球蛋白純化一般最常用的方法

1. 蛋白質的分離純化技術有哪些

蛋白質的分離純化方法很多，主要有：
（一）根據蛋白質溶解度不同的分離方法
1、蛋白質的鹽析
中性鹽對蛋白質的溶解度有顯著影響，一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質的溶解度增加，此稱鹽溶；當鹽濃度繼續升高時，蛋白質的溶解度不同程度下降並先後析出，這種現象稱鹽析，將大量鹽加到蛋白質溶液中，高濃度的鹽離子（如硫酸銨的 SO4 和 NH4)有很強的水化力，可奪取蛋白質分子的水化層，使之「失水」，於是蛋白質膠粒凝結並沉澱析出。鹽析時若溶液 pH 在蛋白質等電點則效果更好。由於各種蛋白質分子顆粒大小、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣，因此調節混合蛋白質溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質分段沉澱。
影響鹽析的因素有：（1）溫度：除對溫度敏感的蛋白質在低溫（4 度）操作外，一般可在室溫中進行。一般溫度低蛋白質溶介度降低。但有的蛋白質（如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白）在較高的溫度（25 度）比 0 度時溶解度低，更容易鹽析。（2）pH 值：大多數蛋白質在等電點時在濃鹽溶液中的溶介度最低。（3）蛋白質濃度：蛋白質濃度高時，欲分離的蛋白質常常夾雜著其他蛋白質地一起沉澱出來（共沉現象）。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋，使蛋白質含量在 2.5-3.0%。蛋白質鹽析常用的中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。 其中應用最多的硫酸銨，它的優點是溫度系數小而溶解度大（25 度時飽和溶液為 4.1M，即 767 克/升；0 度時飽和溶解度為 3.9M，即 676 克/升），在這一溶解度范圍內，許多蛋白質和酶都可以鹽析出來；另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，不易引起蛋白質變性。硫酸銨溶液的 pH 常在 4.5-5.5 之間，當用其他 pH 值進行鹽析時，需用硫酸或氨水調節。蛋白質在用鹽析沉澱分離後，需要將蛋白質中的鹽除去，常用的辦法是透析，即把蛋白質溶液裝入秀析袋內（常
用的是玻璃紙），用緩沖液進行透析，並不斷的更換緩沖液，因透析所需時間較長，所以最好在低溫中進行。此外也可用葡萄糖凝膠 G-25 或 G-50 過柱的辦法除鹽，所用的時間就比較短。
2、等電點沉澱法
蛋白質在靜電狀態時顆粒之間的靜電斥力最小，因而溶解度也最小，各種蛋白質的等電點有差別，可利用調節溶液的 pH 達到某一蛋白質的等電點使之沉澱，但此法很少單獨使用，可與鹽析法結合用。
3、低溫有機溶劑沉澱法
用與水可混溶的有機溶劑，甲醇，乙醇或丙酮，可使多數蛋白質溶解度降低並析出，此法分辨力比鹽析高，但蛋白質較易變性，應在低溫下進行。
（二）根據蛋白質分子大小的差別的分離方法
1、透析與超濾
透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質分開。超濾法是利用高壓力或離心力，強使水和其他小的溶質分子通過半透膜，而蛋白質留在膜上，可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質。
2、凝膠過濾法
也稱分子排阻層析或分子篩層析，這是根據分子大小分離蛋白質混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠（Sephadex ged）和瓊脂糖凝膠（agarose gel）。
（三）根據蛋白質帶電性質進行分離
蛋白質在不同 pH 環境中帶電性質和電荷數量不同，可將其分開。
1、電泳法
各種蛋白質在同一 pH 條件下，因分子量和電荷數量不同而在電場中的遷移率不同而得以分開。值得重視的是等電聚焦電泳，這是利用一種兩性電解質作為載體，電泳時兩性電解質形成一個由正極到負極逐漸增加的 pH 梯度，當帶一定電荷的蛋白質在其中泳動時，到達各自等電點的 pH 位置就停止，此法可用於分析和制備各種蛋白質。
2、離子交換層析法
離子交換劑有陽離子交換劑（如：羧甲基纖維素；CM-纖維素）和陰離子交換劑（二乙氨基乙基纖維素；DEAE?FONT FACE="宋體" LANG="ZH-CN">纖維素），當被分離的蛋白質溶液流經離子交換層析柱時，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質被吸附在離子交換劑上，隨後用改變 pH 或離子強度辦法將吸附的蛋白質洗脫下來。
（四）根據配體特異性的分離方法－親和色譜法
親和層析法（aflinity chromatography）是分離蛋白質的一種極為有效的方法，它經常只需經過一步處理即可使某種待提純的蛋白質從很復雜的蛋白質混合物中分離出來，而且純度很高。這種方法是根據某些蛋白質與另一種稱為配體(Ligand）的分子能特異而非共價地結合。其基本原理：蛋白質在組織或細胞中是以復雜的混合物形式存在，每種類型的細胞都含有上千種不同的蛋白質，因此蛋白質的分離（Separation），提純（Purification）和鑒定（Characterization）是生物化學中的重要的一部分，至今還沒的單獨或一套現成的方法能移把任何一種蛋白質
從復雜的混合蛋白質中提取出來，因此往往採取幾種方法聯合使用。

