常用於載體前葯的制備方法

① 前體葯物的載體葯物

載體前體葯物是指具有活性的化合物與其運輸作用的載體通過共價鍵結合，在體內通過簡單的水解作用卸掉載體，由活性化合物發揮葯理作用。載體前體葯物與母體化合物相比往往活性微弱或無活性。對於載體的結構，多是親脂性，要求對生物體無害，且能及時釋放活性化合物。市場上口服青黴素類葯物往往採用載體前葯的方式來提高生物利用度。

② 納米葯物載體的制備工藝及其原理

通常，NP的制備方法根據NP形成的原理的不同可以分為兩種，即單體聚合法和聚合物分散法。

③ 前葯 一般制備方法有哪些

一種具有靶向和增效的氟尿嘧啶前葯，具體的說，涉及含碳鏈硒代的氟尿嘧啶前葯。與底物相比，氟尿嘧啶前葯對癌細胞抑製作用更具有靶向性，能顯著提高葯物療效，並大大降低氟尿嘧啶的毒性,氟尿嘧啶前葯還具有良好的親水親脂性，能提高底物的生物利用度。

④ T載體如何制備

用限制性內切酶制備T載體
陸哲明,柯楊△[北京大學臨床腫瘤學院(北京市腫瘤防治研究所)遺傳室,北京100034]
[關鍵詞]T載體;DNA限制酶類;遺傳載體;基因擴增[摘要]
目的:介紹一種制備T載體的方法。方法:用限制性內切酶XcmⅠ酶切,在兩端產生T末端,制備的T載體可直接用來克隆用TaqDNA聚合酶產生帶A末端的PCR產物。結果:PCR產物直接和T載體連接,用常規氯化鈣法制備的感受態菌轉化,對轉化子提取質粒進行酶切鑒定,證明陽性率達80%。結論:制備T載體過程簡單,質量穩定,產量高,並可擴增等優點。
[中圖分類號]Q342[文獻標識碼]A[文章編號]1671 167X(2002)06 0726 03

PCR是目前體外DNA擴增最常用的方法,對PCR產物進行快速有效的克隆是開展下游許多實驗所要求的。目前TA克隆是一種快速的,一步到位地把PCR產物直接插入到質粒載體的方法。而商品化的TA克隆系統由於售價高,質量批次間不穩定且無法進行循環使用等缺點,在實際應用中,限制了T載體的廣泛使用。本文介紹了一種簡單、高效,可在普通實驗室中制備並可反復擴增的T載體制備方法,並經PCR產物克隆,酶切鑒定,得到了非常理想的結果。
1材料與方法1
.1制備SuperpGEM Teasy載體(簡稱pSP Teasy載體)1
.1.1制備pSP Teasy環化載體以線性化的pGEM Teasy載體(Promega為模板,兩邊設計引物:
F:
HindⅢXcmⅠG
AATTCGCG
R:
HindⅢXcmⅠC
CGCGGCCGCCA
引物的5′端各插入HindⅢ和XcmⅠ位點,3′端與模板互補,在PfuDNA聚合酶的作用下擴增,擴增產物經HindⅢ酶切後,自身環化,挑選能被HindⅢ酶切的克隆即為陽性克隆,經測序進一步證實。
1.1.2制備pSP Teasy線性化載體按照標准酶切體系,用XcmⅠ(NEB)酶切,酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳後,玻璃奶回收,測量吸光度值(D260),調整質量濃度至50mg·L-1,此載體可直接用於克隆。
3討論PCR技術是目前體外擴增DNA最常用的方法。有時需得到克隆化的DNA以便於雜交分析、高質量測序及從復雜PCR產物中分離目的片段。常用的方法有非定向克隆和定向克隆。定向克隆需在引物5′端引入限制性內切酶位點,PCR產物經適當內切酶酶切後產生粘端,連接到相應載體。非定向克隆有兩種策略,一種是平末端克隆,在klenow和T4DNA聚合酶作用下修平PCR產物末端,但連接效率僅為粘端連接的1/50,且自身環化率高[1];另一種是TA克隆。TA克隆是一種快速的,一步到位的非定向克隆法,可以把PCR產物直接插入到質粒載體。TA克隆系統利用TaqDNA聚合酶的末端轉移酶活性,在擴增DNA3′末端非模板依賴地加上一個核苷酸,通常為腺苷酸[2]。這個3′A突出端被用於把PCR產物插入到插入位點有一個3′T突出端的載體。制備好的載體,其關鍵部分是帶有3′T突出端的線性分子。目前制備3′T載體的方法是先用平末端限制性內切酶(如EcoRⅤ)酶切載體,再用TaqDNA聚合酶在僅有dTTP的情況下,72～75℃反應,在3′末端添加一個T[1,3]。但是,實際反應過程中,由於3′末端加T為非優先聚合核苷酸,僅部分的3′端可添加T,或者有少量可能添加一個以上T,造成載體在克隆過程中自身環化高,必然增加篩選陽性克隆的難度。另外,每次生產T載體產量有限(一般為1μg),不適於大規模生產,造成批次間質量差異大。即使商品化TA克隆試劑盒也存在陽性率低和質量不穩定的缺點。因其價格昂貴,並且無法進行循環使用,在普及上存在一定困難。利用限制性內切酶制備T載體利用限制性內切酶特異性強,一次酶切產量高,質量穩定,易於操作等特點。在內切酶家族中,有一類稱可變酶,它們的識別序列中的一個或幾個核苷酸是可變的,如本文採用的XcmⅠ,它識別序列見圖3a,在構建pSP Teasy載體時,利用其中間序列可變,在靠近T7啟動子端,設計了XcmⅠ的識別序列見圖3b,而在靠近SP6啟動子端XcmⅠ的識別序列見圖3c,這樣在XcmⅠ酶切後,其剩餘的序列如圖1,在3′端分別產生T。經查NewEnglandBiolabs公司的目錄,符合上述特徵的酶列於表1。

