可以检测dna多态性的方法

⑴ 要做基因多态性分析，哪种方法提取DNA要好点

1．限制性片段度态性（Restriction Fragment Length PolymorphismRFLP）：由DNA 态性致使DNA 限制酶切位点及数目发改变用限制酶切割基组所产片段数目每片段度同即所谓限制性片段度态性导致限制片段度发改变酶切位点称态性位点早用Southern Blot/RFLP检测采用聚合酶链反应（PCR）与限制酶酶切相结合现采用PCR-RFLP进行研究基限制性片段度态性
2．单链构象态性（SSCP）：种基于单链DNA构象差别点突变检测相同度单链DNA顺序同甚至单碱基同形同构象电泳泳速度同PCR产物经变性进行单链DNA凝胶电泳靶DNA若发单碱基替换等改变现泳变位（mobility shift）用于鉴定否存突变及诊断未知突变

⑵ 基因多态性的主要检测方法有哪些

1．限制性片段长度多态性（Restriction
Fragment
Length
Polymorphism，RFLP）：由DNA
的多态性，致使DNA
分子的限制酶切位点及数目发生改变，用限制酶切割基因组时，所产生的片段数目和每个片段的长度就不同，即所谓的限制性片段长度多态性，导致限制片段长度发生改变的酶切位点，又称为多态性位点。最早是用Southern
Blot/RFLP方法检测，后来采用聚合酶链反应（PCR）与限制酶酶切相结合的方法。现在多采用PCR-RFLP法进行研究基因的限制性片段长度多态性。
2．单链构象多态性（SSCP）：是一种基于单链DNA构象差别的点突变检测方法。相同长度的单链DNA如果顺序不同，甚至单个碱基不同，就会形成不同的构象。在电泳时泳动的速度不同。将PCR产物经变性后，进行单链DNA凝胶电泳时，靶DNA中若发生单个碱基替换等改变时，就会出现泳动变位（mobility
shift），多用于鉴定是否存在突变及诊断未知突变。
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⑶ 核酸多态性分析包括什么及其主要的检测方法

该概述
的DNA的DNA（在英语中脱氧核糖核酸的缩写），也被称为脱氧核糖核酸，DNA是染色体的主要成分，而且组合物的遗传物质。有时也被称为“基因的颗粒”，因为在再生的过程中，父拷贝被发送到其自身的DNA的后代的部分，从而完成性状的传播。原核染色体是一个长DNA分子。真核细胞的细胞核，有一个以上的染色体，每个染色体包含只有一个DNA分子。但它们通常是原核细胞和DNA和蛋白质一起的大分子。 DNA分子的功能是确定物种性状商店几乎所有蛋白质和所有的遗传信息的RNA分子;编码和生物有机体的设计在一定时间和所有程序空间有序的基因转录和蛋白表达来完成定向和发展;初步确定的生物，当一个独特的性格和个性，以及应激反应的环境和所有之间的相互作用。除了染色体DNA中，有存在于真核线粒体和叶绿体的不同结构的DNA的一个非常小的量。的DNA是病毒DNA的遗传物质，极少数的RNA。 DNA分子的双螺旋DNA分子

稳定性能都比较稳定。这是因为DNA分子的双螺旋结构的内侧，碱基对通过氢键形成，使得两个脱氧核苷酸长链牢牢并联。另外，纵向和进一步加强该DNA分子的稳定性之间的碱基对相互作用。每个基地纵向称为碱基堆积力之间的这种相互作用，它是芳香π电子之间的基引起的相互作用。堆叠台现在普遍认为最重要的因素是能够稳定的DNA结构。另外，带负电的磷酸基团带正双螺旋的外部之间的阳离子形成的离子键带电，可减少之间的静电斥力的双链的，所以该DNA双螺旋结构还具有一定的稳定性。因为不同数量的碱基对的DNA分子，改变碱基对的顺序，从而构成一个DNA分子多样性的
多样性。例如，4000个碱基对的DNA分子的遗传信息进行4种，即，10多种。由于不同的顺序的碱基对
特定DNA分子也有差别，使得每个碱基对的DNA分子具有在这个特定的顺序自己特定的顺序包含特定的遗传信息，从而使该DNA分子是特异性的。
发现，科学的历史发展
DNA结构的发现是最具传奇色彩的“章节”之一。 DNA结构的发现是一个里程碑式的成就，但发现它的方式是建设，法律的模型建设模式作为一个孩子，像“拼凑”的方式拼图。在这个沃森和克里克的“拼凑”的最佳性能。 1928年