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2. 蛋白質的純化方法有那些呢具體步驟是什麼

蛋白質分離純化的一般程序可分為以下幾個步驟：

（一）材料的預處理及細胞破碎

分離提純某一種蛋白質時，首先要把蛋白質從組織或細胞中釋放出來並保持原來的天然狀態，不喪失活性。所以要採用適當的方法將組織和細胞破碎。常用的破碎組織細胞的方法有：

1. 機械破碎法

這種方法是利用機械力的剪切作用，使細胞破碎。常用設備有，高速組織搗碎機、勻漿器、研缽等。

2. 滲透破碎法

這種方法是在低滲條件使細胞溶脹而破碎。

3. 反復凍融法

生物組織經凍結後，細胞內液結冰膨脹而使細胞脹破。這種方法簡單方便，但要注意那些對溫度變化敏感的蛋白質不宜採用此法。

4. 超聲波法

使用超聲波震盪器使細胞膜上所受張力不均而使細胞破碎。

5. 酶法

如用溶菌酶破壞微生物細胞等。

(二) 蛋白質的抽提

通常選擇適當的緩沖液溶劑把蛋白質提取出來。抽提所用緩沖液的pH、離子強度、組成成分等條件的選擇應根據欲制備的蛋白質的性質而定。如膜蛋白的抽提，抽提緩沖液中一般要加入表面活性劑（十二烷基磺酸鈉、tritonX-100等），使膜結構破壞，利於蛋白質與膜分離。在抽提過程中，應注意溫度，避免劇烈攪拌等，以防止蛋白質的變性。

（三）蛋白質粗製品的獲得

選用適當的方法將所要的蛋白質與其它雜蛋白分離開來。比較方便的有效方法是根據蛋白質溶解度的差異進行的分離。常用的有下列幾種方法：

1. 等電點沉澱法

不同蛋白質的等電點不同，可用等電點沉澱法使它們相互分離。

2. 鹽析法

不同蛋白質鹽析所需要的鹽飽和度不同，所以可通過調節鹽濃度將目的蛋白沉澱析出。被鹽析沉澱下來的蛋白質仍保持其天然性質，並能再度溶解而不變性。

3. 有機溶劑沉澱法

中性有機溶劑如乙醇、丙酮，它們的介電常數比水低。能使大多數球狀蛋白質在水溶液中的溶解度降低，進而從溶液中沉澱出來，因此可用來沉澱蛋白質。此外，有機溶劑會破壞蛋白質表面的水化層，促使蛋白質分子變得不穩定而析出。由於有機溶劑會使蛋白質變性，使用該法時，要注意在低溫下操作，選擇合適的有機溶劑濃度。

（四）樣品的進一步分離純化

用等電點沉澱法、鹽析法所得到的蛋白質一般含有其他蛋白質雜質，須進一步分離提純才能得到有一定純度的樣品。常用的純化方法有：凝膠過濾層析、離子交換纖維素層析、親和層析等等。有時還需要這幾種方法聯合使用才能得到較高純度的蛋白質樣品。

