药物分析tlc杂质检查方法

⑴ 利用薄层色谱对药物进行鉴别和杂质检查时应注意哪些操作事项

薄层色谱法(The layer chromatography，TLC)是将固定相均匀的涂布在具有光洁表面的玻璃、塑料或金属板上形成薄层，在此薄层上进行色谱分离的方法，它属于平板色谱，是一种常用的色谱分离方法。
TLC法被许多国家药典用于药物中杂质的检查、药物分析等方面，且是目前药典中收载最多的鉴别与有关物质检查方法之一，具有设备简单、操作简便、分离速度快，灵敏度和分辨率较高等优点。
而薄层色谱在药物分析中，则常用薄层色谱扫描法，其主要用于以下几个方面：
1、中药材与中成药的鉴别与成分分析
2、 合成药物及其制剂分析
3、药物代谢研究

4、抗菌素分析
5、中药的TLC指纹图谱鉴别
高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术应用。
是20世纪70年代迅速发展起来的一种高效、快速、高选择性、高灵敏度的新型分离分析技术，是经典液相色谱的发展。
高效液相色谱法在药物分析中的应用主要是鉴别相关物质、检查药物中有关物质的含量限度，测定有效成分或主要成分含量。
1、在药物鉴别中的应用
在HPLC法中，保留时间与组分的结构和性质有关，是定性的参数，可用于药物的鉴别，在中国药典中就有大量的药物采用此法进行鉴别。
2、在杂质检查中的应用
历年来各国药典中收载了多种药物采用HPLC法进行杂质检查的方法，并且可采用HPLC法进行杂质检查的药物种类在逐年颁布的药典中有所增加。
3、在含量测定中的应用
用高效液相色谱法测定合成药及其制剂的含量，可以消除药物中的杂质，制剂中的附加剂及共存药物的干扰。

⑵ 分析方法学验证之(三):检测限和定量限

这一期我们就来说说方法的灵敏度。

灵敏度（Sensitivity）是指某方法对单位浓度或单位量待测物质变化所引起的响应量变化程度。它可以用仪器的响应值或其他指示量与对应的待测物质的浓度或量之比来描述。它是分析方法的基本属性，标志着方法的检出能力，包括了检测限和定量限。

定义和分类

检测限（Limit of Detection，LOD）：系指试样中被测物能被检测出的最低量。检测限仅作为限度试验指标和定性鉴别的依据，没有定量意义。因此需要注意的是在检出限附近不能进行准确的定量，且报告未检出时应附上方法的检测限。

定量限（Limit of Quantitation，LOQ）：系指试样中被测物能被定量测定的最低量。对于微量或痕量药物分析、定量测定药物杂质和降解产物时，应确定方法的定量限。需要注意的是定量限的测定结果应符合准确度和精密度要求。同时定量限的浓度通常应小于等于报告限的浓度，以确保报告数值的准确可靠。

另外需要注意的是：

• 定量限/检测限有些地方会翻译为Quantitation limit，QL和Detection Limit，DL，这个根据各个公司自己规定执行即可。

• 在一些国外的质检报告（COA）中可能会出现LOD表示为Loss On Drying（干燥失重）的缩写，需要注意区分。

• 本文讨论的检测限均指的是分析方法的检测限，对于仪器检出限和方法检出限的区别，我们后面再细细讨论。

做法和要求

1）直观法

用已知浓度的被测物，试验出能被可靠地检测出的最低浓度或量。

如薄层色谱TLC法，通过配制一系列已知浓度的样品来试验，直至能够明显观察到斑点。

2）基于响应值标准偏差和标准曲线斜率法

通过多次空白测定和标准曲线的建立，分别获得响应值偏差和标准曲线的斜率来计算得到最低浓度。计算公式为：

• 峰峰漂移修正间的噪声（PtoP）

• 用ASTM 方法检测的噪声 (ASTM)

4）基于精密度和准确度的特定浓度

ICH Q2（R2）在原先几种方法的基础上提出了一个新的方法——基于准确度和精密度的方法下限。

（注：ICH Q2中提出了方法的工作范围Working Range这个概念，并将线性和定量限/检测限合并了，其中下限lower range limit即可理解为方法的定量限和检测限。）

看原文：

4.2.2.3 Based on Accuracy and Precision at lower range limits

Instead of using estimated values as described in the previous approaches, the QL can be directly validated by accuracy and precision measurements.

