细胞融合的研究方法

‘壹’ 细胞融合要历经哪些步骤

1957年，日本学者冈田善雄在培养动物细胞时加入失去活性的仙台病毒，发现能使两个动物细胞融合，产生具有两个核的细胞。研究表明，很多不同种的动物细胞都能进行融合，形成杂种细胞。如人－鼠、人－兔、人－鸡、人－蛙、鼠－鸡、鼠－兔、鼠－猴，等等。细胞融合的具体步骤包括：

（1）细胞准备。分贴壁和悬浮细胞两种，前者可直接将两亲本细胞混合培养，后者需制成一定浓度的细胞悬浮液。

（2）细胞融合。加促融因子于将行融合的细胞之中，诱导融合。

（3）杂种细胞选择。利用选择性培养基等，使亲本细胞死亡，而让杂种细胞存活。

（4）杂种细胞克隆。对选出的杂种细胞进行克隆（选择与纯化），经过培养，就能获得所需要的无性繁殖系。

‘贰’ 细胞融合解决方案

细胞融合是指两个或两个以上的细胞合并成为一个细胞的过程。在自然情况下，体内和体外培养的细胞均能发生自发融合现象。人工方法诱导细胞融合开始于50 年，现在这项技术已成为研究细胞遗传、细胞免疫，肿瘤及细胞工程的重要手段。在诱导物（如仙台病毒，聚乙二醇）作用下，相互融合的细胞发生凝集，随后在质膜接触处发生质膜成份的一系列变化，主要是某些化学键的断裂与重排，最后打通两质膜，形成双核或多核细胞（此时称同核体或异核体）。通过有丝分裂，细胞核便发生融合，形成杂种细胞。杂交zájiāo（hybridization；cross；crossing）定义：两条单链DNA或RNA的碱基配对。遗传学中经典的也是常用的实验方法。通过不同的基因型的个体之间的交配而取得某些双亲基因重新组合的个体的方法。一般情况下，把通过生殖细胞相互融合而达到这一目的过程称为杂交；而把由体细胞相互融合达到这一结果的过程称为体细胞杂交。
杂交原理
杂交是通过不同稻种相互杂交产生的，而水稻是自花授粉作物，对配制杂交种子不利。要进行两个不同稻种杂交，先要把一个品种的雄蕊进行人工去雄或杀死，然后将另一品种的雄蕊花粉授给去雄的品种，这样才不会出现去雄品种自花授粉的假杂交。可是，如果用人工方法在数以万计的水稻花朵上进行去雄授粉的话，工作量极大，实际并不可能解决生产的大量用种。因此，研究培育出一种水稻做母本，这种母本有特殊的个性，它的雄蕊瘦小退化，花干瘪畸形。靠自己的花粉不能受精结籽。
为了不使母本断绝后代，要给它找两个对象，这两个对象的特点各不相同:第一个对象外表极像母本，但有健全的花粉和发达的柱头，用它的花粉授给母本后，生产出来的是女儿。长得和母亲一模一样，也是雄蕊瘦小退化，花干瘪畸形、没有生育能力的母本:另一个对象外表与母本截然不同，一般要比母本高大，也有健全的花粉和发达的柱头，用它的花粉授给母本后，生产出来的是儿子，长得比父、母亲都要健壮。这就是需要的杂交，一个母本和它的两个对象，人们根据它们各自不同特点，分别起了三个名字:母本叫做不育系，两个对象，一个叫做保持系，另一个叫做恢复系，简称为"三系"。有了"三系"配套，就知道在生产上是怎样配制杂交的了:生产上要种一块繁殖田和一块制种田，繁殖田种植不育系和保持系，当它们都开花的时候，保持系花粉借助风力传送给不育系，不育系得到正常花粉结实，产生的后代仍然是不育系，达到繁殖不育系目的。可以将繁殖来的不育系种子，保留一部分来年继续繁殖，另一部分则同恢复系制种，当制种田的不育系和恢复系都开花的时后，恢复系的花粉传送给不育系，不育系产生的后代，就是提供大田种植的杂交稻种。由于保持系和恢复系本身的雌雄蕊都正常，各自进行自花授粉，所以各自结出的种子仍然是保持系和恢复系的后代。