3. 蛋白質分離提純方法

1、鹽析法：

鹽析法的根據是蛋白質在稀鹽溶液中，溶解度會隨鹽濃度的增高而上升，但當鹽濃度增高到一定數值時，使水活度降低，進而導致蛋白質分子表面電荷逐漸被中和，水化膜逐漸被破壞，最終引起蛋白質分子間互相凝聚並從溶液中析出。

2、有機溶劑沉澱法：

有機溶劑能降低蛋白質溶解度的原因有二：其一、與鹽溶液一樣具有脫水作用；其二、有機溶劑的介電常數比水小，導致溶劑的極性減小。

3、蛋白質沉澱劑：

蛋白質沉澱劑僅對一類或一種蛋白質沉澱起作用，常見的有鹼性蛋白質、凝集素和重金屬等。

4、聚乙二醇沉澱作用：

聚乙二醇和右旋糖酐硫酸鈉等水溶性非離子型聚合物可使蛋白質發生沉澱作用。

(3)球蛋白純化一般最常用的方法擴展閱讀：

吸附層析

1、吸附柱層析

吸附柱層析是以固體吸附劑為固定相，以有機溶劑或緩沖液為流動相構成柱的一種層析方法。

2、薄層層析

薄層層析是以塗布於玻板或滌綸片等載體上的基質為固定相，以液體為流動相的一種層析方法。這種層析方法是把吸附劑等物質塗布於載體上形成薄層，然後按紙層析操作進行展層。

3、聚醯胺薄膜層析

聚醯胺對極性物質的吸附作用是由於它能和被分離物之間形成氫鍵。這種氫鍵的強弱就決定了被分離物與聚醯胺薄膜之間吸附能力的大小。

層析時，展層劑與被分離物在聚醯胺膜表面競爭形成氫鍵。因此選擇適當的展層劑使分離在聚醯胺膜表面發生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的連續過程，就能導致分離物質達到分離目的。

4. 蛋白質分離純化常用方法

蛋白質分離純化常用方法有：
1、沉澱，
2、電泳：蛋白質在高於或低於其等電點的溶液中是帶電的，在電場中能向電場的正極或負極移動。根據支撐物不同，有薄膜電泳、凝膠電泳等。
3、透析：利用透析袋把大分子蛋白質與小分子化合物分開的方法。
4、層析：
a.離子交換層析，利用蛋白質的兩性游離性質，在某一特定PH時，各蛋白質的電荷量及性質不同，故可以通過離子交換層析得以分離。如陰離子交換層析，含負電量小的蛋白質首先被洗脫下來。
b.分子篩，又稱凝膠過濾。小分子蛋白質進入孔內，滯留時間長，大分子蛋白質不能時入孔內而徑直流出。
5、超速離心：既可以用來分離純化蛋白質也可以用作測定蛋白質的分子量。不同蛋白質其密度與形態各不相同而分開。