我們在兩個XcmⅠ之間引入HindⅢ位點有下列優點:(1)在構建pSP Teasy時提供方便;(2)經HindⅢ酶切後,可以防止載體中的XcmⅠ位點不完全酶切造成的自身環化;(3)兩個XcmⅠ位點之間,提供保護的鹼基,便於XcmⅠ酶切。用於克隆的PCR產物在連接前需經瓊脂糖凝膠電泳,如條帶銳利,則一般無需純化即可直接用於連接;如產物有非特異擴增或引物二聚體濃度較高,最好先用低熔點膠或玻璃奶法純化。如果擴增用具有保真功能的聚合酶,如PfuDNA聚合酶、PwoDNA聚合酶或TliDNA聚合酶,由於它們有3′～5′的外切酶活性,則PCR產物為平末端,需經純化後用TaqDNA聚合酶在dATP存在下72℃加腺苷酸尾15～30min,即可達到相同效果。插入片段(PCR產物)與載體摩爾比一般要求在3∶1～1∶3之間,但按筆者經驗,摩爾比不經優化亦可產生較好克隆效果,可能與pSP Teasy在原理上無法自身環化有關。pSP T是在Promega公司pGEM Teasy載體基礎上構建而成的,它具有原載體的優點[4]:(1)用T7RNA聚合酶或SP6RNA聚合酶可正反兩方向體外轉錄RNA;(2)載體克隆位置的兩側各有EcoRⅠ、NotⅠ和BstZⅠ等酶切位點,便於用單一酶切鑒定;(3)T7、SP6和M13等通用序列,便於測序。新的pSP Teasy不僅保留原載體所有的優點外,還具有(1)末端加有T的載體含量高,因為以往所加T為合成反應添加,不能保證每個末端均有T。而用內切酶法,利用其特異性識別酶切位點的特點,並經HindⅢ處理XcmⅠ酶切不完全的載體,則在原理上保證自身無法環化且均能產生T末端;(2)由於採用內切酶法,保證了質量的穩定性;(3)產量大,每次可產生10～20μg,而經典方法僅1～5μg;(4)方法簡單,成本低廉,適合普通實驗室制備。只需一步酶切,純化後即制備完畢,步驟簡單且耗時少。而傳統方法需經酶切,純化,加T,再純化等步驟;(5)環化T載體可以擴增後循環使用。以上特有優點保證了克隆效果穩定,陽性率高。
(a)CCANNNNN NNNNTGGGGTNNNN▲NNNNNACC
(b)CCAGGTCT AGACTGGGGTCCAGATCTGACC
(c)CCAGGTCA AGACTGGGGTCCAG▲TTCTGACC

(a)RecognitionsiteofXcmⅠ;
(b)5′ endrecognitionsiteofXcmⅠ;
(c)3′ endrecognitionsiteofXcmⅠ.
圖3在不同部位XcmⅠ識別序列Ⅰatdifferentsite

