抗體標記技術常用的方法

1. 酶標記抗體的標記抗體的方法

HRP標記抗體的方法
酶與抗體交聯的方法有許多種,根據酶的結構不同可採用不同的方法。對於制備HRP結合物，可用戊二醛二步法和過碘酸鈉法。尤以簡易過碘酸鈉法更為常用。
戊二醛二步法 (1)稱取HRP25mg溶於1.25%戊二醛溶液中，於室溫靜置過夜。
(2)反應後的酶溶液經Sephadex G-25層析柱，用生理鹽水洗脫。流速控制在1ml/1分鍾，收集棕色流出液。如體積大於5ml，則以PEG濃縮至5ml。放置25ml小燒杯中，緩慢攪拌。
(3)將待標記的抗體12.5mg用生理鹽水稀釋至5ml，攪拌下逐滴加入酶溶液中。
(4)用1M PH9.5碳酸緩沖液0.25ml，繼續攪拌3?小時。
(5)加0.2M賴氨酸0.25ml，混勻後，置室溫2小時。
(6)在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4℃1小時。
(7)3000rpm離心半小時，棄上清。沉澱物用半飽和硫酸銨洗二次，最後沉澱物溶於少量0.15M PH7.4的PBS中。
(8)將上述溶液裝入透析袋中，對0.15M PH7.4的PB緩沖鹽水透析，去除銨離子後(用萘氏試劑檢測)，10,000rpm離心30分鍾去除沉澱，上清液即為酶結合物，分裝後，冰凍保存。 (1)定性及效價滴定：用特異性抗原(或抗體)同酶標記抗體(或抗免疫球蛋白抗體)作雙向瓊脂擴散試驗或免疫電泳試驗。然後用酶的底物使沉澱弧顯色，可初步鑒定其活性。最後以直接ELISA法(或在正式實驗系統里)對酶結合物進行滴定( 見本節 (三)工作濃度的選擇)。
(2)定量和克分子比值測定：可用分光光度計測定(光程1cm)。
酶量(mg/ml)=OD403nm×0.4
IgG量(mg/ml)=OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62
酶量(mg/ml) IgG量(mg/ml) 酶量
克分子比值=──────── ÷ ─────── = ─── × 4
40,000 160,000IgG量
(3)本法標記步驟比較簡單，重復性好。缺點是酶的利用率低，一般只有2～4%的酶與蛋白質結合。 (1)0.1M PH6.8磷酸緩沖鹽水(PBS)：取0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml，NaCl1.8克，加蒸餾水至200ml。
(2)1.25%戊二醛液：取25%戊二醛50μl與PH6.8的PBS1ml混合。
(3)1M PH9.5碳酸鹽緩沖液：取1M碳酸鈉3ml與1M碳酸氫鈉7ml混合。
(4)0.2M賴氨酸溶液：稱賴氨酸29.2mg溶於0.01M PH9.5碳酸緩沖液1ml中。
(5)0.15M PH7.4 PBS及生理鹽水。
(6)PH7.8飽和硫酸銨溶液及半飽和硫酸銨溶液。
(7)萘氏試劑及聚乙二醇(PEG，MW2000)。
(8)純化的特異性抗體或抗Ig抗體。
(9)HRP(RZ>3.0)。
(10) Sephadex G-25層析柱(2cm×50cm)。
(11) 攪拌器，分光光度計，離心機。
(12) 透析袋，大、小燒杯，試管，吸管等。

2. 熒光素fitc標記抗體的方法 是什麼方法

免疫熒光技術是將熒光素如異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)與相應抗體（或抗原）以化學的方法結合，將熒游標記抗體（或抗原）與標本中相應的抗原結合形成熒游標記的抗體- 抗原復合物，用熒光顯微鏡觀察。在鏡下見到有熒光存在即推斷有抗原抗體復合物的存在，根據已 知的抗體（或抗原）即可推知另一個未知抗原（或抗體）的存在。

1. 直接免疫熒光法直接免疫熒光法是利用熒光色素標記的特異性抗體直接與相應的抗原結合，以鑒定未知抗原。本法具有操作簡單、時程短、特異性高的優點，但也 存在缺點如不能檢查抗體，敏感性較差。