5. 蛋白質純化技術的方法有哪幾種

一、電泳：
在克隆基因表達產物的檢測分析過程中，電泳是常用的方法，但在純化蛋白時，通常都不採用電泳的方法。由於某些特殊的目的，需要用聚丙烯醯胺凝膠電泳純化蛋白質，常用下述方法進行：①從電泳後的凝膠上切下所需的相應條帶，將凝膠壓碎，用緩沖液浸泡，使其中的蛋白質擴散出來，從而獲得純化的蛋白質。此法簡單但回收率低。②將電泳後的凝膠用電洗脫的方法使蛋白質從凝膠轉移到溶液中，從而達到純化的目的。此法快速，回收率高，但需要特殊的電泳裝置。
二、色譜法：
色譜法（chromatography）是蛋白純化中最常用的一種方法，這種方法既可以制備大量的純化蛋白質，又可以保持蛋白質的生物學活性。色譜的種類很多，可分為常規色譜和高效液相色譜（high-performance liquid chromatography,HPLC）。凝膠過濾色譜、離子交換色譜、親和色譜等均為常規色譜法。HPLC包括反相高效液相色譜（reversed-phase HPLC,RP-HPLC）、離子交換高效液相色譜（ion exchange HPLC）等。根據目標蛋白性質的不同可選用相應的色譜分離技術純化蛋白質。
1.凝膠過濾色譜法
凝膠過濾色譜法（gel-filtration chromatography, GFC）又稱排阻色譜。凝膠是一類具有三維空間結構的多孔網狀顆粒物質，如瓊脂糖凝膠（sepharose）、葡聚糖凝膠（sephadex），將凝膠顆粒裝入色譜柱中即可用於物質的分離。當被分離物質通過凝膠柱時，大於凝膠孔徑的分子不能進入凝膠內部，只能在凝膠顆粒之間的空隙中流動和分配，流經的路途短，可很快被洗脫出來，而小於凝膠孔徑的分子則進入凝膠顆粒內部，在凝膠內部穿行，流經的路程長，移動的速度慢，最後被洗脫出來；分別收集不同時相的洗脫液，即可得到純化的物質。
GFC可在存在有多種離子、去污劑、尿素、鹽酸胍、高或低離子強度、常溫或低溫等多種條件下進行，根據所分離物質的性質不同可選擇相應的色譜條件，從而獲得有生物學活性的純化的生物大分子。
2.離子交換色譜法
離子交換色譜法（ion exchange chromatography,IEC）是根據物質的酸鹼度、極性和分子大小的不同進行分離的技術，通常包括吸附、吸收、擴散、穿透、靜電引力等復雜的物理化學過程。自然界的包括蛋白質在內的生物大分子都帶有電荷，當所需分離的物質通過離子交換色譜柱時，由於所帶電荷、分子量等不同，有些被固定相靠靜電引力所吸附，未被吸附的物質可被緩沖液首先洗脫出來；被吸附的物質由於所帶電荷多少不同，對固定相的親和力大小也不同，可被梯度離子緩沖液先後洗脫下來，使同一溶液中的不同物質被分離。色譜柱中填充的陰離子交換劑可用於帶正電荷物質的分離，而陽離子交換劑可用於帶負電荷物質的分離。
3.親和色譜法
許多生物大分子物質具有與其結構相對應的專一分子發生可逆性結合的特徵，如酶與底物及輔助因子、酶與抑制劑、抗原與抗體、激素與受體、核酸片段與其互補的核酸序列、生物素與親合素等，分子間的這種結合能力叫作親和力。
親和色譜（affinity chromatography）是利用生物大分子間所具有的特異性親和能力進行分離的方法。該方法常把可親和的一對分子中的一方固定在不溶於水的化合物上作為色譜的支持體即載體，使之固相化，作為固定相；另一方隨流動相流經固定相，雙方即可發生特異性結合；用流動相經過一段時間的洗滌，可將雜質去除，而後再利用親和吸附的可逆特性，改用特殊的流動相使所需分離的物質被解離下來，從而得到純化的物質。親和色譜法中的載體種類很多，最常用的是瓊脂糖凝膠（sepharose），其分子上有較多的羥基，活化後可與親和分子相耦聯，另外其理化性質穩定，不會影響色譜的分離過程。
親和色譜法可在溫和條件下操作，純化過程簡單、快速、解析度高，對分離含量極少且性質不穩定的生物活性物質極為有效。但由於不是任何生物大分子之間均有特異的親和力，而針對於某一種親和分子就需要制備專一的親和色譜柱，因此親和色譜的應用具有一定的局限性，主要由於蛋白質尤其是酶、抗原、抗體的分離與純化。

