药品内毒素的检测方法

① 对药品进行细菌内毒素检验的意义是什么

细菌内毒素为外源性致热原，它可激活中性粒细胞等，使之释放出一种内源性热原质，作用于体温调节中枢引起发热。
主要具有以下生物活性：
1、致热性。2、致死性毒性。 3、白细胞减少。4、Shwartzman反应。5、降低血压，休克6、激活凝血系统。7、诱导对内毒素的耐受性。8、鲎细胞溶解物（鲎试剂）的凝集。9、刺激淋巴细胞有丝分裂。10、诱导抗感染的特异性抵抗力。11、肿瘤细胞坏死作用。

内毒素通过消化道进入人体时并不产生危害，但内毒素通过注射等方式进入血液时则会引起不同的疾病。内毒素小量入血后被肝脏枯否细胞灭活，不造成机体损害。内毒素大量进入血液就会引起发热反应—“热原反应”。
因此，生物制品类、注射用药剂、化学药品类、放射性药物、抗生素类、疫苗类、透析液等制剂以及医疗器材类（如一次性注射器，植入性生物材料）必须经过细菌内毒素检测试验合格后才能使用。
鲎试验被称作为“细菌内毒素试验”，逐渐替代家兔热原试验，但由于部分药品由于自身特殊性无法通过稀释法消除干扰，因此鲎试验还无法完全取代家兔热原试验。
细菌内毒素检查法主要有凝胶法和光度测定法两种方法。前者利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的原理来定性检测或半定量内毒素，后者包括浊度法和显色基质（比色）法，系分别利用鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化及产生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少来定量测定内毒素。

② 细菌内毒素国家药典是怎么检测的

10版国家药典
检测内毒素可以用凝胶法
凝胶法是通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。
鲎试剂灵敏度复核试验

在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。

以上摘自2010版中国药典《细菌内毒素检查法》

③ 内毒素的检测方法和原理

本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素 以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法
细菌内毒素检查包括浊度法和显色基质法 供试品检测时 可使用其中任何一种方法进行试验 当测定结果有争议的时候 除另有规定外 以凝胶法结果为准
本实验操作过程硬防止微生物和内毒素的污染
凝胶法鲎试剂原理 鲎试剂为鲎科动物东方鲎变形细胞溶解物的冷冻干燥品 内含能被微量细菌内毒素激活的凝胶酶原和凝固蛋白源 在适宜的条件下（温度、pH值及无干扰物质）细菌内毒素能激活鲎试剂中的凝固酶原 使鲎试剂产生凝集反应形成凝胶 凝胶法鲎试剂是根据凝集反应所形成凝胶的坚实程度来限量检测细菌内毒素

④ 内毒素的检测

由于内毒素是细菌死亡裂解或自溶引起的，因此环境中大量存在内毒素。当内毒素通过机体消化道等方式时并无危害，少量通过注射等方式进入血液后被肝脏枯否细胞灭活，不造成机体损害。内毒素大量进入血液就会引起发热反应—“热原反应”。内毒素大量进入、集聚于血液中，超过机体各自卫系统的清除能力，则可导致不同程度的内毒素血症。对于易于引入内毒素的药品医疗器械等必须通过内毒素检测。内毒素的检测常用家兔热原法和鲎试验法。中国药典收录的细菌内毒素检查法包括2种方法：凝胶法和光度法，使用鲎试剂来定性或定量检测内毒素。

⑤ 中国药典和美国药典中的细菌内毒素检测法的不同点比较

中国药典和美国药典中的细菌内毒素检测法的不同点比较

1、细菌内毒素工作标准品（CSE）

CP 对CSE的用途及效价进行定义“细菌内毒素工作标准品中每1ng细菌内毒素的效价应不小于2EU，不大于50EU”