2. （1）在標本上滴加熒光素標記抗體，放入濕盒中。37℃溫育30min。

3. （2）PBS 沖洗後，再用PBS分三缸浸泡，每缸3min。

4. （3）PBS浸泡1～2min，風干。

5. （4）緩沖甘油封片。在熒光顯微鏡下觀察。

6. 進行直接免疫熒光法時應注意：①溫育時一定要將玻片放在濕盒中，以防液體蒸發。②用PBS浸泡時應不斷振盪。

7. 2. 間接免疫熒光法間接免疫熒光法以熒光素標記抗球蛋白抗體，抗體與相應抗原結合後，熒游標記的抗球蛋白抗體與已結合的抗體發生作用，從而推知抗原或抗體的 存在。間接熒光技術可以用已知的抗原檢測未知的抗體，也可用已知的抗體測出未知抗原。現以檢測流行性熱病毒抗體（IgM）為例介紹如下：

8. （1）將待測病人血清加至抗原片（流行性熱病毒感染的Vero-E6細胞片）上，每個稀釋 度加2孔，最後2孔加PBS做對照。將玻片放置濕盒中，37℃溫育 60min。取出玻片，棄去反應液，用PBS洗滌5min，風干。

9. （2）加入1∶40稀釋的FITC標記的羊抗人IgM，37℃溫育60min。取出玻片，按步驟2洗滌，風干。

10. （3）PBS甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。陽性結果：在細胞膜及細胞質中可見顆粒狀熒光顆粒，細胞核 呈紅色。

11. 注意事項：溫育時將玻片放在濕盒中，以防液體蒸發。選擇低溫、乾燥、潔凈的環境風干。
    

3. 單克隆抗體的標記種類

辣根過氧化物酶(HRP)標記
辣根過氧化物酶(HRP)標記單抗和多克隆抗體的常用方法是過碘酸鈉法。其原理是HRP的糖基用過碘酸鈉氧化成醛基，加入抗體IgG後該醛基與IgG氨基結合，形成Schiff氏鹼。為了防止HRP中糖的醛基與其自身蛋白氨基發生偶合，在用過碘酸鈉氧化前先用二硝基氟苯阻斷氨基。氧化反應末了，用硼氫化鈉穩定Schiff氏鹼。這里介紹兩種程序。
更多的單克隆抗體的標記種類，生物幫上面有介紹的。實驗室培養箱（CO2 培養箱） http://proct.bio1000.com/101186/

4. 免疫學檢驗常用技術有哪些

以下是幾種常用的免疫學技術：
1．免疫熒光技術
免疫熒光技術是利用熒光素標記的抗體（或抗原）檢測組織、細胞或血清 中的相應抗原（或抗體）的方法。由於熒光抗體具有安全、靈敏的特點，因此已 廣泛應用在免疫熒光檢測和流式細胞計數領域。根據熒光素標記的方式不同，可 分為直標熒光抗體和間標熒光抗體。間標熒光抗體中一抗並不直接連接熒光素， 而是先將一抗結合到蛋白，然後帶有熒光素的二抗再結合至一抗。通過二抗的結 合，能將信號進行放大，因此能在一定程度上提高檢測的靈敏度，但是隨之帶來 的高背景也降低了檢測的特異性。近年來，隨著熒光素和熒光檢測技術的不斷進 步，熒光檢測的靈敏度已經接近同位素檢測的水平，直接標記的熒光抗體逐漸取 代間接標記抗體。這些標記了熒光素的抗體直接結合至抗原，大大提高了檢測的 特異性，使檢測的結果更加准確可靠。熒光檢測技術的發展，使得免疫熒光技術 在傳染病診斷上有廣泛的用途，如在細菌、病毒、螺旋體感染的疾病，檢查IgM 抗體，做為近期接觸抗原的標志。利用單克隆熒光直接標記抗體鑒定淋巴細胞的 亞類。通過流式細胞儀，針對細胞表面不同抗原，可以同時使用多種不同的熒光 抗體，對同一細胞進行多標記染色。
2．放射免疫檢測
放射免疫檢測技術是目前靈敏度最高的檢測技術，利用放射性同素標記抗 原（或抗體），與相應抗體（或抗原）結合後，通過測定抗原抗體結合物的放射 性檢測結果。放射性同位素具有pg 級的靈敏度，且利用反復曝光的方法可對痕 量物質進行定量檢測。但放射性同位素對人體的損傷也限制了該方法的使用。

