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鑒別轉化子的方法

發布時間:2022-05-14 22:30:00

Ⅰ 轉化子和重組子怎樣區分 幫幫忙

重組子(recon):兩個突變位點之間可發生交換產生野生型的最小單位,即不能由重組分開的基本單位。
轉化子:受體菌直接吸收了來自供體菌的DNA片段,通過交換,把它組合到自己的基因組中,從而獲得供體菌部分遺傳性狀的現象。

Ⅱ 目的基因與載體的連接產物塗布於平板後由什麼篩選出轉化子/非轉化子

用於基因工程的許多質粒載體含有編碼抗生素抗性的基因,如pBR322攜帶有氨苄青黴素抗性基因(amp)和四環素抗性基因(tet)。這些基因作為載體的標記,其中一個(如amp)可以用來選擇轉化子。因轉化子能在含有抗生素的瓊脂糖培養基上形成菌落,而非轉化的細胞被殺死。另一個基因(如tet)可以用作重組的質粒載體的標記,因為目標序列插入此基因導致插入失活。因此,用重組質粒轉化的細胞僅對amp有抗性,而環狀(天然)質粒轉化的細胞對amp和tet都有抗性。


區分這兩類轉化體的一種方法是使用復制平板:


  1. 轉化體首先放在含氨苄青黴素的瓊脂培養基的培養皿上生長,過夜培養後,兩種類型的細菌均會產生單一的菌落。

2. 將一張無菌茸板輕輕壓在培養皿表面,使一些細胞轉移到板上。


3. 將板上的細菌接種在含有四環素的瓊脂培養基上(即一個復制平板):任何僅能在第一個平板上生長的菌落一定來源包含有重組質粒的細胞。這些菌落可用於篩選特定的目的DNA(如使用免疫技術)。


PUC系列質粒比pBR322系列質粒的應用更廣泛,這種質粒具有以下優點:


  1. 拷貝數:每個細菌細胞中存在著幾千個相同拷貝的質粒,提高了質粒DNA的產量。

2. 重組子的「一步選擇」:這種質粒攜帶有氨苄青黴素抗性基因,並在β-半乳糖核苷酶的基因含有一個多克隆位點。β-半乳糖核苷酶基因的插入失活可以被包含有一種合適的酶誘導物(如異丙醇基硫代半乳糖苷)和生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(Xgal)的瓊脂培養基檢測到。來源於有質粒的細胞的菌落呈藍色,而含有重組分子的菌落呈白色。另有一些質粒使用不同的標記物,如熒光素酶基因可以在熒光素底物的存在下通過生物發光檢測到。

Ⅲ 限制酶介導整合轉化

限制酶介導整合(Restriction Enzyme Mediated Integration,REMI)技術由Schiestl和Petes於1991年在研究Saccharomyces cerevisiae時首先建立,目前已被廣泛應用於絲狀真菌的遺傳轉化當中,是在限制性內切酶介導下用質粒DNA轉化真菌的一種方法。研究發現,轉化混合物中加入限制酶可以明顯提高轉化效率,因此,限制酶已被用於提高真菌插入突變的效率及單拷貝插入的效率(Kahmann R et al.,1999;Riggle PJ et al.,1998)。它可以通過單拷貝質粒的非同源整合使基因突變,從而直接獲得基因標記,並可通過質粒拯救等技術進行基因克隆和功能分析,大大提高了轉化效率。

8.1.6.1 限制酶介導整合(REMI)的基本原理

限制性內切酶是生物體內能識別並切割特異的雙鏈DNA序列的一種內切核酸酶,可識別DNA上特異的位點並在該位點處進行切割。用酶切得到的線性質粒與該限制性內切酶組成的轉化混合物轉化細胞時,限制性內切酶進入受體細胞後會切割其細胞基因組,使之產生與線性質粒互補的粘末端,隨後,外源質粒通過鹼基配對插入基因組。如果插入發生在一個已知基因的內部,則該基因的功能可能改變或喪失,即發生了基因突變;如果插入發生在一個未知基因的內部,可通過受體細胞表型的改變篩選轉化子,再結合質粒拯救(plasmid rescue)即可在發現新基因的同時對該基因做深入地研究;當外源質粒帶有抗性基因時,可利用此抗性基因在受體細胞內的表達篩選轉化子,此過程即基因標記。