⑤ 片劑的制備方法有哪些各方法適用於哪些葯物的制備

片劑的制備方法直接壓片法、濕法制粒、干法制粒,因為濕法在國內運用最多，且大都比較純熟。

干法制粒只用於濕法不能解決的，比如說原料對濕熱不穩定、濕法無法控制其溶出等等，直接壓片法國外比較提倡，因為其制備工藝較為簡便。

由原葯、填料、吸附劑、黏結劑、潤滑劑、潤濕劑、崩解劑、香料、色料等組成。先將物料粉碎、造粒，乾燥，再用壓片機製成片狀，也有的不需造粒和乾燥，直接壓成片劑。

(5)常用於載體前葯的制備方法擴展閱讀：

片劑是在丸劑使用基礎上發展起來的，它創用於十九世紀40年代，到19世紀末隨著壓片機械的出現和不斷改進，片劑的生產和應用得到了迅速的發展。

近十幾年來，片劑生產技術與機械設備方面也有較大的發展，如沸騰制粒、全粉末直接壓片、半薄膜包衣、新輔料、新工藝以及生產聯動化等。

中葯片劑的研究和生產僅在50年代才開始，隨著中葯化學、葯理、制劑與臨床幾方面的綜合研究，中葯片劑的品種、數量不斷增加，工藝技術日益改進，片劑的質量逐漸提高。

⑥ 前葯的名詞解釋

前葯是指一些在體外活性較小或者無活性的化合物，在體內經過酶的催化或者非酶作用，釋放出活性物質從而發揮其葯理作用的化合物，其常常指將活性葯物（原葯）與某種無毒性化合物以共價鍵相連接而生成的新化學實體。 即前體葯物。指用化學方法合成原有葯物的衍生物，這種衍生物在機體內能轉化成原來葯物而發揮作用。因此，前...體葯物又可稱為生物可逆性衍生物。 前葯的分類： 一類是載體前體葯物（carrier-prodrug，簡稱載體前葯）；另一類是生物前體葯物（bioprecursors )。生物前體葯物大部分不是人為修飾的，而是在研究作用機制時，發現其作用過程是經體內酶催化代謝而產生活性物質。如非甾體抗炎類葯物舒林酸（sulindac）就是典型的生物前體葯，舒林酸本身沒有活性，在體內還原酶的作用下由亞碸轉為硫化物形式產生抗炎活性。 前葯應具備以下三個條件： （1）根據具有生物活性的葯物分子性質，按治療需要進行化學改造； （2）進入機體後，不論是否需要酶的作用，要保證恢復原來的葯物分子； （3）本身不顯示生物活性。 前葯的特徵： 原葯分子的載體的聯結一般是共價鍵；前葯應無活性或低於原葯的活性；前葯的合成簡單易行，且載體分子價廉易得；原葯與載體的聯結在體內經酶反應或酶促反應可以裂解；前葯在體內產生原葯事快速動力學過程。 前葯的作用： 利用前葯原理修飾先導化合物，不能增加其活性。但前葯設計可以改變葯物的物理化學性質，或提高葯物對靶部位作用的選擇性；改善葯物在體內的吸收，分布，轉運與代謝等葯代動力學過程，或延長作用時間，或提高生物利用度；改善葯物的理化性質和消除不良氣味；降低葯物的毒副作用；提高作用部位的特異性，有利於葯物與受體或酶的相互作用；延長作用時間；發揮葯物的配伍作用。 前葯的制備方法： 羧酸類化合物，醇類化合物或酚類化合物形成酯；胺類化合物形成醯胺等等。

⑦ 什麼是載體連接前葯

就是載體連接前葯
前體葯物（prodrug），也稱前葯、葯物前體、前驅葯物等，是指經過生物體內轉化後才具有葯理作用的化合物。前體葯物本身沒有生物活性或活性很低，經過體內代謝後變為有活性的物質，這一過程的目的在於增加葯物的生物利用度，加強靶向性，降低葯物的毒性和副作用。目前前體葯物分為兩大類：載體前體葯物(carrier-prodrug)和生物前體(bioprecursor)。此外農葯中也有許多前體葯物。
載體前體葯物是指具有活性的化合物與其運輸作用的載體通過共價鍵結合，在體內通過簡單的水解作用卸掉載體，由活性化合物發揮葯理作用。載體前體葯物與母體化合物相比往往活性微弱或無活性。對於載體的結構，多是親脂性，要求對生物體無害，且能及時釋放活性化合物。市場上口服青黴素類葯物往往採用載體前葯的方式來提高生物利用度。