USP未提

2、细菌内毒素检查用水

CP ： 与灵敏度为0.03EU/ml或更高灵敏度的鲎试剂在37±1℃条件下24小时不产生凝集反应的灭菌注射用水

USP：与鲎试剂在限定的灵敏度下不发生反应的灭菌注射用水或其它水。

CP：用于细菌内毒素定量测定用的细菌内毒素检查用水，内毒素含量应小于0.005EU/ml。

USP： 未提到。

3、实验用具的准备

CP：实验所用器皿需要经处理，除去可能存在的外源性内毒素，常用的方法是250℃下干烤至少1小时，也可用其它确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。

USP：使用经验证的除热原程序对所有玻璃器皿和遇热稳定的材料在热空气烘箱中进行除热原，常用的最低温度和最少的时间是250℃下30分钟。

(5)药品内毒素的检测方法扩展阅读

细菌内毒素检查法的注意事项：

在细菌内毒素检查方法的建立中，计算内毒素限值L、MVD和MVC时，需要注意最大人用剂量、产品规格、鲎试剂的灵敏度等重要的参数，因为计算错误会导致后续的所有努力均告失败。常见的问题有：

(1)临床用药剂量确定不正确，仅用常规用药剂量，未考虑临床可能的人体最大用药剂量和给药途径，在限值计算公式L=K/M中，由于对K值及M值的定义模糊，使K值及M值赋值不准确，最终导致限值计算错误。

例如，某注射剂临床成人每次静脉滴注给药40-80mg，婴儿(三个月以上)静脉滴注给药每次10-20mg。

按成人(体重60kg)剂量计算限值为3.75EU/mg，而婴儿体重仅为5kg左右，计算限值约为1.25EU/mg，如果不考虑临床每公斤体重最大用药剂量，细菌内毒素限值就会出现较大的差别。

(2)有的申报品种细菌内毒素限值不是根据临床用量计算出来，而是根据同品种热原检查的剂量推算出来的，造成限值错误。

(3)有的品种细菌内毒素限值从国外药典抄来，没有考虑该品种国内上市的临床使用剂量及中国人与国外人均体重等的差异，也造成限值确定不正确。

(4)错误的计算日给药剂量(一日内多次给药)。

(5)在品种规格(浓度)发生变化时，计算MVD没有进行调整。

(6)建立方法时所用的最大给药剂量已经超出了临床所用剂量等。

⑥ 内毒素测定的测试原理

根据检测原理，终点浊度法和动态浊度法都属于浊度法。浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法。终点浊度法未见商品化产品。动态浊度法（又称动态比浊法）是检测反应混合物的浊度上升某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。
终点显色法和动态显色法都是属于显色基质法。显色基质法系利用鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物显色释放出的呈色团的多少而测定内毒素含量的方法，根据产物颜色判断内毒素浓度，又称为比色法。 如果您仅需要检测样品的内毒素限量，可以选择凝胶法鲎试剂，通过确定内毒素限值及最大有效稀释倍数，做样品的干扰试验从而确定使用的鲎试剂的灵敏度。
如果您需要定量测定样品中内毒素含量则应选择显色基质鲎试剂盒或动态浊度法鲎试剂。
动态浊度法与动态显色法需要带温育系统的动态光度测定仪器及配套软件。
终点显色法需要配套酶标仪或可见分光光度计进行检测。配套带有温育系统的酶标仪。