6. 蛋白質分離純化常用的方法

蛋白質的分離純化方法：
一、根據蛋白質溶解度不同的分離方法
1、蛋白質的鹽析法：中性鹽對蛋白質的溶解度有顯著影響，一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質的溶解度增加，此稱鹽溶；當鹽濃度繼續升高時，蛋白質的溶解度不同程度下降並先後析出，這種現象稱鹽析。
2、等電點沉澱法：蛋白質在靜電狀態時顆粒之間的靜電斥力最小，因而溶解度也最小，各種蛋白質的等電點有差別，可利用調節溶液的ph達到某一蛋白質的等電點使之沉澱，但此法很少單獨使用，可與鹽析法結合用。
3、低溫有機溶劑沉澱法：用與水可混溶的有機溶劑，甲醇，乙醇或丙酮，可使多數蛋白質溶解度降低並析出，此法分辨力比鹽析高，但蛋白質較易變性，應在低溫下進行。
二、根據蛋白質分子大小的差別的分離方法
1、透析與超濾：透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質分開。超濾法是利用高壓力或離心力，強使水和其他小的溶質分子通過半透膜，而蛋白質留在膜上，可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質。
2、凝膠過濾法：
也稱分子排阻層析或分子篩層析，這是根據分子大小分離蛋白質混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠（sephadex
ged）和瓊脂糖凝膠（agarose
gel）。
三、根據蛋白質帶電性質進行分離
1、電泳法：各種蛋白質在同一ph條件下，因分子量和電荷數量不同而在電場中的遷移率不同而得以分開。值得重視的是等電聚焦電泳，這是利用一種兩性電解質作為載體，電泳時兩性電解質形成一個由正極到負極逐漸增加的ph梯度，當帶一定電荷的蛋白質在其中泳動時，到達各自等電點的ph位置就停止，此法可用於分析和制備各種蛋白質。
2、離子交換層析法：離子交換劑有陽離子交換劑（如：羧甲基纖維素；cm-纖維素）和陰離子交換劑（二乙氨基乙基纖維素），當被分離的蛋白質溶液流經離子交換層析柱時，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質被吸附在離子交換劑上，隨後用改變ph或離子強度辦法將吸附的蛋白質洗脫下來。
四、根據配體特異性的分離方法－親和色譜法
親和層析法（aflinity
chromatography）是分離蛋白質的一種極為有效的方法，它經常只需經過一步處理即可使某種待提純的蛋白質從很復雜的蛋白質混合物中分離出來，而且純度很高。這種方法是根據某些蛋白質與另一種稱為配體(ligand）的分子能特異而非共價地結合。其基本原理：蛋白質在組織或細胞中是以復雜的混合物形式存在，每種類型的細胞都含有上千種不同的蛋白質，因此蛋白質的分離（separation），提純（purification）和鑒定（characterization）是生物化學中的重要的一部分，至今還沒的單獨或一套現成的方法能移把任何一種蛋白質從復雜的混合蛋白質中提取出來，因此往往採取幾種方法聯合使用。