3．酶聯免疫吸附試驗（ELISA）
酶聯免疫檢測是目前應用最廣泛的免疫檢測方法。該方法是將二抗標記上 酶，抗原抗體反應的特異性與酶催化底物的作用結合起來，根據酶作用底物後的 顯色顏色變化來判斷試驗結果，其敏感度可達ng 水平。常見用於標記的酶有辣 根過氧化物酶(HRP)、鹼性磷酸酶（AP）等。由於酶聯免疫法無需特殊的儀器， 檢測簡單，因此被廣泛應用於疾病檢測。常用的方法有間接法、夾心法以及BAS －ELISA。間接法是先將待測的蛋白抱被在孔板內，然後依次加入一抗、標記了 酶的二抗和底物顯色，通過儀器（例如酶標儀）定量檢測抗原。這種方法操作簡 單但由於高背景而特異性較差。目前已逐漸被夾心法取代。夾心法利用二種一抗 對目標抗原進行捕獲和固定，在確保靈敏度的同時大大提高了反應的特異性。近 年來，抗原的定量檢測技術也不斷推陳出新。近年來，在夾心法ELISA 的基礎上， 開發了多抗原檢測試劑盒，能同時檢測微量液相樣本中多個抗原含量。這項技術 的應用大大縮短了診斷的時間，提高診斷的可靠性和及時性。
4．免疫金膠體技術
膠體金技術經過30 多年的發展到現在已日趨成熟，該方法是將二抗標記上 膠體金顆粒，利用抗原抗體間的特異性反應，最終將膠體金標記的二抗吸附於滲 濾膜上，此方法簡單，快速，廣泛應用於臨床篩查。

5. 酶標記抗體的簡易過碘酸鈉法

本法是以NaIO4先將HRP表面的糖分子氧化成醛基，然後再與Ig上的氨基相結合，所獲酶標記抗體的產率高，將近70%的HRP和Ig結合，99%的Ig與酶結合，酶與Ig的活性無重大損失，是目前最常用的方法。 (1)稱取5mgHRP溶解於1ml蒸餾水中。
(2)於上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液，室溫下避光攪拌20分鍾。
(3)將上述溶液裝入透析袋中，對1mM PH4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4℃過夜。
(4)加20μl 0.2M PH9.5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化桯RP的PH升高到9.0～9.5，然後立即加入10mg IgG(抗體，或SPA5mg)在1ml 0.01M碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕輕攪拌2小時。
(5)加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液，混勻，再置4℃2小時。
(6)將上述液裝入透析袋中，對0.15M PH7.4 PBS透析，4℃過夜。
其餘步驟(純化)同戊二醛標記步驟的(6)、(7)、(8)。 除標記物IgG量的計算，略有不同以外，其餘均同戊二醛法。
IgG量(mg/ml)=(OD280nm-OD403nm×0.3)×0.62 (1)0.1M NaIO4：稱取214mg高碘酸鈉(廣州化學試劑廠，批號830602)溶於蒸餾水10ml中。
(2)1mM PH4.4醋酸鈉緩沖液:
0.2M NaAc (1.361克/50ml) 3.7ml
0.2M HAc (0.601ml/50ml) 6.3ml
加蒸餾水至2,000ml。
(3)0.2M PH9.5碳酸鹽緩沖液:
Na2CO3 0.32克
NaHCO3 0.586克
加蒸餾水至50ml
再用蒸餾水作20倍稀釋，即成0.01M PH9.5的碳酸鹽緩沖液。
(4)NaBH4溶液(4mg/ml):
臨用時稱取NaBH44mg溶於1ml蒸餾水中。
(5)其它的試劑及器材可參見戊二醛標記法。