⑦ 内毒素检测原理是什么

内毒素测定方法有：
凝胶法
动态浊度法
终点浊度法
动态显色法
终点显色法
凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来定性检测或半定量内毒素的方法。凝胶法鲎试剂常见规格为0.1ml/支或0.5ml/支或者更大装量，使用时应加除热原水（细菌内毒素检查用水）复溶后使用。凝胶法是通过观察有无凝胶形成作为反应的终点。此法操作比较简单，经济，不需要专用测定设备，可以进行定性或半定量测定。
动态浊度法、终点浊度法、动态显色法、终点显色法，这四种方法都是定量检测内毒素的。
根据检测原理，终点浊度法和动态浊度法都属于浊度法。浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法。终点浊度法未见商品化产品。动态浊度法（又称动态比浊法）是检测反应混合物的浊度上升某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。
终点显色法和动态显色法都是属于显色基质法。显色基质法系利用鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物显色释放出的呈色团的多少而测定内毒素含量的方法，根据产物颜色判断内毒素浓度，又称为比色法。厦门鲎试剂厂于2005年推出以鲎四肽为显色底物的鲎试剂盒，抗干扰能力强,
灵敏度高达0.005eu/ml,
质量达到国际领先水平。目前已有500多家单位使用该试剂盒，并有部分单位发表相应文献。国内有少量国外产品，但价格远高于国产试剂，到货周期长。
如果您仅需要检测样品的内毒素限量，可以选择凝胶法鲎试剂，通过确定内毒素限值及最大有效稀释倍数，做样品的干扰试验从而确定使用的鲎试剂的灵敏度。
如果您需要定量测定样品中内毒素含量则应选择显色基质鲎试剂盒或动态浊度法鲎试剂。
动态浊度法与动态显色法需要带温育系统的动态光度测定仪器及配套软件，例如，微板鲎试仪elx808及软件talgent
或gen5。动态浊度法与动态显色法简单方便、一步即成，线性范围宽。
终点显色法需要配套酶标仪或可见分光光度计进行检测。配套带有温育系统的酶标仪，如微板鲎试仪elx808，可减少试剂用量。

⑧ 简述快速检测食品和药品中可能存在的内毒素的方法和步骤

食品不用测内毒素，自然界中大量存在内毒素，通过食物进入人体并不影响人体健康，只有注射等方式进入人体血液的内毒素对人体有害，所以要检测注射类药品（注射液，疫苗等）的内毒素。测内毒素用鲎试剂，看要定量还是定性。厦门鲎试剂厂有定性和定量的鲎试剂可以检测内毒素，包括浊度法的。

⑨ 如何建立新药的细菌内毒素检查方法

[摘要] 目的：建立新药的细菌内毒素检查方法。方法：采用鲎试验检查法对新药中的细菌内毒素进行检查。结果：介绍了如何建立新药的细菌内毒素检查方法，重点是细菌内毒素检查限值的确认以及如何进行干扰试验。结论：细菌内毒素检查法为新药的质量控制以及应急检验提供了有益的基础。

[关键词] 新药；细菌内毒素检查法；干扰试验
[中图分类号] R927.12 [文献标识码] B [文章编号] 1673-7210（2011）11（b）-159-03

How to establish the method of bacterial endotoxin test for new drugs
XIAO Guinan, SUN Qingping, SHENG Yingmei
Guangdong Institute for Drug Control in Guangdong Province, Guangzhou 510180, China
[Abstract] Objective: To establish the method of bacterial endotoxin test for new drugs. Methods: Tachepleus amebocyte lysate test was applied to detect bacterial endotoxins in new drugs. Results: How to establish the method of bacterial endotoxin test for new drugs was introced, and especially focused on how to define the limit of bacterial endotoxins and carry out the interference test. Conclusion: Bacterial endotoxin test provides useful bases in quality control and emergency test for new drugs.
[Key words] New drugs; Bacterial endotoxin test; Interference test