7. 如何分離，提純白蛋白球蛋白的方法

一.血清ǐ-球蛋白的初步提取
1. 血細胞與血清分離：
取人血液 1000ml,放置10min, 1000rpm離心20min .棄沉澱,留上清備用(沉澱為血細胞,上部為血清).
2. 乳糜粒分離：4000rpm 10°C離心10分鍾,採用密度梯度離心
梯度液配置：離心管下部3/4容積加血漿,上部1/4容積加0.5MnaCl+0.3MEDTA,PH7.4 乳糜粒上浮,將乳糜粒吸出,留其餘液體備用.
3. 血清蛋白分離：除去球蛋白,白蛋白及其它蛋白質.
5000rpm 10°C離心1h,密度梯度離心
梯度.液配置：管容量1/3為血清,2/3為1.31g/ml,NaCl+NaBr,攪拌後終密度為1.21g/ml .管上部1/6容積為血清脂蛋白,下部5/6為其它蛋白.
4.取2ml下部5/6血清於小試管中,加0.9％氯化鈉溶液2.0ml,邊攪拌混勻邊緩慢滴加飽和硫酸銨溶液乙4.0ml,加入PBS洗脫液2ml,混勻後於室溫中放置10min,此步驟可重復1～2次
3000rpm 離心5min.沉澱物即是ǐ-球蛋白.
二.凝膠層析提純血清ǐ-球蛋白(1)裝柱：海綿墊裝入玻璃柱底端,作為柱底支持物,裝入定量的蒸餾水(約為柱體積的1/5),以避免膠粒直接沖擊柱底支持物;用玻璃棒小心排除柱底支持物.將密實洗凈的層析柱保持垂直位置,關閉出口,柱內留下約2.0ml洗脫液.邊攪拌凝膠,邊向柱內緩慢,連續,均勻地加入凝膠,(打開柱底端的螺旋夾)不要中斷,使膠粒均勻沉降,以免膠面一次性將疑膠從塑料介面加入層析柱內,打開柱底部出口,調節流速0.3ml/min.凝腔隨柱內溶液慢慢流下而均勻沉降到層析柱底部傾斜和發生斷層;檢查裝好的凝膠柱用眼觀察有無凝膠分層.溝流和氣泡現象.最後使凝膠床達20厘米高,床面上保持有洗脫液,操作過程中注意不能讓凝膠床表面露出液面並防止層析床內出現「紋路」.用緩沖液平衡凝膠柱,流速控制在3-5s/滴.(2)上樣與洗脫：小心控制凝膠柱下端活塞,使柱上的緩沖液面剛好下降至凝膠床表面,關緊下端出口,用長滴管吸取鹽析法制備的球蛋白混合樣品,將裝有上樣液的滴管頭插入床面以上1-2cm處,小心緩慢地貼壁加到凝膠床表面.柱上樣量控制在柱體積的2%-5%.打開下端出口,將流速控制在0.25ml/min使樣品進入凝膠床內.關閉出口,小心加入少量0.0175mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.3)洗柱內壁.打開下端出口,待緩沖液進入凝膠床後再加少量緩沖液.如此重復三次,以洗凈內壁上的樣品溶液.然後可加入適量緩沖液開始洗脫.加樣開始應立即收集洗脫液.洗脫時接通蠕動泵,流速為0.5ml/min,用部分收集器收集,每管1ml.(3)洗脫液中NH4+與蛋白質的檢查：取比色板兩個(其中一個為黑色背底),按洗脫液的順序每管取一滴,分別滴入比色板中,前者加雙縮脲2滴,出現藍色混濁即示有蛋白質析出,由此可估計蛋白質在洗脫各管中的分布及濃度；於另一比色板中,加人奈氏試劑l滴,以觀察NH4+出現的情況. 合並球蛋白含量高的各管,混勻.除留少量作電泳鑒定外,其餘用DEAE纖維素陰離子交換柱進一步純化.三．純化――DEAE纖維素陰離子交換層析用DEAE纖維素裝柱約8-10cm高度,並用0.0175mol／L磷酸鹽緩沖液(pH6.3)平衡,然後將脫鹽後的球蛋白溶液緩慢加於DEAE纖維素陰離子交換柱上,用同一緩沖液洗脫、分管收集.用20％磺基水楊酸溶液檢查蛋白質分布情況.(裝柱、上樣、洗脫,收集及蛋白質檢查等操作步驟同凝膠層析).四．濃縮經DEAE纖維素陰離於交換柱純化的γ－球蛋白液往往濃度較低.為便於鑒定,常需濃縮.收集較濃的純化的γ－球蛋白溶液2m1,按每ml加0.2～ 0.25gSephadex G一25干膠,搖動2～3min, 3000r／min 離心5min.上清液即為濃縮的γ-球蛋白溶液.五. 乙酸纖維素薄膜電泳鑒定ǐ-球蛋白(一)儀器與薄膜的准備1.醋酸纖維素薄膜的潤洗與選擇用竹夾子取一片薄膜,小心地平放在盛有緩沖液的平皿中,若漂浮於液面的薄膜在15—30s內迅速潤濕,整條薄膜色澤深淺一致,則此膜均勻可用於電泳；若薄膜潤濕緩慢,色澤深淺不一或有條紋及斑點等,則表示薄膜厚薄不均勻應棄去,以免影響電泳結果.將選好的薄膜用竹子輕壓,使其完全浸泡於緩沖液中約30min後,方可用於電泳.
2.電泳槽的准備根據電泳槽膜支架的寬度,剪裁尺寸合適的濾紙條.在兩個電極槽中,各倒入等體積的電極緩沖液,在電泳槽的兩個膜支架上,各放兩層濾紙條,使濾紙一端的長邊與支架前沿對齊,另一端浸入電極緩沖液內.當濾紙條全部潤濕後,用玻璃棒輕輕擠壓在膜支架上的濾紙以驅趕氣泡,使濾紙的一端能緊貼在膜支架上.濾紙條是兩個電極槽聯系醋酸纖維素薄膜的橋梁,因而稱為濾紙橋.
3.電極槽的平衡用平衡裝置(或自製平衡管)連接兩個電泳槽,使兩個電極槽內的緩沖液彼此處於同一水平狀態,一般需平衡15——20min.注意,取出平衡裝置時應將活塞關緊.
(二)點樣
1.制備點樣模板取一張干凈濾紙(10×10cm),在距紙邊1.5cm處用鉛筆劃一平行線,此線為點樣標志區.
2.點樣用竹夾子取出浸透的薄膜,夾在兩層濾紙間以吸去多餘的緩沖液.無光澤面向上平放在點樣模板上,使其底邊與模板底邊對齊.點樣區距陰極端1.5cm處.點樣時,先用玻璃棒或血色素吸管取2—3��L血清,均勻塗在加樣器上,再將點樣器輕輕印在點樣區內,使血清完全滲透至薄膜內,形成一定寬度、粗細均勻的直線.此步是實驗的關鍵,點樣前應在濾紙上反復練習,掌握點樣技術後再正式點樣.
(三).電泳用竹夾子將點樣端的薄膜平貼在陰極電泳槽支架的濾紙橋上(點樣面朝下),另一端平貼在陽極端支架上,要求薄膜緊貼濾紙橋並綳直,中間不能下垂.如一電泳槽中同時安放幾張薄膜,則薄膜之間應相隔幾毫米.蓋上電泳槽蓋,使薄膜平衡10min.用導線將電泳槽的正、負極與電泳儀的正、負極分別連接,注意不要接錯.在室溫下電泳,打開電源開關,用電泳儀上細調節旋扭調到每厘米膜寬電流強度為0.3mA(8片薄膜則為4.8mA).通電10—15min後,將電流調節到每厘米膜寬電流強度為0.5mA(8片共8 mA),電泳時間約50—80min.電泳後調節旋扭使電流為零,關閉電泳儀切斷電源.
(四).染色與漂洗
1.血清蛋白染色與漂洗脫色用解剖鑷子取出電泳後的薄膜,放在含0.5%氨基黑10B染色液的培養皿中,浸染5min,取出後再用漂洗液浸洗脫色,每隔10min 換漂洗液一次,連續數次,直至背景藍色脫盡.取出薄膜放在濾紙上,用吹風機的冷風將薄膜吹乾.
(五)透明將脫色吹乾後的薄膜浸入透明甲液中2min,立即放入透明乙液中浸泡1min,取出後立即緊貼於干凈玻璃板上,兩者間不能有氣泡,約2—3min薄膜完全透明.若透明太慢可用滴管取透明乙液少許在薄膜表面淋洗一次,垂直放置待其自然乾燥,或用吹風機冷風吹乾且無酸味.再將玻璃板放在流動的自來水下沖洗,當薄膜完全潤濕後用單面刀片撬開薄膜的一角,用手輕輕將透明的薄膜取下,用濾紙吸干所有的水分,最後將薄膜置液體石蠟中浸泡3min,再用濾紙吸干液體石蠟,壓平.此薄膜透明,區帶著色清晰,可用於光吸收計掃描.長期保存不褪色.
(六)結果判斷與定量血清蛋白電泳經蛋白染色後,可顯示出區帶,未經透明處理的電泳圖譜可直接用於定量測定.可採用洗脫法或光吸收掃描法,測定各蛋白組分相對百分含