4年6，沃森出生于芝加哥。 16岁的芝加哥大学毕业，学士学位的动物学学位，生物学已经开始显露才华。 22岁获得博士学位，随后沃森来到剑桥大学卡文迪什实验室，他结识了克里克早前曾在这里工作，从两传奇生涯合作的开始。克里克于1916年6月8日出生在北安普顿，英格兰，21岁毕业于伦敦大学。二战结束后，他来到卡文迪什实验室在剑桥，克里克和沃森，作为DNA在物理学将研究生物学的强烈兴趣。它已经已知
，DNA的是薄的聚合物化合物，由一系列双脱氧核苷酸链构成，反过来是脱氧核苷酸脱氧核糖，磷酸和含氮碱组合物，所述底座具有4种。 1951年，许多科学家研究DNA的结构展开了较量。有两个着名的DNA分子的研究团队，是一个着名的物理学家和化学家富兰克林威尔金斯皇家学院研究团队的带领下，主要由X射线衍射研究DNA的结构。是一家着名的化学家莱纳斯·鲍林，由加州研究团队的大学领导，它们主要用于对DNA结构模型构建方法，并已通过此方法的蛋白质螺旋找到。 1951年
富兰克林月威尔金斯将拍摄一个非常精细的X射线衍射照片显示了在意大利举行的生物大分子发布会DNA结构，DNA一直有着浓厚的兴趣在看到沃森的时候这个数字，激动，说不出话来，他的心脏怦怦直跳，他的结论是，基于该对DNA的结构是螺旋。他打定主意做一个DNA模型。他把这个想法告诉他的合作者克里克，克里克已得到公认。
沃森和克里克构建DNA分子结构模型工作开始于1951年秋天，他们用于构建模型法，仿照着名化学家α螺旋模型构建蛋白质，基于晶体的数据鲍林方法，纸和金属丝脱氧核苷酸。
他们接连模型构建的之一，它已被拒绝。但沃森坚持认为，DNA分子可以是双链结构。因为事物的本质，在细胞中染色体的许多对配对。它们与完了后交替排列脱氧核糖和磷酸作为基本骨架，双螺旋结构以外的基行（图1），以及脱氧核糖和磷酸交替排列
作为基本骨架，在内部基极的行中，双螺旋结构和相同类型的碱基配对（图2）。
1952年，生物化学家查加夫访问剑桥大学报道他的人，猪，牛，羊，细菌和酵母，成果等不同生物DNA分析。查戈夫结果表明，虽然不同的生物体，数量和四种脱氧核苷酸非常不同的的相对比例，但不管之间该DNA是什么样的DNA材料，有A = T和G = C，这就是所谓的DNA化学成分“查戈夫规则。”在1952年7月，当查加夫参观卡文迪什实验室，克里克详细解释到A：T = G：C = 1：1的规则。克里克好友后，通过计算理论化学格里菲斯表明在DNA中，A和T的4种脱氧核苷酸必须是一个键，G和C必须键。这样做是与查加夫规律是一致的。随后，以前的同事多诺·鲍林说沃森，A-T和G-C对是由氢维持。这些工作，这将是DNA分子的沃森和克里克模型配对-T，G-C对结构的基础。
到目前为止，DNA模型已经出现。 2月28日，沃森的四个基地一个纸板模型，将坚持纸板框架向中心配对，克里克立即指出，只有两个方向相反的单链，使完美碱基配对，这正好与X-一致射线衍射数据。完整DNA分子结构模型是在1953年3月7日，完成了根据这个模型，DNA分子是双螺旋，螺旋各自含有长度为10个碱基对单元为34埃（1 = 10-10米）。 20的螺旋直径？ 4月15日，沃森和克里克发表在“自然”（自然）杂志第一篇论文的模型。
发现DNA双螺旋分子模型，是生物学史上的一个里程碑，它提供了DNA复制的配置的解释，让人们DNA的基础上，作为遗传物质不再怀疑，并且奠定了分子遗传科学的基础。 DNA双螺旋模型在科学的影响是深远的。
有人说沃森和克里克的诺贝尔文学奖是站在“巨人的脚趾”得，我不这么认为，X射线衍射照片上采用了蛋白质的螺旋鲍林的研究方法，DNA合成化学研究数据的基础上， ，沃森和克里克，沃森，特别是有一个更广阔的视野，从所获得的新的综合结果所需的专家，这个全面的结果大于各部分之学，这些专家不捡柴森林无法理解。

⑷ DNA的多态性的DNA多态性的检测

1. 限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism）:由DNA的多态性，致使DNA分子的限制酶切位点及数目发生改变，现在多采用PCR-RFLP法进行研究基因的限制性片段长度多态性.