‘叁’ 细胞融合的基本原理和方法

（1）病毒诱导助融
其实, 细胞融合在自然界是存在的, 细胞融合研究首先也是基于自发的细胞融合。1 9 5 7
年, 冈田善雄意外发现仙台病毒( H vJ ) , 能诱导悬液中艾氏腹细胞融合。然后H ar ri s 、
K a d a 等用于诱导种间细胞融合, 获得成功。
（2）化学助融
1 9 7 2 年, 卡尔森首先用硝酸钠进行烟草两个种的细胞原生质体的融合, 1 9 7 4 年Kao等首先发现PEG ( 聚乙二醇) 能诱导植物细胞原生质体融合产生杂交细胞。1975年Pentecorvo。发现PE G 亦能帮助哺乳类动物细胞的融合, 1 9 7 6 年D a vi d s o n 更进一步证实这一结果, 并且认为其具有简单快速、高效率等优点。因而, 75 年之后聚乙二醇就逐渐取代了仙台病毒。
（3）电融合法
电融合法是70 年代未期和80 年代初期发展起来的一种新的细胞融合方法。Senda (1970)
首先应用电脉冲, 通过微电极在显微镜下使植物细胞融合, 奠定电融合技术基础
（4）激光诱导卵细胞融合
激光诱导卵细胞融合是最新的细胞融合方法。该法为张闻迪( 1 9 8 8 ) 等人首先应用。他们利用激光微束的单色性、高功率密度、短脉宽和极小的作用范围等特点。对泥鳅受精卵进行
融合试验, 获得成功, 且融合后的细胞可存活发育, 经卵裂期、囊胚期、原肠期、孵化期、
直至幼鱼。整个过程可通过显微镜观察, 还可同时由电视摄象监视器观察和进行照相记录
。

‘肆’ 动物细胞融合的方法

还有：震动，病毒。
诱导细胞融合的方法有三种：生物方法（病毒）、化学方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（离心，震动，电刺激）。某些病毒如：仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒的被膜中有融合蛋白（fusion protein），可介导病毒同宿主细胞融合，也可介导细胞与细胞的融合，因此可以用紫外线灭活的此类病毒诱导细胞融合。化学和物理方法可造成膜脂分子排列的改变，去掉作用因素之后，质膜恢复原有的有序结构，在恢复过程中便可诱导相接触的细胞发生融合。

培养基的差异：动物细胞的培养基是液体培养基、血清培养基，而植物培养基是固体培养基。

以下是动物培养基和植物培养基的具体内容：
动物培养基：
1.动物细胞培养液的成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。动物细胞培养成功的关键在于培养液中是否含有动物血清，因为由于动物细胞生活的内环境还有一些成分尚未研究清楚，所以需要加入动物血清以提供一个类似生物体内的环境，此外动物血清中也包含了一些动物的激素和酶，可以促进细胞的发育。
2.动物细胞培养液的特点：液体培养基、含动物血清。

植物培养基：
（ 1 ）愈伤组织诱导培养基： MS 培养基（蔗糖含量为 10 g/L ， 2,4 – D 含量为 2 mg/L ，琼脂 10 g/L ）。
（ 2 ）试验培养基：在 MS 培养基中加入 IAA 和 6–BA 。
吲哚乙酸（IAA)先用少量 0.1 mol/L NaOH 溶解， 6- 苄基氨基腺嘌呤先用少量 0.1 mol/L HCl 溶解，然后用蒸馏水稀释，再加入培养基中。

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‘伍’ 4，诱导细胞融合的方法有哪些

在体外培养条件下，动物细胞会自发融合，但是频率极低。因此，一般都需要添加具有诱导细胞融合效应的生物或化学药剂，或者采用电融合技术，人为地促进细胞融合。

1.病毒诱导融合

病毒是最早采用的融合剂。常用于诱导动物细胞融合的病毒有仙台病毒、新城鸡瘟病毒、疱疹病毒等，其中仙台病毒最常用。用作融合剂的病毒必须事先用紫外线或β-丙内酯灭活，使病毒的感染活性丧失而保留病毒的融合活性。