8.1.6.2 限制酶介導整合轉化木霉的一般步驟

REMI是一種在限制性內切酶介導下,將線性質粒DNA隨機插入受體細胞基因組的技術,用於基因突變、基因標記、尋找新基因等方面的研究。REMI轉化一般包括3個過程,即木霉原生質體制備(過程見8.1.1)、限制酶介導的轉化和轉化子篩選。

限制酶介導的轉化,在限制性內切酶存在下,由該限制酶酶切的線性化質粒通過PEG介導或電擊轉化細胞,隨後,進入細胞的限制性內切酶會切割受體細胞基因組特定部位,使之產生與線性質粒互補的粘末端,與外源質粒通過鹼基配對連接,從而質粒與基因組整合。質粒的線性化通常使用識別6個鹼基序列的限制性內切酶,而PEG介導或電擊時共轉化用的限制性內切酶可以使用與質粒線性化所用同一種限制性內切酶或使用識別4個鹼基序列的同尾酶。識別4個鹼基序列的限制性內切酶比識別6個鹼基序列的同尾酶切割基因組DNA頻率更高(它們可識別的序列在完全隨機的情況下,平均每256個和4096個鹼基中會出現一個識別位點),從而線性質粒隨機整合到基因組的位點更多樣,基因獲得突變的概率就更高。REMI質粒含有篩選標記,便於篩選成功整合的轉化子。篩選標記依賴於所用的質粒,可以使用營養缺陷型標記,例如使用尿嘧啶營養缺陷型細胞,質粒整合後使細胞恢復了合成尿嘧啶的能力;還可以使用攜帶抗葯性基因的質粒,例如潮黴素和博萊黴素(Zeocin)的基因等,對此沒有特定的限制。

轉化子篩選,質粒插入基因組是隨機的,插入的結果可能使某個或某些基因的功能喪失,最終表現為細胞某種表型丟失或獲得新表型。因此,轉化子篩選方法須依據所要研究細胞表型的變化而定,即針對不同的表型選用合適的篩選方法。例如,李紀順等(2013)利用外源β-1,4-葡聚糖酶基因REMI法轉化綠色木霉,即採用潮黴素(HygB)抗性篩選結合葡聚糖酶活性篩選獲得高效生防木霉工程菌株L-10。Tang等(2009)利用限制性內切酶介導的整合(REMI)構建轉化具有降解有機磷農葯(敵敵畏)功能的深綠木霉(T.atroviride)T23,獲得了對敵敵畏降解能力較野生株的T23的基礎上明顯改善的轉化子。

8.1.6.3 限制酶介導整合轉化的影響因素

在REMI轉化中有2次要用到限制性內切酶,一次是質粒的線性化需要限制性內切酶處理;另一次是用限制性內切酶與線性化的質粒共轉化受體細胞,進入受體細胞後限制性內切酶切割受體細胞基因組。其中,質粒酶切為基因工程的常規技術,對REMI的實驗結果影響不大,而影響較大的是共轉化過程中所涉及的限制性內切酶。

限制性內切酶對轉化率的影響如下:①限制性內切酶的加入會提高轉化率,但針對不同的微生物,限制性內切酶對轉化率的影響程度不同。例如,在有切割活性的限制性內切酶作用下,線性質粒插入盤基網柄菌基因組的頻率大於酵母(Kuspa A et al.,1994)。②在一定范圍內,限制性內切酶用量的增加可以提高轉化率,但達到峰值後又會因限制性內切酶用量的繼續增加而下降(VanDijk R et al.,2001)。③限制性內切酶的切割活性對於轉化率是關鍵因素,例如Palaniyandi(1998)實驗用的BamHⅠ用其突變體BamHⅠ-E77K 蛋白替代,後者雖也能與BamHⅠ位點結合,但切割DNA的速率只有BamHⅠ的1/1000,由BamHⅠ-E77K介導的REMI並未對轉化率的提高有所幫助。此結果說明,限制性內切酶的切割活性對由它介導的REMI是必要的。

通常說來,REMI對質粒沒有特殊要求,通常質粒酶切和共轉化所選用限制性內切酶應具有相同黏性末端,但有研究表明,質粒插入受體細胞基因組的前提並不一定是質粒與基因組被限制性內切酶切割後產生的末端完全互補,也不需要質粒的末端是粘末端,但需要線性化質粒的末端和受體細胞基因組所產生的末端至少有2個鹼基相同。一種解釋是:受體細胞內存在一個可對DNA進行適當修飾的酶系統,該酶系統通過移去不配對的鹼基、在DNA連接酶催化下添加鹼基、外切酶使平末端轉變成粘末端等,使質粒和受體細胞基因組末端重新配對。但不同物種類似的酶系統存在的普遍性仍需進一步研究。