2．单链构象多态性（SSCP）：是一种基于单链DNA构象差别的点突变检测方法。相同长度的单链DNA如果顺序不同，甚至单个碱基不同，就会形成不同的构象。在电泳时泳动的速度不同。将PCR产物经变性后，进行单链DNA凝胶电泳时，靶DNA中若发生单个碱基替换等改变时，就会出现泳动变位（mobility shift），多用于鉴定是否存在突变及诊断未知突变。3．PCR-ASO探针法（PCR-allele specific oligonucleotide, ASO）：即等位基因特异性寡核苷酸探针法。在PCR扩增DNA片段后，直接与相应的寡核苷酸探杂交，即可明确诊断是否有突变及突变是纯合子还是杂合子。
其原理是：用PCR扩增后，产物进行斑点杂交或狭缝杂交，针对每种突变分别合成一对寡核苷酸片段作为探针，其中一个具有正常序列，另一个则具有突变碱基。突变碱基及对应的正常碱 基匀位于寡核苷酸片段的中央，严格控制杂交及洗脱条件，使只有与探针序列完全互补的等位基因片段才显示杂交信号，而与探针中央碱基不同的等位基因片段不显示杂交信号，如果正常和突变探针都可杂交，说明突变基因是杂合子，如只有突变探针可以杂交，说明突变基因为纯合子，若不能与含有突变序列的寡核苷探针杂交，但能与相应的正常的寡核苷探针杂交，则表示受检者不存在这种突变基因。若与已知的突变基因的寡核苷探针匀不能杂交，提示可能为一种新的突变类型。4. PCR-SSO法：SSO技术即是顺序特异寡核苷酸法（Sequence Specific Oligonucleotide, SSO）。
原理是PCR基因片段扩增后利用序列特异性寡核苷酸探针，通过杂交的方法进行扩增片段的分析鉴定。探针与PCR产物在一定条件下杂交具有高度的特异性，严格遵循碱基互补的原则。
探针可用放射性同位素标记，通过放射自显影的方法检测，也可以用非放射性标记如地高辛、生物素、过氧化物酶等进行相应的标记物检测。5. PCR-SSP法：序列特异性引物分析即根据各等位基因的核苷酸序列，设计出一套针对每一等位基因特异性的（allele-specific）、或组特异性 (group-specific)的引物，此即为序列特异性引物（SSP）。SSP只能与某一等位基因特异性片段的碱基序列互补性结合，通过PCR特异性地扩增该基因片段，从而达到分析基因多态性的目的。6. PCR-荧光法：用荧光标记PCR引物的5’端，荧光染料FAM和JOE呈绿色荧光，TAMRA呈红色荧光，COUM 呈兰色荧光，不同荧光标记的多种引物同时参加反应，PCR扩增待检测的DNA，合成的产物分别带有引物5’端的染料，很容易发现目的基因存在与否。7. PCR-DNA测序：是诊断未知突变基因最直接的方法，由于PCR技术的应用，使得DNA 测序技术从过去的分子克隆后测序进入PCR直接测序。PCR产物在自动测序仪上电泳后测序。
常用方法有：Sanger双脱氧末端终止法;Maxam-Gilbert化学裂解法；DNA测序的自动化。目前DNA顺序全自动激光测定法是最先进的方法。8. PCR指纹图法（PCR-fingerprints）：实用于快速的同种异型DR/Dw配型。在DR/DW纯合子及杂合子个体中，每种DR单倍型及每种单倍型组合所产生的单链环状结构的大小、数目和位置各异，由于同质双链和异质双链之间的分子构象不同。
因此，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它们的迁移率各不相同，从而获得单倍型特异的电泳带格局即PCR指纹。也有人用人工合成的短寡核苷酸片段作为探针，同经过酶切的人体DNA作Southern blot，可以得出长度不等的杂交带，杂交带的数目和分子量的大小具有个体特异性，除非同卵双生，几乎没有两个人是完全相同的，就象人的 指纹一样，人们把这种杂交带图形称为基因指纹(gene finger-printing)。9. 基因芯片法：又称为DNA 微探针阵列（Micro array）。它是集成了大量的密集排列的大量已知的序列探针，通过与被标记的若干靶核酸序列互补匹配，与芯片特定位点上的探针杂交，利用基因芯片杂交图象，确定杂交探针的位置，便可根据碱基互补匹配的原理确定靶基因的序列。这一技术已用于基因多态性的检测。