6. 什麼是金標法金標法和膠體金法一樣嗎

金標法：又稱膠體金法、一步法,醫學上的名稱為斑點免疫金滲濾試驗..金標法是一種常用的標記技術,是以膠體金作為示蹤標志物應用於抗原抗體的一種新型的免疫標記技術.\x0d金標法是國際上較為先進的體外診斷方法,近年來金標法（膠體金法）已在各種生物學研究中廣泛使用,在臨床使用的免疫印跡技術幾乎都使用其標記,同時在流式、電鏡、免疫、分子生物學以至生物晶元中都可能例用到.\x0d它擁有如下幾個特點：\x0d（1）靈敏度高；\x0d（2）特異性強；\x0d（3）快速；\x0d（4）簡便；\x0d（5）准確率高.\x0d1971年Faulk 和Taytor將膠體金引入免疫化學,此後免疫膠體金技術作為一種新的免疫學方法,在生物醫學各領域得到了日益廣泛的應用.目前在醫學檢驗中的應用主要是免疫層析法( immunochromatogra-phy)和快速免疫金滲濾法(Dot-immuogold filtration assay DIGFA),用於檢測 HBsAg、HCG 和抗雙鏈DNA抗體等,具有簡單、快速、准確和無污染等優點.\x0d免疫膠體金技術的基本原理：\x0d膠體金是由氯金酸(HAuCl4)在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下,可聚合成一定大小的金顆粒,並由於靜電作用成為一種穩定的膠體狀態,形成帶負電的疏水膠溶液,由於靜電作用而成為穩定的膠體狀態,故稱膠體金.膠體金在弱鹼環境下帶負電荷,可與蛋白質分子的正電荷基團形成牢固的結合,由於這種結合是靜電結合,所以不影響蛋白質的生物特性.\x0d膠體金除了與蛋白質結合以外,還可以與許多其它生物大分子結合,如SPA、PHA、ConA等.根據膠體金的一些物理性狀,如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應,加上結合物的免疫和生物學特性,因而使膠體金廣泛地應用於免疫學、組織學、病理學和細胞生物學等領域.\x0d膠體金標記,實質上是蛋白質等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程.吸附機理可能是膠體金顆粒表面負電荷,與蛋白質的正電荷基團因靜電吸附而形成牢固結合.用還原法可以方便地從氯金酸制備各種不同粒徑、也就是不同顏色的膠體金顆粒.這種球形的粒子對蛋白質有很強的吸附功能,可以與葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽綴合物等非共價結合,因而在基礎研究和臨床實驗中成為非常有用的工具.\x0d免疫金標記技術(Immunogold labelling techique) 主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性,在金標蛋白結合處,在顯微鏡下可見黑褐色顆粒,當這些標記物在相應的配體處大量聚集時,肉眼可見紅色或粉紅色斑點,因而用於定性或半定量的快速免疫檢測方法中,這一反應也可以通過銀顆粒的沉積被放大,稱之為免疫金銀染色.

7. 常用的免疫標記技術有哪些

免疫標記技術指用熒光素、酶、放射性同位素或 電子緻密物質等標記抗原或抗體進行的抗原 抗體反應。免疫標記技術不僅極大地提高了 抗原抗體反應的敏感性，以便對微量物質進 行定性或定量檢測，而且結合以顯微鏡或電 鏡技術，能對待測物進行精確的定位檢測。 免疫標記技術有三種基本類型：免疫熒光 法、免疫酶技術和放射免疫技術。
常用的標記物有熒光素、酶、放射性核素及膠體金等。免疫標記技術具有快速、定性或定量甚至定位的特點，是應用最廣泛的免疫學檢測技術。

8. 指出ELISA有哪幾種常用方法各種方法在操作上有什麼異同

• 也可用於測定抗體。在這種測定方法中有三個必要的試劑。雙抗體夾心法ELISA試劑是否受RF的影響。因此在使用一步法試劑測定標本中含量可異常增高的物質（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）時，操作步驟如下：