8. 蛋白質分離純化的四種方法

1、鹽析法：

鹽析法的根據是蛋白質在稀鹽溶液中，溶解度會隨鹽濃度的增高而上升，但當鹽濃度增高到一定數值時，使水活度降低，進而導致蛋白質分子表面電荷逐漸被中和，水化膜逐漸被破壞，最終引起蛋白質分子間互相凝聚並從溶液中析出。

2、有機溶劑沉澱法：

有機溶劑能降低蛋白質溶解度的原因有二：其一、與鹽溶液一樣具有脫水作用；其二、有機溶劑的介電常數比水小，導致溶劑的極性減小。

3、蛋白質沉澱劑：

蛋白質沉澱劑僅對一類或一種蛋白質沉澱起作用，常見的有鹼性蛋白質、凝集素和重金屬等。

4、聚乙二醇沉澱作用：

聚乙二醇和右旋糖酐硫酸鈉等水溶性非離子型聚合物可使蛋白質發生沉澱作用。

(8)球蛋白純化一般最常用的方法擴展閱讀：

蛋白質是生命的物質基礎，是有機大分子，是構成細胞的基本有機物，是生命活動的主要承擔者。沒有蛋白質就沒有生命。氨基酸是蛋白質的基本組成單位。它是與生命及與各種形式的生命活動緊密聯系在一起的物質。