2.用灭活的仙台病毒诱导细胞融合的

优点：融合率较高，对各种动物细胞都适宜，且仙台病毒能在鸡胚中大量繁殖，容易培养；

缺点：仙台病毒不稳定，在保存过程中融合活性会降低，并且制备过程比较烦琐。此外，病毒引进细胞后，可能会对细胞的生命活动产生干扰。

3.聚乙二醇PEG诱导融合

聚乙二醇PEG具有强烈的吸水性以及凝聚和沉淀蛋白质的作用，能够有效地促进植物原生质体和动物细胞的融合。在不同种类的动物细胞混合液中加入聚乙二醇，就会发生细胞凝集作用；在稀释和除去聚乙二醇的过程中，就会发生细胞融合。聚乙二醇诱导细胞融合的机理，目前还不太清楚。聚乙二醇是化学试剂，使用起来很方便，诱导细胞融合的频率比较高，但是它有一定毒性，对有些细胞(如卵细胞)不适用。

4.电融合

20世纪80年代建立起来的电融合技术，是将两种细胞的混合液置于低压交流电场中，使细胞聚集成串珠状，然后施加高压电脉冲，以促使细胞融合。紧密排列的细胞，在相互接触的细胞膜之间会出现无蛋白颗粒的脂质区，当受到电击时，这个区域就会被击穿，产生脂双层膜孔，导致细胞之间的细胞质连通，进而发生细胞融合。电融合技术有许多优点，如诱导细胞融合的频率高，对细胞无毒害作用，操作简便，可重复性好。

资料拓展：

19世纪30年代，科学家们相继在肺结核，天花，水痘，麻疹等疾病患者的病理组织中观察到多核细胞。

19世纪70年代，科学家们在蛙的血细胞中也看到了多核细胞的现象细胞融合，但是当时科学发展水平的限制，没有给予足够重视。

1962年，日本科学家发现日本血凝型病毒能引起艾氏腹水瘤细胞融合的现象。

1965年，英国科学家进一步证实了灭活的病毒在适当的条件下也可以诱发动物细胞融合。

后来科学家又成功诱导了不同种动物的体细胞融合，并且能将杂种细胞培养成活。细胞融合技术不断改进，现在已广泛应用于细胞学，遗传学，免疫学，病毒学等多种学科的研究工作中。

‘陆’ 什么是细胞融合技术

在自发或人工诱导下，两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞。基本过程包括细胞融合形成异核体、异核体通过细胞有丝分裂进行核融合、最终形成单核的杂种细胞。有性繁殖时发生的精卵结合是正常的细胞融合，即由两个配子融合形成一个新的二倍体。

自发的动物细胞融合概率很低，1962年Okada和Tadokoro发现灭活的仙台病毒有促进细胞融合的作用。这是由于病毒的磷脂外衣与动物细胞的膜十分相似的缘故。病毒外壳上的某些糖蛋白可能还有促进细胞融合的功能。此外，用聚乙二醇作为细胞融合剂，它可引起邻近的细胞膜的粘合，继而使细胞融合成为一个细胞。

细胞融合，即在自然条件下或用人工方法(生物的、物理的、化学的)使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的过程。人工诱导的细胞融合，在20世纪60年代作为一门新兴技术而发展起来。由于它不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此细胞融合技术目前被广泛应用于细胞生物学和医学研究的各个领域。

细胞融合的诱导物种类很多，常用的主要诱导物有灭活的仙台病毒、化学法如用聚乙二醇和物理法如电脉冲。目前应用最广泛的是聚乙二醇，因为它易得、简便且融合效果稳定。PEG的促融机制尚不完全清楚，它可能引起细胞膜中磷脂的酰键及极性基团发生结构重排。动植物细胞融合方法不同，生物法利用灭活仙台病毒是动物细胞融合所特有的。

自发条件下或人工诱导下， 两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞。基本过程包括细胞融合导致异核体的形成， 异核体通过细胞有丝分裂导致核的融合， 形成单核的杂种细胞。有性生殖时发生正常的细胞融合， 即由两个配子融合成一个合子。

