增加剂量，多次注射抗原。待抗体产生后，采血，取出其血清即为该病毒的抗血清。免疫家兔产生的抗血清称为兔抗体；免疫小鼠产生含特异抗体的腹水，采收的腹水，内含“腹水抗体”；免疫母鸡，产生含抗体的鸡蛋，从蛋黄中提取的抗体称为“蛋黄抗体”。运用细胞融合技术，将小鼠骨髓瘤细胞和小鼠脾细胞杂交，产生杂交瘤细胞，其增殖能力很强，可在体外连续培养产生抗体。选择其中能产生某单一抗体的细胞株，所产抗体称“单克隆抗体”。单克隆抗体开创了在动物体外产生抗体的新时代。

这里介绍几种常用的血清学检测技术。

1 免疫双扩散法

又称奥氏琼脂双扩散法。琼脂在水中加热溶解，冷却时成为凝胶平板，在上打数孔，分别放入抗原和抗体，它们各自向凝胶中扩散，于抗原和抗体比例最适的位置上形成沉淀反应。

具体步骤：按每1～2g（一般用1.2g）琼脂粉，于100ml生理盐水中，置沸水浴或家用高压锅中溶化，配成1%～2%琼脂，加0.1%叠氮化钠，防腐，用吸管或其他物品，将琼脂均匀地铺于洁净的玻璃平板（可用载玻片或裁制成的大小一致的玻板）上，以热的琼脂液刚铺满为限，约1.5～2mm厚，静止待凝固，制成的琼脂板置保湿器皿中待用。检测时，琼脂板下放一“孔排列图”，用打孔器按图样打孔。孔的排列方式很多，有梅花形，有7孔，即中间1孔，四周6孔；方阵形，有5孔，即中间1孔，四周4孔（图1）。打出孔后，用针或吸器将孔中凝胶圆片取出，在孔中加适宜稀释度的抗原或抗体，抗原孔中应包括已知阳性抗原、待测抗原和健株对照，可以用病健株的汁液或提纯病毒液。加满各孔，持平放于保湿器中数小时或放置至次日，在有黑背景的散射或斜射灯光上方观察沉淀线。抗原和抗体的适宜浓度是影响反应结果的主要因素，因此必须注意：第一，孔径和孔距（相邻两孔边的最短距离）要适宜，两者之比以2∶1为宜，即孔距等于孔的半径，孔距过大，沉淀线便不能出现或变模糊，并且反应时间拉长，不能很快见到结果；第二，掌握反应物的最适浓度，为此，对所用抗体或抗原，分别作倍比稀释，先测知两者反应的最适浓度后，再进行正式反应。

图1 打孔图样

Ⅱ 什么是抗血清检测法

植物病毒是一种由核酸和蛋白质组成的抗原，当把经过纯化的某种已知病毒注射到脊椎动物体内后，就会产生一种相应的抗体。

抗体主要存在于血清中，含有抗体的血清称为抗血清。注射到动物体内的病毒不同，所产生的抗血清也不同。

抗原和抗体之间能发生高度专一性的免疫反应，借助这种反应，就可用已知病毒的抗血清鉴定未知病毒的种类。其方法之一是将待测植株的一滴汁液加到几种不同的抗血清中，在哪一种抗血清中出现沉淀，就证明该植株带有哪一种病毒。

这个过程在很短时间内即可完成。因此，病毒的抗血清鉴定法既灵敏又快捷，是目前常用的一种病毒检测方法。

Ⅲ 常用的植物病毒分子检测诊断技术有哪些

1 RT-PCR技术

RT-PCR是英文Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction的简写，中文称之为反转录聚合酶链式扩增反应。在反转录酶M-MLV或AMV的作用下，以RNA为模板、以20个左右的核苷酸为引物，反转录合成cDNA。再以cDNA为模板，两个3和5端互补寡核苷酸引物，由Taq聚合酶从5→3进行一系列DNA聚合反应，扩增出所需要的目的DNA，可将极微量的靶DNA特异性地扩增上百万倍，从而大大提高了对DNA分子的分析和检测能力。

利用PCR技术，可以检测到单分子核酸或对每10万个细胞中仅含1个靶核酸分子的样品。因此，该技术创立至今十年来，迅速地形成为常规的标准程序，为生物科学提供了从微量微生物材料中快速得到大量特定的遗传物质的实验手段。PCR在植物病毒的检测、鉴定和植物病毒的检疫工作中也将具有重要意义。如果病毒核酸是DNA类型，不需要反转录（RT），直接可以进行聚合酶链式扩增（PCR）。而大多数植物病毒的核酸类型为RNA，因此，需要先进行反转录（RT），再进聚合酶链式（PCR）扩增。用1%琼脂糖和5%聚丙烯酰胺进行电泳，即可检出扩增片段。

这里以香石竹斑驳病毒为例，介绍RT-PCR检测香石竹斑驳病毒的实验技术。

用已知病毒核酸保守序列设计引物，分别提取病、健植物总RNA为模板，进行RT-PCR反应，琼脂糖或PAGE电泳检测扩增结果。感病材料会出现特异扩增带。如香石竹斑驳病毒（Carnation mottle virus，CarMV）。根据该病毒的RNA序列设计引物，P1引物（5′端引物，与CarMV RNA的2516～2538同源）：5′-〔TTA，GTT，TGC，CCC，CGT，TGG，TAA，CC〕-3′。P2引物（3′端互补引物，与CarMV RNA的3100～3124对应）：5′-〔AAG，CGT，CAT，CGT，TGA，ATC，CCA，GAG〕-3′。目标片段大小为608nt。对病健材料进行了RT-PCR，从感病材料中可以扩增出了大约600bp的特异片段，而健康植物无此扩增带。用此方法可以快速、准确地检测香石竹斑驳病毒。操作如下：

（1）RNA提取

分别取感病及健康叶片0.2～0.5g，加液氮研成粉末，按1g∶2ml的比例悬浮于RNA抽提缓冲液（20mmol/L Tris-HC1 pH8.0，1mmol/L EDTA，1%SDS，0.2%巯基乙醇）。按1∶1比例加入水饱和苯酸—氯仿—异戊醇（25∶24∶1）混合液，抽提数次，乙醇沉淀总RNA。溶入20～50μl TE缓冲液中，-70℃冰箱保存备用。

（2）cDNA合成反应体系组分为

待检测材料总RNA或健康材料总RNA各0.5/μg，20pmol/L引物P21μl，5×MMLV缓冲液4μl，ddH2O7μl，该混合液于88℃处理10min后冰上迅速冷却，然后加入10mmol/L dNTPs 1μl，40U/μl Rnasin 0.5μl，100mmol/L DTT 2μl，200U/μl MMLV逆转录酶1μl，混合后经42℃处理lh，合成cDNA。

（3）PCR扩增

取上述的cDNA各0.5μg，分别加入10×PCR缓冲液5μl，20pmol/L引物P1和引物P2各1μl，10mmol/LdNTPs 1μl，88℃10min之内加2U/μl Taq DNA聚合酶1μl，加ddH2O至50/μl。然后在液面上加三滴石蜡油，进行如下PCR热循环：94℃3min，60℃1min，72℃1min，1次循环；94℃40s、60℃1min，72℃1min，35次循环，最后72℃延伸10min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检查。携带CarMV的样品会出现600bp的特性扩增带。如图1。

图1 CarMV PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果