研究药物蛋白结合的实验方法有

A. 血浆蛋白结合率（plasma protein binding, PPB）的测定方法

药物在吸收入血后以游离态和结合态两种形式存在，其中血浆蛋白结合率（PPB）表示与血浆蛋白结合形成结合态药物的比例。游离药物假说认为仅有游离态的药物才能扩散透过生物膜，到达靶部位发挥药效；另外，游离药物的比例还显着影响药物分布、代谢和排泄的过程。PPB与药物的诸多药理性质均有关。本文将阐述PPB的基本原理和测定方法。

血浆蛋白主要作为载体负责各类外源性和内源性分子在循环系统内的转运。其中参与小分子药物结合的主要有白蛋白、α-1-酸性糖蛋白（AAG）、球蛋白和脂蛋白，主要以白蛋白和AAG为主。药物与蛋白的结合强弱主要与药物-蛋白亲和力、蛋白丰度相关。

人血清白蛋白（HSA）为非糖基化单体蛋白，由585个氨基酸、17二硫化物和1个半胱氨酸残基组成其在体内浓度约为500-700μM，为人体血浆中含量最高的蛋白类型。除了作为各类物质转运载体，HSA还辅助维持血液渗透压和pH值。药物与HSA的非共价结合由小分子药物与蛋白氨基酸残基的高亲和性结合介导形成，可帮助药物躲过肾脏排泄、肝脏代谢和血流作用。酸性化合物更倾向结合于HSA，碱性化合物更易于AAG结合。

α-1-酸性糖蛋白（AAG）为血浆中药物结合相关的另一重要蛋白，其具有高度糖基化的特点，由此形成大量的负电荷，其等电点约为2.7-3.2，更倾向与碱性化合物结合。AAG的生理功能主要与免疫抑制、免疫调节、血小板聚集、淋巴细胞增殖和IL-2分泌等过程相关。正常生理条件下血清中AAG的浓度约为9-23μM，但是其表达水平会随着免疫或炎症反应的发生而升高。药物-AAG结合过程主要与AAG的浓度、AAG多态性、多糖异质性和pH等因素相关，其中AAG的浓度影响最为明显。疾病状态下炎症和免疫反应的发生通过影响PPB进而影响药物PK特征，尤其在化合物与AAG的结合能力较强的条件下。

目前常用于PPB测定的方法主要包括平衡透析法（ED）、超滤法（UF）、超速离心法（UC）和其他不常用的方法。

平衡透析法（ED）采用半透膜分割的两隔室装置进行测定，一侧加入含药的蛋白溶液，另一侧加入空白的缓冲液。仅游离药物可以自由穿过半渗透膜，孵育一段时间后，两侧达到平衡状态，结合态的药物仍然停留于蛋白溶液侧。通过测定两侧的药物浓度即可算得PPB。震荡的条件可以加速平衡的过程，高分子量和结合能力强的化合物需要较长的平衡时间。

超滤法（UF）与平衡透析法类似，采用半透膜分隔的两隔室装置进行测定。含药蛋白溶液加入上层隔室，在外界压力或离心条件快速使游离药物运动至下方buffer侧。该方法相比ED优势在于试验时间短，可显着减少酯酶代谢、蛋白稀释和蛋白渗漏造成的试验偏差。该方法的最大劣势为药物非非特异性结合效应较明显，尤其对于高脂溶性化合物。进行中性和碱性化合物测定时，采用吐温-80预处理半透膜；酸性化合物时，用苯扎氯铵预处理可以降低非特异性结合。

超速离心法（UC）利用非常高的离心力（625000g）来分离游离态和结合态药物。离心之后结合态的药物与血浆蛋白一起分布于底层，中间层即为游离药物分布层。通过测定中间层和离心前初始药物浓度即可算得PPB。该方法成本相对较高，但具有时间短、样品需求量小、非特异性吸附效应弱和消除膜相关问题的优势。UC的缺陷为在超速离心的作用下可能改变化合物的结合平衡。

固相微萃取法（SPME）通过将游离药物萃取至固相载体的疏水性涂层实现PPB测定。微量萃取技术避免游离化合物分配至溶液中，适用于测定水溶性较低的化合物。微萃取还结合应用了固相载体脂质膜技术、红细胞分区等技术。此外，快速平衡透析（RED）、压力辅助的毛细管电泳（PACE）也有应用。基于化合物结构、血浆蛋白三维结构和可结合位点特征，运用QSPR技术等in silico的方法进行预测。

综上所述，影响PPB测定的因素很多，如溶解度、温度、非特异性结合、酯酶代谢等。需根据化合物的特征，结合研究的实际目的，选择合适的测定方法反应真实的化合物特性。需根据化合物预期治疗浓度，个性化地制定试验浓度，必要时进行不同浓度条件下的PPB测定。对于极高蛋白结合率的化合物，试验的微小偏差即会对结果造成较大的相对偏差，此时还需同步优化精密度更高的LC-MS/MS、放射性等检测分析技术。

B. 毛细管电泳的结合常数

生物体内，蛋白质是必不可少的生命物质，是药物的重要靶点之一。研究药物与蛋白质之间的相互作用，有助于了解药物在体内的运输和分布的情况，对于阐明药物的作用机制、药代动力学以及药物的毒性都有非常重要的意义。药物分子与蛋白质分子相互结合的主要部位是蛋白质上的碱性氨基酸残基，相互作用力主要有静电作用、氢键、疏水作用、范德华力和电荷转移作用，通常药物与蛋白之间的相互作用并不是一种作用力的单独作用，而是多种作用力的协同作用。这种相
互作用的量化参数就是药物与蛋白的结合常数Ka。
结合常数Ka 的测定方法现主要有：荧光光谱法，红外光谱法，毛细管电泳法，核磁共振法，以及电化学等方法。其中毛细管电泳法以其效率高，速度快等优点，已被较多采用。Scatchard 模型是现在公认的测定药物与蛋白结合参数的理论模型。
区带毛细管电泳法是利用蛋白质与药物的结合产物同游离的药物或蛋白的淌度差异来研究相互作用的。