Ⅳ 「轉化子」的概念什麼

用於基因工程的許多質粒載體含有編碼抗生素抗性的基因,如pBR322攜帶有氨苄青黴素抗性基因(amp)和四環素抗性基因(tet)。這些基因作為載體的標記,其中一個(如amp)可以用來選擇轉化子。因轉化子能在含有抗生素的瓊脂糖培養基上形成菌落,而非轉化的細胞被殺死。另一個基因(如tet)可以用作重組的質粒載體的標記,因為目標序列插入此基因導致插入失活。因此,用重組質粒轉化的細胞僅對amp有抗性,而環狀(天然)質粒轉化的細胞對amp和tet都有抗性。

區分這兩類轉化體的一種方法是使用復制平板:

1. 轉化體首先放在含氨苄青黴素的瓊脂培養基的培養皿上生長,過夜培養後,兩種類型的細菌均會產生單一的菌落。

2. 將一張無菌茸板輕輕壓在培養皿表面,使一些細胞轉移到板上。

3. 將板上的細菌接種在含有四環素的瓊脂培養基上(即一個復制平板):任何僅能在第一個平板上生長的菌落一定來源包含有重組質粒的細胞。這些菌落可用於篩選特定的目的DNA(如使用免疫技術)。

PUC系列質粒比pBR322系列質粒的應用更廣泛,這種質粒具有以下優點:

1. 拷貝數:每個細菌細胞中存在著幾千個相同拷貝的質粒,提高了質粒DNA的產量。

2. 重組子的「一步選擇」:這種質粒攜帶有氨苄青黴素抗性基因,並在β-半乳糖核苷酶的基因含有一個多克隆位點。β-半乳糖核苷酶基因的插入失活可以被包含有一種合適的酶誘導物(如異丙醇基硫代半乳糖苷)和生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(Xgal)的瓊脂培養基檢測到。來源於有質粒的細胞的菌落呈藍色,而含有重組分子的菌落呈白色。另有一些質粒使用不同的標記物,如熒光素酶基因可以在熒光素底物的存在下通過生物發光檢測到。

如何用抗生素插入失活法和IacZ基因插入失活法篩選轉化子

lacZ基因插入法就是在lacZ基因上插入外源DNA片段,重組質粒中lacZY基因被破壞,不能分解底物產生藍色菌落,形成白斑。因此通過藍白斑就能大致確定重組轉化子。 抗生素插入失活法就是抗生素基因上插入外源DNA片段,重組質粒中抗生素抗性基因被破壞,不能抗相應的抗生素不能生長。因此將轉化子復制在有無相應抗生素的平板上,通過菌落能否生長就能大致確定重組轉化子,即不能生長的為重組轉化子。

Ⅵ 如何篩選和鑒定轉化子

你沒有說明具體是什麼轉化子,一般的重組質粒轉化細菌鑒定就是提質粒,酶切檢測目的片段,也可以用pcr檢測,最保險的方法當然就是測序。

Ⅶ 假如一特異PCR擴出的基因或基因片斷重組進T載體並轉化大腸桿菌,如何鑒定並獲得真實轉化子

你這個實驗應該是從轉化以後再開始的吧,
制備藍白篩選的平板,一般的T載體我們都會選擇氨苄抗性的板子來塗平板,因為氨苄的比卡那的板子好長,因為你是PCR擴增出來的,所以推薦你使用大號的平板以獲取更多的菌落,將IPTG(1mol/L濃度)取4-8微升,取用二甲基甲醯胺溶解的濃度為100微摩爾每升的X-Gal,50-80微升,將兩者混勻之後均勻得塗到含有氨苄抗生素的大平板上,在暗處晾乾之後將轉化後的菌液全塗到平板上,過夜培養。次日就會發現平板上會長出菌落,有藍色和白色的菌落,取白顏色的菌落接種,過夜培養,然後提取質粒進行測序。注意有一種情況,會看到有淺藍色的菌落,這樣的菌落是因為轉化進的片段比較小造成的,這種菌落也不是陽性的。只有白顏色的是陽性菌落。

Ⅷ 雙酶切時,XhoI和XbaI分別是什麼位點,如何篩選轉化子

XhoI酶切位點是 C*TCGAG
XbaI 酶切微點是 T*CTAGA
*代表斷裂處
轉化子篩選方法取決於你的載體

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