对多态性和突变检测型基因芯片采用多色荧光探针杂交技术可以大大提高芯片的准确性、定量及检测范围。应用高密度基因芯片检测单碱基多态性，为分析SNPs提供了便捷的方法。10. AFLP（Amplication Fragment Length Polymorphism）法AFLP技术是一项新的分子标记技术，是基于PCR技术扩增基因组DNA限制性片段，基因组DNA先用限制性内切酶切割，然后将双链接头连接到DNA片段的末端，接头序列和相邻的限制性位点序列，作为引物结合位点。
限制性片段用二种酶切割产生，一种是罕见切割酶，一种是常用切割酶。它结合了RFLP和PCR技术特点，具有RFLP技术的可靠性和PCR技术的高效性。
由于AFLP扩增可使某一品种出现特定的DNA谱带，而在另一品种中可能无此谱带产生，因此，这种通过引物诱导及DNA扩增后得到的DNA多态性可做为一种分子标记。AFLP可在一次单个反应中检测到大量的片段。以说AFLP技术是一种新的而且有很大功能的DNA指纹技术。11. DGGE（denaturing gradinent electrophoresis,DGGE）法变性梯度凝胶电泳法（） DGGE法分析PCR产物，如果突变发生在最先解链的DNA区域，检出率可达100%，检测片段可达1kb，最适围为100bp-500bp。
基本原理基于当双链DNA在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性湿度一致的凝胶位置时，DNA发生部分解链，电泳适移率下降，当解链的DNA链中有一个碱基改变时，会在不同的时间发生解链，因影响电泳速度变化的程度而被分离。
由于本法是利用温度和梯度凝胶迁移率来检测，需要一套专用的电泳装置，合成的PCR引物最好在5`末端加一段40bp-50bp的GC夹，以利于检测发生于高熔点区的突变。在DGGE的基础上，又发展了用湿度梯度代替化学变性剂的TGGE法（温度梯度凝胶电泳temperature gradient gelelectrophoresis,TGGE）。DGGE和TGGE均有商品化的电泳装置，该法一经建立，操作也较简便，适合于大样本的检测筛选。12. RAPD（Random amplified polymorphic DNA）法运用随机引物扩增寻找多态性DNA片段可作为分子标记。这种方法即为RAPD( Random amplified polymorphic DNA，随机扩增的多态性DNA)。尽管RAPD技术诞生的时间很短, 但由于其独特的检测DNA多态性的方式以及快速、简便的特点,使这个技术已渗透于基因组研究的各个方面。
该RAPD技术建立于PCR技术基础上,它是利用一系列(通常数百个)不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链(通常为10聚体)为引物,对所研究基因组DNA进行PCR扩增.聚丙烯酰胺或琼脂糖电泳分离,经EB染色或放射性自显影来检测扩增产物DNA片段的多态性,这些扩增产物DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。
RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同,但对于任一特异的引物,它同基因组DNA序列有其特异的结合位点.这些特异的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合PCR扩增反应的条件,即引物在模板的两条链上有互补位置,且引物3'端相距在一定的长度范围之内,就可扩增出DNA片段.因此如果基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合位点分布发生相应的变化,而使PCR产物增加、缺少或发生分子量的改变。
通过对PCR产物检测即可检出基因组DNA的多态性。分析时可用的引物数很大,虽然对每一个引物而言其检测基因组DNA多态性的区域是有限的,但是利用一系列引物则可以使检测区域几乎覆盖整个基因组。因此RAPD可以对整个基因组DNA进行多态性检测。另外，RAPD片段克隆后可作为RFLP的分子标记进行作图分析。

⑸ 测植物dna多态性是以条带数最多的为参照吗

分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。

分子标记的概念有广义和狭义之分。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。狭义分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。