機體中的每一個細胞和所有重要組成部分都有蛋白質參與。蛋白質占人體重量的16%~20% ，即一個60kg重的成年人其體內約有蛋白質9.6~12kg。

人體內蛋白質的種類很多，性質、功能各異，但都是由20多種氨基酸（Amino acid）按不同比例組合而成的，並在體內不斷進行代謝與更新。

9. 常用的蛋白質分離純化方法有哪幾種各自的作用原理是什麼

分離蛋白質混合物的各種方法主要是根據蛋白質在溶液中的以下性質：1）分子大小；2）溶解度；3）電荷；4）吸附性質；5）對其它分子的生物學親和力等進行分離。
常見的分離提純蛋白質的方法有： 1、鹽析與有機溶劑沉澱：在蛋白質溶液中加入大量中性鹽，以破壞蛋白質的膠體性質，使蛋白質從溶液中沉澱析出，稱為鹽析。常用的中性鹽有：硫酸銨、氯化鈉、硫酸鈉等。鹽析時，溶液的pH在蛋白質的等電點處效果最好。凡能與水以任意比例混合的有機溶劑，如乙醇、甲醇、丙酮等，均可引起蛋白質沉澱。2、電泳法：蛋白質分子在高於或低於其pI的溶液中帶凈的負或正電荷，因此在電場中可以移動。電泳遷移率的大小主要取決於蛋白質分子所帶電荷量以及分子大小。3、透析法：利用透析袋膜的超濾性質，可將大分子物質與小分子物質分離開。4、層析法：利用混合物中各組分理化性質的差異，在相互接觸的兩相（固定相與流動相）之間的分布不同而進行分離。主要有離子交換層析，凝膠層析，吸附層析及親和層析等，其中凝膠層析可用於測定蛋白質的分子量。5、分子篩：又稱凝膠過濾法，蛋白質溶液加於柱之頂部，任其往下滲漏，小分子蛋白質進入孔內，因而在柱中滯留時間較長，大分子蛋白質不能進入孔內而徑直流出，因此不同大小的蛋白質得以分離。6、超速離心：利用物質密度的不同，經超速離心後，分布於不同的液層而分離。超速離心也可用來測定蛋白質的分子量，蛋白質的分子量與其沉降系數S成正比。

10. 常用的分離、純化免疫球蛋白的方法主要有哪幾種各種得到的純度如何

分離蛋白質混合物的各種方法主要是根據蛋白質在溶液中的以下性質：1）分子大小；2）溶解度；3）電荷；4）吸附性質；5）對其它分子的生物學親和力等進行分離.
常見的分離提純蛋白質的方法有：1、鹽析與有機溶劑沉澱：在蛋白質溶液中加入大量中性鹽,以破壞蛋白質的膠體性質,使蛋白質從溶液中沉澱析出,稱為鹽析.常用的中性鹽有：硫酸銨、氯化鈉、硫酸鈉等.鹽析時,溶液的pH在蛋白質的等電點處效果最好.凡能與水以任意比例混合的有機溶劑,如乙醇、甲醇、丙酮等,均可引起蛋白質沉澱.2、電泳法：蛋白質分子在高於或低於其pI的溶液中帶凈的負或正電荷,因此在電場中可以移動.電泳遷移率的大小主要取決於蛋白質分子所帶電荷量以及分子大小.3、透析法：利用透析袋膜的超濾性質,可將大分子物質與小分子物質分離開.4、層析法：利用混合物中各組分理化性質的差異,在相互接觸的兩相（固定相與流動相）之間的分布不同而進行分離.主要有離子交換層析,凝膠層析,吸附層析及親和層析等,其中凝膠層析可用於測定蛋白質的分子量.5、分子篩：又稱凝膠過濾法,蛋白質溶液加於柱之頂部,任其往下滲漏,小分子蛋白質進入孔內,因而在柱中滯留時間較長,大分子蛋白質不能進入孔內而徑直流出,因此不同大小的蛋白質得以分離.6、超速離心：利用物質密度的不同,經超速離心後,分布於不同的液層而分離.超速離心也可用來測定蛋白質的分子量,蛋白質的分子量與其沉降系數S成正比.