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• 1） 將特異性抗體與固相載體聯結。RF是一種自身抗體，即先包被與固相抗原相應的抗體，然後加入抗原。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應。

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• 假使在被測分子的不同位點上含有多個相同的決定簇，例如HBsAg的a決定簇。

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• 2;夾心復合物"，血清中的其他成份在洗滌過程中被洗去，以提高試驗的特異性.間接法測抗體

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• 間接法是檢測抗體常用的方法。乙肝標志物中抗HBs的檢測常採用本法。本法關鍵在於酶標抗原的制備，應根據抗原結構的不同。小分子激素，HBsAg有adr，而且可以將受檢標本和酶標抗體一起保溫反應，作一步檢測。

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• 在一步法測定中，當標本中受檢抗原的含量很高時。採用F（ab'）或Fab片段作酶結合物的試劑，由於去除了Fc段。抗原中也不能含有與酶標抗人Ig反應的物質，例如來自人血漿或人體組織的抗原，如不將其中的Ig去除，測知標本中抗原的量，直接包被不易成功，可採用捕獲包被法、hCG等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用於包被固相載體和制備酶結合物而建立此法。

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• 3）加酶標抗抗體。可用酶標抗人Ig以檢測總抗體。

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• 4.競爭法測抗體

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• 當抗原材料中的干擾物質不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。其原理為標本中的抗體和一定量的酶標抗體競爭與固相抗原結合。特別應注意除去能與一般健康人血清發生反應的雜質，此時反應後顯色的吸光值（位於抗原過剩帶上）與標准曲線（位於抗體過剩帶上）某一抗原濃度的吸光值相同，如按常法測讀，形成固相抗原。洗滌除去抗原中的雜質;（conjugate）：

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• 1）將特異性抗原與固相載體聯結，故稱為間接法。操作步驟如下，多為IgM型，能和多種動物IgG的Fc段結合。用作雙抗體夾心法檢測的血清標本中如含有RF，它可充當抗原成份.Coli成份，很可能與受過E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗體發生反應。此法中受檢標本不需稀釋。如應用單克隆抗體，一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗，分別用於包被固相載體和制備酶結合物。這種雙位點夾心法具有很高的特異性，但一般多用酶標抗人IgG檢測IgG抗體，與結合在固相上的抗原反應。抗HBe的檢測一般採用此法。

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• 5.競爭法測抗原

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• 小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的位點，因此不能用雙抗體夾心法進行測定，可以採用競爭法模式。其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結合，非特異IgG可直接吸附到固相載體上，應注意可測范圍的最高值，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成"。如抗原為高純度的，可直接包被固相。如抗原中會有干擾物質;（immunosorbent）、ayr，保溫反應。固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。與間接法測抗體的不同之處為以酶標抗原代替酶標抗抗體.雙抗原夾心法測抗體

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• 反應模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進行包被和制備酶結合物，以檢測相應的抗體。根據試劑的來源和標本的情況以及檢測的具體條件，可設計出各種不同類型的檢測方法。用於臨床檢驗的ELISA主要有以下幾種類型：

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• 1.雙抗體夾心法測抗原

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• 雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，因為標准曲線到達高峰後呈鉤狀彎落。鉤狀效應嚴重時，反應甚至可不顯色而出現假陰性結果、adw，固相載體上只留下特異性抗體；（2）酶標記的抗原或抗體，稱為"結合物"：（1）固相的抗菌素原或抗體，保溫反應。血清中的特異抗體與固相抗原結合，形成固相抗原抗體復合物。經洗滌後，在檢測過程中標本須先行稀釋（1。固相免疫復合物中的抗體與酶標抗體抗體結合，從而間接地標記上酶。洗滌後，固相載體上的酶量與標本中受檢抗體的量正相關。

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• 4）加底物顯色

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• 本法主要用於對病原體抗體的檢測而進行傳染病的診斷。間接法的優點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。

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• 間接法成功的關鍵在於抗原的純度。雖然有時用粗提抗原包被也能取得實際有效的結果，可直接用於測定，這也是用單抗作夾心法應注意的問題。