人、鼠细胞融合实验分三步进行：首先，用荧光染料标记抗体。将小鼠的抗体与发绿色荧光的荧光素结合， 人的抗体与发红色荧光的罗丹明结合；第二步是将小鼠细胞和人细胞在灭活的仙台病毒的诱导下进行融合；最后一步将标记的抗体加入到融合的人、鼠细胞中，让这些标记抗体同融合细胞膜上相应的抗原结合。开始，融合的细胞一半是红色， 一半是绿色。在37 ℃下40分钟后， 两种颜色的荧光在融合的杂种细胞表面呈均匀分布，这说明抗原蛋白在膜平面内经扩散运动而重新分布，这种过程不需要ATP。如果将对照实验的融合细胞置于低温(1 ℃)下培育， 则抗原蛋白基本停止运动。这一实验结果令人信服地证明了膜整合蛋白的侧向扩散运动。

通过培养和诱导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合或细胞杂交。 基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体；来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体。 同种细胞在培养时两个靠在一起的细胞自发合并，称自发融合；异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合，称诱发融合。 诱导细胞融合的方法有3种：生物方法（病毒）、化学方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（电击和激光）。某些病毒如仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒的被膜中有融合蛋白，可介导病毒同宿主细胞融合，也可介导细胞与细胞的融合，因此可以用紫外线灭活的此类病毒诱导细胞融合。化学和物理方法可造成膜脂分子排列的改变，去掉作用因素之后，质膜恢复原有的有序结构，在恢复过程中便可诱导相接触的细胞发生融合。

细胞融合不仅可用于基础研究，而且还有重要的应用价值，在植物育种方面已经成功的有萝卜+甘蓝、粉蓝烟草+郎氏烟草、番茄+马铃薯等等。

‘柒’ 动物细胞融合的方法原理

诱导细胞融合的方法有三种：生物方法（病毒）、化学方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（离心，震动，电刺激）。某些病毒如：仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒的被膜中有融合蛋白（fusion protein），可介导病毒同宿主细胞融合，也可介导细胞与细胞的融合，因此可以用紫外线灭活的此类病毒诱导细胞融合。化学和物理方法可造成膜脂分子排列的改变，去掉作用因素之后，质膜恢复原有的有序结构，在恢复过程中便可诱导相接触的细胞发生融合。
细胞融合不仅可用于基础研究，而且还有重要的应用价值，在植物育种方面已经成功的有萝卜+甘蓝、粉蓝烟草+郎氏烟草、番茄+马铃薯等等。 而动物细胞融合技术最重要的用途是制备单克隆抗体。
原理：细胞膜具有一定的流动性

‘捌’ 细胞融合的融合方法

同种细胞在培养时2个靠在一起的细胞自发合并，称自发融合；异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合，称诱发融合。
仙台病毒法融合
①两种细胞在一起培养，加入病毒，在4℃条件下病毒附着在细胞
膜上。并使两细胞相互凝聚；
②在37℃中，病毒与细胞膜发生反应，细胞膜受到破环，此时需
要Ca2+和Mg2+，最适PH为8.0一8.2；
②细胞膜连接部穿通，周边连接部修复，此时需Ca2+和ATP；
④融合成巨大细胞，仍需ATP。
聚乙二醇（PEG）法
聚乙二醇（PEG）结构为：HOH2C（CH20CH2)nCH2OH，分子量大于200小于6000者均可用作细胞融合剂。PEG经高压灭菌后，与温热的Engle氏液混合。一般选用分子量为4,000，常用浓度为50%，pH8.0～pH8.2（用10%NaHCO3调整），分子量小的PEG，融合效应差，又有毒性，分子量过大，则粘性太大，不易操作。
电融合法
在直流电脉冲的诱导下，细胞膜表面的氧化还原电位发生改变，使异种细胞粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜，形成融合体。
优点：融合率高、重复性强、对细胞伤害小；
装置精巧、方法简单、可在显微镜下观察或录像观察融合过程；
免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控性强。
离心振动
物理方法之一，使用离心机等机器实现细胞之间的融合。

‘玖’ 细胞是怎样融合的

在离体条件下，利用融合诱导剂，把相同或不同物种的体细胞人为地融合，形成杂合细胞的过程。这是一种新的获得杂交细胞以改变细胞性能的技术，是细胞遗传学、细胞免疫学、病毒学、肿瘤学等研究的一种重要手段。

从20世纪70年代开始，已经有许多种细胞融合成功，有植物间、动物间、动植物间，甚至人体细胞与动植物间，成功融合的新杂交植物如“西红柿马铃薯”、“拟南芥油菜”和“蘑菇白菜”等。