新药以细菌内毒素检查方法代替既往的家兔热原检查法是一个趋势，在药害事件的应急处理中有一定的应用价值，这也符合国际上对动物实验的“3R”原则（优化、减少、替代）的要求。现行细菌内毒素检查方法是1968年美国科学家Levin和Bang所建立的鲎试验法[1]。从开展内毒素检查的现状来看，部分单位未能参照《中国药典》2010年版二部的要求进行实验和设计，本文着重介绍在建立新药细菌内毒素检查法中容易出现问题的细菌内毒素限值的确定及干扰试验这两个环节，力图为新药的质量控制以及应急检验提供有益的参考依据。
1 新药细菌内毒素检查限值的确认
1.1 细菌内毒素检查限值的计算公式
新药细菌内毒素检查限值（L）的确定是整个方法学建立的前提和基础，现在一般按照《中国药典》2010版二部附录XI E进行确定[2]。计算公式为L=K/M，K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/（kg・h）表示，非放射性注射剂K=5 EU/（kg・h），放射性注射剂K=2.5 EU/（kg・h），鞘内用注射剂K=0.2 EU/（kg・h）；M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，成人体重按60 kg计算，体表面积为1.62 m2。部分抗肿瘤药物及抗生素的使用剂量以体表面积描述时，可将每平方米体表面积剂量乘以0.027，即可转换为每千克体重剂量。
1.2 细菌内毒素检查限值的确认程序
首先根据所研究的新药品种说明书，通过查阅最新版《临床用药须知》等相关权威资料，得到人用每千克体重每小时的最大供试品剂量（M值）并求出L值，将所求得的L值与相关的质量标准（《美国药典》、《英国药典》、《日本药局方》、《欧洲药典》）以及国家食品药品监督管理局颁布的转正标准或注册标准散件中关于该品种的细菌内毒素限值进行参考对比。
还有一种方法是参考该品种的热原检查剂量（可视为M值），因为热原剂量的设置一般为成人临床用量的1～3倍，与常用的安全系数3～10倍较为接近，这种参考热原检查剂量的做法在以前颇为盛行，现在已逐渐少用。
1.3 细菌内毒素限值计算的常见误区
1.3.1 将成人日均用量误作最大用量 大多数情况下，说明书或资料往往只提供了某药的单次或每日用量，实践中不少人往往将单次用量误作最大用量进行限值计算，所得限值明显偏宽。众所周知，除极少数情况（急性、重症患者用药）下的单次用量可作为最大用量外，多数情况的日常用量换算成最大用量，还需考虑一定的安全系数（一般取3～10倍）。
1.3.2 误将每日总用量当成每次最大用量 只根据说明书或资料提供的某药的每日总用量，未考虑该药品总量的静脉滴注时间已经远不止1 h，这样求得的限值难于真实反映实际限值，因为M值是反映人用每千克体重每小时能接受的最大供试品剂量，而非全日的总用量。
1.3.3 对于大输液的细菌内毒素限值确定过于按部就班 没有考虑大输液的特殊要求，大输液的主药成分只占其中很少的一部分，实际多为葡萄糖注射液或生理盐水注射液，如果按主药成分计算细菌内毒素限值的话，容易偏宽，因而如无特殊情况一般将热原检查剂量10 ml/kg视为最大临床用量，将大输液细菌内毒素限值定为0.5 EU/ml。
1.3.4 忽视滴注时带入的外源性细菌内毒素 某些新药在临床使用时是溶于大输液进行滴注的。假设某抗生素药品的规格是1 g/支，其使用方法是溶于5%葡萄糖注射液250 ml，在1 h内滴注完毕。可参照下述方法计算该抗生素细菌内毒素限值，此时K=5 EU/（kg・h），因而60 kg的成人每小时体内可以接受细菌内毒素的最大量为300 EU，而在1 h内250 ml的5%葡萄糖注射液最大可带来125 EU的细菌内毒素，1 g的该药最多只能带入175 EU（125～300 EU）的细菌内毒素，因而该抗生素其细菌内毒素限值可定为0.175 EU/mg。如果按常规计算的话，求得限值为0.300 EU/mg。
1.3.5 没有考虑到主药外的其他成分 在细菌内毒素限值的确定过程中，特别是原料，要注意扣除主药外的其他成分（如金属离子：头孢噻肟钠中的钠，西司他丁钠中的钠），因为标准一般规定为每毫克中头孢噻肟或西司他丁所含的细菌内毒素量不得过多少EU，而制成的原料往往是含钠等其他成分的。
2 鲎试剂灵敏度复核试验
2.1 前期准备工作
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。耐热器皿常用干热灭菌法（250℃，30 min以上）去除，部分物品也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法（如强酸强碱浸泡法），但需经过确证不干扰鲎试验检查。
2.2 灵敏度复核试验