理想的分子标记必须达以下几个要求：(1) 具有高的多态性；(2)共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；(3) 能明确辨别等位基因；(4) 遍布整个基因组；(5)除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组；(6) 选择中性(即无基因多效性)；(7)检测手段简单、快速(如实验程序易自动化)；(8) 开发成本和使用成本尽量低廉；(9)在实验室内和实验室间重复性好(便于数据交换)。但是，目前发现的任何一种分子标记均不能满足以所有要求。
【分子标记的种类】
一、基于分子杂交技术的分子标记技术
此类标记技术是利用限制性内切酶解及凝胶电泳分离不同的生物 DNA 分子，然后用经标记的特异 DNA 探针与之进行杂交，通过放射自显影或非同位素显色技术来揭示 DNA 的多态性。
①限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)
1974年Grodzicker等创立了限制性片段长度多态性(RFLP)技术，它是一种以DNA—DNA杂交为基础的第一代遗传标记。RFLP基本原理：利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA，得到大小不等的DNA片段，所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况。通过凝胶电泳分析这些片段，就形成不同带，然后与克隆DNA探针进行Southern杂交和放射显影，即获得反映个体特异性的RFLP图谱。它所代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异。由于不同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等变化导致限制内切酶识别和酶切发生改变从而造成基因型间限制性片段长度的差异。
RFLP的等位基因其有共显性特点。RFLP标记位点数量不受限制，通常可检测到的基因座位数为1—4个。RFLP技术也存在一些缺陷，主要是克隆可表现基因组DNA多态性的探针较为困难；另外，实验操作较繁锁，检测周期长，成本费用也很高。自RFLP问世以来，已经在基因定位及分型、遗传连锁图谱的构建、疾病的基因诊断等研究中仍得到了广泛的应用。
②数目可变串联重复多态性(Variable Number of Tandem Repeats，VNTR )
数目可变串联重复序列又称小卫星DNA (MinisatelliteDNA)，是一种重复DNA小序列，为10到几百核苷酸，拷贝数10一10001不等。VNTR基本原理与RFLP大致相同，只是对限制性内切酶和DNA探针有特殊要求：(1)限制性内切酶的酶切位点必须不在重复序列中，以保证小卫星或微卫星序列的完整性。(2)内切酶在基因组的其他部位有较多酶切位点，则可使卫星序列所在片段含有较少无关序列，通过电泳可充分显示不同长度重复序列片段的多态性。(3)分子杂交所用DNA探针核昔酸序列必须是小卫星序列或微卫星序列，通过分子杂交和放射自显影后，就可一次性检测到众多小卫星或微卫星位点，得到个体特异性的DNA指纹图谱。
小卫星标记的多态信息含量较高，在17一19之间。缺点是数量有限，而且在基因组上分布不均匀，这就极大限制其在基因定位中的应用。VNTR也存在实验操作繁琐、检测时间长、成本高的缺点。
二、基于PCR技术的分子标记技术
（一）、随机引物的PCR标记
所用引物的核苷酸序列是随机的，其扩增的 DNA 区域事先未知。随机引物PCR扩增的DNA 区段产生多态性的分子基础是模板 DNA扩增区段上引物结合位点的碱基序列的突变，不同来源的基因组在该区段上表现为扩增产物有无差异或扩增片段大小的差异。随机引物PCR标记表现为显性或共显性。
①随机扩增多态性DNA (Random Amplified Polymorphism DNA，RAPD )