不同于原先方法的估算浓度，定量限可以直接通过验证方法的精密度和准确度来设定。

然后在此项的数据要求中，有这样一段描述：

Also, the QL and the approach used for its determination should be presented.

相同的，定量限的浓度以及测定方法是需要明确指出来的。

If the QL was estimated, the limit should be subsequently validated by the analysis of a suitable number of samples known to be near or at the QL. In cases where the QL is well below (e.g.,approximately 10 times lower than) the reporting limit, this confirmatory validation can be omitted with justification.

如果定量限是估算出来的，那么这个限度浓度应该使用一系列已知的并且在定量限附近浓度的样品来确认的。如果定量限远小于报告限（如1/10或更低），那么它是可以不像前面的做法来做确认的，进行解释说明即可。

For impurity tests, the quantitation limit for the analytical procere should be equal to or below the reporting threshold.

对于杂质测定来说，分析方法的定量限应小于或等于报告限。

对此，个人理解ICH在传递的信息是：方法的灵敏度满足使用需求即可（类似于Q3A中指出报告限的作用）。我们无需去证明方法的灵敏度有多高，只需要保证我们设定的特定限度满足方法准确定量的要求即可。

随着这个观点的转变，将使得LOD/LOQ从一个未知的浓度（需要估算或一系列实验来摸索测定）变成了一个已知的浓度（特定的满足使用要求的浓度），从解题变成了证明题，使得大家一下子变得轻松了许多。

实际上这个观点，在国内很多人已经提出过并且也在被越来越多的人接受。原因就是在原先的要求下（既要满足信噪比要求，又要满足精密度和准确度要求），一方面两者很难兼得，为达到要求往往需要耗费较多的精力；另一方面不同人员、不同仪器、不同时间、不同实验室很难得出一个相同的浓度。因此大家在进行灵敏度验证的时候就会变得非常纠结和痛苦。

采用这个新理念在具体的方法验证过程中，对于定量限的验证，需要做的就是选择一个特定的浓度（通常以报告限为基础，结合实际的控制限度，如报告限的一半或更低），然后用精密度和准确度的做法来验证选定的定量限的这个浓度点。

文章最后，我们还需要再强调的一点就是：定量限是要保证精密度和准确度的！

因此定量限下的准确度和精密度是需要验证的，验证的可接受标准是不可以独自放宽的。

⑶ 药典采用的色谱法中 最常用于特殊杂质限量检查的方法是

药物中杂志限量的控制方法有两种：一种为限量检查法，另一种是对杂质进行含量测定。
限量检查法不需要进行准确定量，只需检查杂质是否超过限量。
进行限量检查，多采用对照法，灵敏度法，比较法。
1 对照法：取一定量的被检杂质标准溶液和一定量供试品溶液，在相同条件下处理，比较反应结果，已确定杂质含量是否超过限量。
2灵敏度法：在供试品溶液中加入一定量的试剂，在一定反应条件下，不得有正反应出现。该法不需要杂质对照品溶液。如乳酸中枸橼酸，草酸，磷酸或酒石酸的检查。
3比较法：取供试品一定量依法检查，测定特定待检杂质的参数（如吸光度）与规定的限量进行比较，不得更大。
关于残留溶剂，常使用GC。
定量测定主要使用色谱法，包括TLC(盐酸环丙沙星中氟喹啉酸检查）
HPLC（红霉素中红霉素BC检查）