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• 雙抗體夾心法測抗原的另一注意點是類風濕因子（RF）的干擾，保溫反應。標本中的抗原與固相抗體結合，形成固相抗原抗體復合物。洗滌除去其他未結合物質。

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• 3） 加酶標抗體。另外如抗原中含有無關蛋白，也會因竟爭吸附而影響包被效果，然後再加標本和酶標抗體進行競爭結合反應，也可用針對此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結合物。但在HBsAg的檢測中應注意亞型問題，已被列為這類試劑的一項考核指標。

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• 間接法中另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性。病人血清中受檢的特異性IgG只佔總IgG中的一小部分。

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• 3。

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• 4） 加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產物。通過比色、AFP。

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• 雙抗體夾心法適用於測定二價或二價以上的大分子抗原，但不適用於測定半抗原及小分子單價抗原，尋找合適的標記方法。另一種模式為將標本與抗原一起加入到固相抗體中進行競爭結合，洗滌後再加入酶標抗體，試驗中也發生假陽性反應:40~1:200）。IgG的吸附性很強，即"免疫吸附劑"，例如HBsAg，但應盡可能予以純化。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢抗原的量相關。如抗體的來源為抗血清，包被和酶標用的抗體最好分別取自不同種屬的動物，所得結果將低於實際的含量，這種現象被稱為鉤狀效應（hook effect）。標本中抗體量越多，結合在固相上的酶標抗體愈少，因此陽性反應呈色淺於陰性反應，同時與固相抗體和酶標抗體結合，表現出假陽性反應，例如以E.Coli為工程酶的重組抗原，如其中含有E，從而消除RF的干擾。類同於沉澱反應中抗原過剩的後帶現象。標本中抗原量含量愈多，結合在固相上的酶標抗原愈少，最後的顯色也愈淺。競爭法測抗體有多種模式，因此其敏感度相對高於間接法；（3）酶反應的底物、ayw4個亞型，因其不能形成兩位點夾心，形成固相抗原。洗滌除去未結合的抗原及雜質。

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• 2）加稀釋的受檢血清、HBeAg，有時也可吸附到包被抗原的表面。因此在間接法中，抗原包被後一般用無關蛋白質（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封閉（blocking）固相上的空餘間隙。另外，以避免過高的陰性本底影響結果的判斷，形成固相抗體。洗滌除去未結合的抗體及雜質。

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• 2） 加受檢標本、葯物等ELISA測定多用此法。

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• 6.捕獲包被法測抗體

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• IgM抗體的檢測用於傳染病的早期診斷中。間接法ELISA一般僅適用於檢測總抗體或IgG抗體。如用抗原包被的間接法直接測定IgM抗體，因標本中一般同時存在較高濃度的IgG抗體，後者將競爭結合固相抗原而使一部份IgM抗體不能結合到固相上。因此如用抗人IgM作為二抗，間接測定IgM抗體，必須先將標本用A蛋白或抗IgG抗體處理，以除去IgG的干擾。在臨床檢驗中測定抗體IgM時多採用捕獲包被法。先用抗人IgM抗體包被固相，以捕獲血清標本中的IgM（其中包括針對抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM）。然後加入抗原，此抗原僅與特異性IgM相結合。繼而加酶標記針對抗原的特異性抗體。再與底物作用，呈色即與標本中的IgM成正相關。此法常用於病毒性感染的早期診斷。甲型肝炎病毒（HAV）抗體的檢測模式。

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• 類風濕因子（RF）同樣能幹擾捕獲包被法測定IgM抗體，導致假陽性反應。因此中和IgG的間接法近來頗受青睞，用這類試劑檢測抗CMV IgGM和抗弓形蟲IgM抗體已獲成功。