RAPD技术是1990年由Wiliam和Welsh等人利用PCR技术发展的检测DNA多态性的方法。基本原理：它是利用随机引物（一般为8—10bp）通过PCR反应非定点扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分析扩增产物DNA片段的多态性。扩增片段多态性便反映了基因组相应区域的DNA多态性。RAPD所使用的引物各不相同，但对任一特定引物，它在基因组DNA序列上有其特定的结合位点，一旦基因组在这些区域发生DAN片段插人、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物数量和大小发生改变，表现出多态性。就单一引物而言，其只能检测基因组特定区域DNA多态性，但利用一系列引物则可使检测区域扩大到整个基因组，因此，RAPD可用于对整个基因组DNA进行多态性检测，也可用于构建基因组指纹图谱。
与RFLP相比，RAPD具有以下优点：(1)技术简单，检测速度快；(2)RAPD分析只需少量DNA样品；(3)不依赖于种属特异性和基因组结构，一套引物可用于不同生物基因组分析；(4)成本较低。但RAPD也存在一些缺点：(1)RAPD标记是一个显性标记，不能鉴别杂合子和纯合子；(2)存在共迁移问题，凝胶电泳只能分开不同长度DNA片段，而不能分开那些分子量相同但碱基序列组成不同的DNA片段；(3) RAPD技术中影响因素很多，所以实验的稳定性和重复性差。
②任意引物PCR (Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction， AP—PCR)
在AP—PCR分析中，所使用的引物较长(10－50 bp) ，PCR反应分为两个阶段，首先寡核昔酸引物在低严谨条件下与模板DNA退火，此时发生了一些合成，以便稳定模板与引物之间相互作用。然后进行高严谨退火条件的循环，两个位点间那些序列在低严谨度退火条件下发生的引物延伸可继续在高严谨条件下扩增。采用变性聚丙烯酞胺凝胶电泳分析PCR产物，最终反应结果与RAPD类似。只要设计的引物在低严谨退火条件下能减少引物产生人为产物，应用成对组合的引物可以产生新的AP—PCR谱带，但引物配对组合使用时，得到的图谱与单引物单独使用时产生的图谱之和很不相同，这样，50个引物能产生1250种不同指纹图谱。
AP—PCR方法不需预知序列资料，而且检测的基因组样本是任意的，还能够用于检测近等基因系(或同类系)中的多态性。AP—PCR的缺点是每个新的多态性都必须经纯化才能进一步使用。另外，此方法在杂合体中仅可辨别长度多态性。
③DNA扩增指纹印迹(DNA Amplification Fingerprinting，DAF)
DAF是一种改进的RAPD分析技术，与RAPD技术不同的是，DAF分析中所使用的引物浓度更高，长度更短(一般为5一8bp)，因此它所提供的谱带信息比RAPD大得多，如当使用5个核昔酸的引物时，引物和模板的组合大约可扩增出10一100个DNA片段。PCR扩增产物是在凝胶上进行分离，通过银染即可产生非常复杂带型。
（二）、特异引物的PCR标记
特异引物的PCR标记所用引物是针对已知序列的 DNA 区段而设计的，具有特定核苷酸序列（通常为 18—24 bp），可在常规PCR复性温度下进行扩增，对基因组 DNA 的特定区域进行多态性分析。
①序列标志位点(Sequence Tagged Sites，STS)
STS是对以特定对引物序进行PCR特异扩增的一类分子标记的统称。通过设计特定的引物，使其与基因组DNA序列中特定结合位点结合，从而可用来扩增基因组中特定区域，分析其多态性。利用特异PCR技术的最大优点是它产生信息非常可靠，而不像RFLP和RAPD那样存在某种模糊性。
②简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSR)
简单重复序(SSR)也称微卫星DNA，其串联重复的核心序列为1一6 bp，其中最常见是双核昔酸重复，即(CA) n和(TG)n每个微卫星DNA的核心序列结构相同，重复单位数目10一60个，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。SSR标记的基本原理：根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同，因而能够用PCR的方法扩增出不同长度的PCR产物，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率。
SSR具有以下一些优点：(l)一般检测到的是一个单一的多等位基因位点；(2)微卫星呈共显性遗传，故可鉴别杂合子和纯合子；(3)所需DNA量少。显然，在采用SSR技术分析微卫星DNA多态性时必须知道重复序列两端的DNA序列的信息。如不能直接从DNA数据库查寻则首先必须对其进行测序。