当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。需要注意的是，当实测灵敏度λc在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ～2.0λ，λ为鲎试剂灵敏度的标示值）时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度，日常检验中部分检验者误将实测的灵敏度作为批鲎试剂的灵敏度来进行常规检查或干扰试验。
3 鲎试验检查的干扰试验
3.1 最大有效稀释倍数（MVD）的确认
MVD是指在试验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数，计算公式为MVD=C・L/λ，式中L为供试品的内毒素限值，λ为鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml），或是在光度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度；C为供试品液的浓度，当L以EU/ml表示时，则C等于1.0；如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度C=λ/L。
此处往往根据市售主要的鲎试剂灵敏度范围（0.03～1.00 EU/ml）来计算干扰试验中的有效浓度稀释范围。
3.2 干扰预试验
取本品1支（原料精密称取不低于10 mg的量），按照拟定内毒素限值，原料或注射用粉针加内毒素检查用水溶解并稀释至不超过MVD规定的系列浓度，注射液直接稀释至不超过最小有效稀释浓度的系列浓度，预试验时一般可取一个厂家灵敏度为0.125 EU/ml或0.250 EU/ml的鲎试剂，对供试品原液及其系列稀释液（供试品阴性对照，NPC）进行干扰检验，另外设立阳性对照（PC）、阴性对照（NC）、供试品阳性对照（PPC），每个浓度平行做两管，最终得出供试品（批号：20100802）在某浓度及以下浓度对鲎试验检查不产生干扰作用（PPC首次出现“++”的浓度）的结论。供试液的干扰预试验结果，见表1。
由表1可以看出，供试品在不高于20 mg/ml的浓度下不干扰鲎试验的检查。
3.3 正式干扰试验
按表2制备各系列溶液，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过MVD的溶液，参照鲎试剂灵敏度复核试验项下操作，记录供试液的干扰情况。

只有当供试品溶液和阴性对照溶液的平行管都为阴性，且鲎试剂标示灵敏度的对照系列溶液的结果在鲎试剂灵敏度范围内时，试验方为有效，计算系列鲎试剂标示灵敏度的对照系列溶液和干扰试剂系列溶液的反应终点浓度的几何平均值（Es和Et）。当Es在0.5λ～2.0λ及Et在0.5Es～2.0Es时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。
当进行新药的内毒素检查试验前或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验；当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。
4 排除供试液干扰的方法[3]
4.1 样品稀释法
选用较高灵敏度的鲎试剂，将供试品进一步稀释（低于最大有效稀释倍数）后进行干扰试验，一般情况下大部分的干扰作用均能得到有效控制。
4.2 调节pH法
测定供试液的pH值，若不在鲎试剂的有效缓冲pH范围（6.0～8.0），可选用一定浓度的HCl或NaOH将pH值调节至6.0～8.0，但要注意应进行方法学验证（干扰试验），确保不干扰鲎试验检查，且对内毒素检查结果无影响。
4.3 超滤法
通过专用超滤系统，将影响内毒素检查的药物小分子杂质滤除，内毒素则留存于滤器内，滤器内加入相应的内毒素检查用水进行检查，可在几乎不影响内毒素浓度的前提下尽量避免小分子药物的干扰作用。
4.4 其他方法
微温保持加热法；使用去G因子鲎试剂或厂家提供的专用抗增液对样品进行稀释（此时须进行干扰试验）。
5 常规检查
使用最大有效稀释倍数（MVD） 并且已经排除干扰的供试品溶液来制备溶液供试品溶液和供试品阳性对照溶液，进行细菌内毒素的常规检测。
6 讨论
建立新药品种的细菌内毒素检查法，首先要结合临床最大用量确定其细菌内毒素限值，应用两个厂家的鲎试剂对3批样品进行鲎试验检查（普通凝胶法或动态浊度法定量试验），如结果能证实样品在不低于最大有效稀释浓度时对细菌内毒素检查无干扰作用，且样品的细菌内毒素常规检查结果为阴性，此时方可建立该品种的细菌内毒素检查法[4-7]。
根据临床最大用量规定及实验结果，将所研究的新药细菌内毒素限值定为每毫克主药（或每毫升）中含内毒素的量应小于若干EU。经干扰实验确证，该新药在某个浓度或低于该浓度时（但不低于最大有效稀释浓度MVC）对细菌内毒素检查无干扰作用。取本品3批，按拟定的标准检验，其内毒素检查结果均符合规定。