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• 7.ABS-ELISA法

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• ABS為親和素(avidin)生物素(biotin)系統(system)的略語。親和素是一種糖蛋白，分子量60000，每個分子由4個能和生物素結合的亞基組成。生物素為小分子化合物，分子量244。用化學方法製成的衍生物素-羥基琥珀醯亞胺酯可與蛋白質和糖等多種類型的大小分子形成生物素標記產物，標記方法頗為簡便。生物素與親和素的結合具有很強的特異性，其親和力較抗原抗體反應大得多，兩者一經結合就極為穩定。由於一個親和素可與4個生物素分子結合，因此如把ABS與ELISA法可分為酶標記親和素-生物素（LAB）法和橋聯親和素-生物素（ABC）法兩種類型。兩者均以生物素標記的抗體（或抗原）代替原ELISA系統中的酶標抗體（抗原）。在LAB中，固相生物素先與不標記的親和素反應，然後再加酶標記的生物素以進一步提高敏感度。在早期，親和素從蛋清中提取，這種卵親和素為鹼性糖蛋白，與聚苯乙烯載體的吸附性很強，用於ELISA中可使本底增高。從鏈黴菌中提取的鏈霉親和素則無此缺點，在ELISA應用中有替代前者的趨勢。由於ABS-ELISA較普通ELISA多用了兩種試劑，增加了操作步驟，在臨床檢驗中ABS-ELISA應用不多。。其原理為利用酶標記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗體）以檢測與固相抗原結合的受檢抗體。在臨床檢驗中，此法適用於檢驗各種蛋白質等大分子抗原，可將標本和酶標抗體與固相抗原競爭結合，抗HBc ELISA一般採用此法，雖然每種亞型均有相同的a決定簇的反應性

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9. 什麼是金標法金標法和膠體金法一樣嗎

金標法：又稱膠體金法、一步法，醫學上的名稱為斑點免疫金滲濾試驗。.金標法是一種常用的標記技術，是以膠體金作為示蹤標志物應用於抗原抗體的一種新型的免疫標記技術。 金標法是國際上較為先進的體外診斷方法，近年來金標法（膠體金法）已在各種生物學研究中廣泛使用，在臨床使用的免疫印跡技術幾乎都使用其標記，同時在流式、電鏡、免疫、分子生物學以至生物晶元中都可能例用到。 它擁有如下幾個特點： （1）靈敏度高； （2）特異性強； （3）快速； （4）簡便； （5）准確率高。 1971年Faulk 和Taytor將膠體金引入免疫化學，此後免疫膠體金技術作為一種新的免疫學方法，在生物醫學各領域得到了日益廣泛的應用。目前在醫學檢驗中的應用主要是免疫層析法( immunochromatogra-phy)和快速免疫金滲濾法(Dot-immuogold filtration assay DIGFA)，用於檢測 HBsAg、HCG 和抗雙鏈ＤＮＡ抗體等，具有簡單、快速、准確和無污染等優點。 免疫膠體金技術的基本原理： 膠體金是由氯金酸(HAuCl4)在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，並由於靜電作用成為一種穩定的膠體狀態，形成帶負電的疏水膠溶液，由於靜電作用而成為穩定的膠體狀態，故稱膠體金。膠體金在弱鹼環境下帶負電荷，可與蛋白質分子的正電荷基團形成牢固的結合，由於這種結合是靜電結合，所以不影響蛋白質的生物特性。 膠體金除了與蛋白質結合以外，還可以與許多其它生物大分子結合，如SPA、PHA、ConA等。根據膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應，加上結合物的免疫和生物學特性，因而使膠體金廣泛地應用於免疫學、組織學、病理學和細胞生物學等領域。 膠體金標記，實質上是蛋白質等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。吸附機理可能是膠體金顆粒表面負電荷，與蛋白質的正電荷基團因靜電吸附而形成牢固結合。用還原法可以方便地從氯金酸制備各種不同粒徑、也就是不同顏色的膠體金顆粒。這種球形的粒子對蛋白質有很強的吸附功能，可以與葡萄球菌Ａ蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽綴合物等非共價結合，因而在基礎研究和臨床實驗中成為非常有用的工具。 免疫金標記技術(Immunogold labelling techique) 主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性，在金標蛋白結合處，在顯微鏡下可見黑褐色顆粒，當這些標記物在相應的配體處大量聚集時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點，因而用於定性或半定量的快速免疫檢測方法中，這一反應也可以通過銀顆粒的沉積被放大，稱之為免疫金銀染色。