③序列特异性扩增区(Sequence—characterized Amplified Region，SCAR)
SCAR标记是在RAPD技术基础上发展起来的。SCAR标记是将目标 RAPD片段进行克隆并对其末端测序，根据 RAPD 片段两端序列设计特异引物，对基因 DNA片段再进行PCR特异扩增，把与原RAPD片段相对应的单一位点鉴别出来。SCAR标记是共显性遗传，待检 DNA间的差异可直接通过有无扩增产物来显示。SCAR标记方便、快捷、可靠，可以快速检测大量个体，结果稳定性好，重现性高。
④单引物扩增反应(Single Primer Amplificatipn Reawtion，SPAR)
SPAR技术是与RAPD技术相似的一种标记技术，SPAR也只用一个引物，但所用的引物是在SSR的基础上设计的。这些引物能与SSR之间的间隔序列进行特异性结合，然后通过P(：R技术扩增SSR之间的DNA序列，凝胶电泳分离扩增产物，分析其多态性。另外，还有一种与SPAR技术非常相似的标记技术，即ISTR ( Inverse Sequence—taggedRepeat)技术，ISTR所用的引物是在反向重复序列基础上设计的，PCR扩增的是反向重复序列之间的DIVA序列。
⑤DNA单链构象多态性(Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP)
SSCP是指等长的单链DNA因核昔酸序列的差异而产生构象变异，在非变性聚丙烯酞胺中的表现为电泳迁移率的差别。单链DNA构象分析对DNA序列的改变非常敏感，常常一个碱基差别都能显示出来。在SSCP分析中，利用PCR技术定点扩增基因组DNA中某一目的片段，将扩增产物进行变性处理，双链DNA分开成单链，再用非变性聚丙烯酞胺凝胶电泳分离，根据条带位置变化来判断目的片段中是否存在突变。SSCP结果判定是通过多个样品之间对比，观察条带之间位置改变，从而显示出不同生物个体的DNA特异性，达到指纹分析目的。为了进一步提高SSCP的检出率，可将SSCP分析与其它突变检测方法相结合。其中与杂交双链分析(Heterocluplexanalysis，Het)法结合可以大大提高检出率。Het法是用探针与要检测的单链DNA或RNA进行杂交，含有一对碱基对错配的杂交链可以和完全互补的杂交链在非变性PAG凝胶上通过电泳被分离开。对同一靶序列分别进行SSCP和Het分析可以使点突变的检出率接近100%，而且实验简便。
⑥双脱氧化指纹法(Dideoxy Fingerprints，ddF )
ddF是将双脱氧末端终止测序法与SSCP结合起来的分析技术，对由双脱氧末端终止的长短不一的单链DNA进行SSCP分析。如果目的片段存在一个突变，则所有大于某一大小对应于突主变位置的双脱氧终止片段无野生型系统，对于每一个突有多次机会检测其迁移率改变，提高了检测突变的效率。ddF方法克服了SSCP分析时因DNA长度影响SSCP显示的困难，通过一种双脱氧核昔酸生产特异性的单链DNA，使其中长度合适的DNA片段显示SSCP改变。
三、基于限制性酶切和PCR技术的DNA标记
①扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP )
AFLP是1993年荷兰科学家Zbaeau和Vos发展起来的一种检测DNA多态性的新方法。AFLP 是 RFLP 与PCR相结合的产物，其基本原理是先利用限制性内切酶水解基因组 DNA 产生不同大小的 DNA片段，再使双链人工接头的酶切片段相边接，作为扩增反应的模板 DNA，然后以人工接头的互补链为引物进行预扩增，最后在接头互补链的基础上添加1—3个选择性核苷酸作引物对模板 DNA基因再进行选择性扩增，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测获得的DNA扩增片段，根据扩增片段长度的不同检测出多态性。引物由三部分组成：与人工接头互补的核心碱基序列、限制性内切酶识别序列、引物3’端的选择碱基序列（1—10bp）。接头与接头相邻的酶切片段的几个碱基序列为结合位点。该技术的独特之处在于所用的专用引物可在知道 DNA信息的前提下就可对酶切片段进行PCR 扩增。为使酶切浓度大小分布均匀，一般采用两个限制性内切酶，一个酶为多切点，另一个酶切点数较少，因而AFLP 分析产生的主要是由两个酶共同酶切的片段。AFLP 结合了 RFLP 和RAPD两种技术的优点，具有分辨率高、稳定性好、效率高的优点。但它的技术费用昂贵，对 DNA 的纯度和内切酶的质量要求很高。尽管 AFLP技术诞生时间较短，但可称之为分子标记技术的又一次重大突破，被认为是目前一种十分理想、有效的分子标记。
②酶切扩增多态性序列(Cleaved Amplified Polymorphism Sequences，CAPS )
CAPS技术又称为PCR—RFLP，它实质上是PCR技术与RFLP技术结合的一种方法。CAPS的基本原理是利用己知位点的DNA序列资源设计出一套特异性的PCR引物(19—27bp），然后用这些引物扩增该位点上的某一DNA片段，接着用一种专一性的限制性内切酶切割所得扩增产物，凝胶电泳分离酶切片段，染色并进行RFLP分析。GAPS标记揭示的是特异PGR片段的限制性长度变异的信息。CAPS是一类共显性分子标记，其优点是避免了RFLP分析中膜转印这一步骤，又能保持RFLP分析的精确度。另外，由于很多限制性内切酶均可与扩增DNA酶切，所以检测到多态性机会较大。
四、基于DNA芯片技术的分子标记技术
核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)
SNP标记是美国学者LanderE于1996年提出的第三代DNA遗传标记。SNP是指同一位点的不同等位基因之间仅有个别核苷酸的差异或只有小的插入、缺失等。从分子水平上对单个核苷酸的差异进行检测，SNP 标记可帮助区分两个个体遗传物质的差异。人类基因组大约每 1000 bp SNP出现一次，已有2000多个标记定位于人类染色体，对人类基因组学研究具有重要意义。检测 SNP 的最佳方法是 DNA 芯片技术。SNP被称为第三代 DNA 分子标记技术，随着 DNA 芯片技术的发展，其有望成为最重要最有效的分子标记技。
【分子标记的应用领域】
（一）、基因组作图和基因定位研究
长期以来，各种生物的遗传图谱几乎都是根据诸如形态、生理和生化等常规标记来构建的，所建成的遗传图谱仅限少数种类的生物，而且图谱分辨率大多很低，图距大，饱和度低，因而应用价值有限。分子标记用于遗传图谱构建是遗传学领域的重大进展之一。随着新的标记技术的发展，生物遗传图谱名单上的新成员将不断增加，图谱上标记的密度也将越来越高。建立起完整的高密度的分子图谱，就可以定位感兴趣的基因。
（二）、基于图谱克隆基因
图位克隆(Map—bascdcloning))是近几年随着分子标记遗传图谱的相继建立和基因分子定位而发展起来的一种新的基因克隆技术。利用分子标记辅助的图位克隆无需事先知道基因的序列，也不必了解基因的表达产物，就可以直接克隆基因。图位克隆是最为通用的基因识别途径，至少在理论上适用于一切基因。基因组研究提供的高密度遗传图谱、大尺寸物理图谱、大片段基因组文库和基因组全序列，已为图位克隆的广泛应用铺平了道路。
（三）、物种亲缘关系和系统分类中的应用
分子标记广泛存在于基因组的各个区域，通过对随机分布于整个基因组的分子标记的多态性进行比较，就能够全面评估研究对象的多样性，并揭示其遗传本质。利用遗传多样性的结果可以对物种进行聚类分析，进而了解其系统发育与亲缘关系。分子标记的发展为研究物种亲缘关系和系统分类提供了有力的手段。
（四）、用于疾病诊断和遗传病连锁分析
1980年，Bostein等成功的将PFLP技术用于镰刀型贫血症的诊断分析，开创了基因诊断的先河。PFLP是以孟德尔方式遗传，因此可以作为染色体上致病基因座位的遗传标志。目前，许多与相连锁的致病基因得以定位。小卫星和微卫星因其高度多态性而被广泛用于疾病诊断和遗传病的连锁分析。随着高通量SNP检测技术方法的出现，作为数量最多且易于批量检测的多态标记，SNP在连锁分析与基因定位，包括复杂疾病的基因定位、关联分析、个体和群体对环境致病因子与药物的易感性研究中将发挥愈来愈重要的作用。
【分子标记技术的展望】
目前，分子标记技术已飞速发展，并被广泛应用于动植物的遗传研究中。分子标记中的已在玉米、大豆、鸡、猪等动植物育种和生产中有许多应用研究，主要集中在基因定位、辅助育种、疾病治疗等方面的应用研究工作，取得了一些应用成果。分子标记技术的开发是近年来分子生物学领域研究的热点。随着分子生物学理论与技术的迅猛发展，必将研发出分析速度更快、成本更低、信息量更大的分子标记技术。而分子标记技术与提取程序化、电泳胶片分析自动化、信息(数据)处理计算机化的结合，必将加速遗传图谱的构建、基因定位、基因克隆、物种亲缘关系鉴别及与人类相关的致病基因的诊断和分析。