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檢測pcr擴增出來的方法

發布時間:2024-05-15 01:09:12

1. PCR實驗方法步驟

PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途,下面小編就向大家介紹PCR實驗方法步驟:

方法

2. PCR產物的檢測方法哪些

PCR產物的檢測方法:

  1. 瓊脂糖凝膠電泳

    這是實驗室最常用的方法,簡便易行,只需少量DNA即可進行實驗。其原理是不同大小的DNA分子通過瓊脂糖凝膠時,由於泳動速度不同而被分離,經溴化乙錠(EB)染色,在紫外光照射下DNA分子發出熒光而判定其分子的大小。

    用於電泳檢測PCR產物的瓊脂糖濃度常為1%—2%,應該使用純度高的電泳純級瓊脂糖,這種瓊脂糖已除去了熒光抑制劑及核酸酶等雜質。

    (1)制膠

    瓊脂糖凝膠厚度約為3~5mm。過薄則加樣孔樣品會溢出來,過厚觀察時熒光穿透不強以至有些小片段DNA帶型不易分辨。如配製2%凝膠100ml,稱取瓊脂糖2g於三角瓶中,加入100ml0.5×TBE液,微波爐加熱2-5min,使瓊脂糖完全溶解(注意不要暴沸),置室溫等溫度下降至60℃時,加入終濃度0.5μg/ml的EB液,充分混勻後倒板(注意排除氣體)。

    (2)加樣和電泳

    上樣時一般取PCR反應液5~10μl,加入3μl溴酚蘭液,充分混勻,加入凝膠加樣孔中。電泳儀可用一般穩壓可調中壓電泳儀,電泳工作液為0.5×TBE液,接通電源,使樣品由負極向正極移動。60-100V恆壓電泳約30-60分鍾。

    (3)檢測

    將凝膠板放在紫外透射儀的石英玻璃台上進行檢測,DNA產物與熒光染料EB形成橙黃色熒光復合物。觀察各泳道是否有橙黃色熒光帶出現,並與擴增時所設的陽性對照比較,判斷陽性或陰性結果。也可在電泳時以標準分子量作對照,判斷其擴增片段是否與設計的大小相一致。

  2. 聚丙烯醯胺凝膠電泳

    聚丙烯醯胺凝膠電泳比瓊脂糖凝膠電泳繁瑣,但在引物純化、PCR擴增指紋圖、多重PCR擴增、PCR擴增產物的酶切限制性長度多態性分析時常用到。

    聚丙烯醯胺凝膠電泳分辨DNA片段的有效范圍:

    (1)制膠

    在兩塊制膠玻璃板中間放上墊片,放上制膠架,擰緊制膠螺絲夾緊玻璃板。

    制備適量合適濃度的凝膠,使之略多於膠板。制備100μl體積凝膠的配製方法見下表。

    不同濃度(%)聚丙醯胺凝膠的製法:



    在加入TEMED和10%過硫酸銨後,立即混勻,倒入放置45℃角的玻璃板內,完全注滿(注意不要有氣泡),迅速將玻璃板放置水平位置。立即放成型梳子於腔頂並夾緊,待30-60分鍾膠聚合後,取下膠板,放入電泳槽中固定。

    (2)加樣和電泳

    上下槽中加入1×TBE電泳緩沖液,溢過加樣孔,拔出梳子,排出加樣孔中的氣泡,將PCR產物或限制性內切酶消化產物2與1上樣緩沖液混勻,用微量注射器加入加樣孔底部,使樣品在孔底成一層,兩側孔中加入標準分子量的DNAMarker。

    以2-10V/cm電壓電泳,電泳時間足夠長,使片斷足以分開,待指示劑走到適宜位置時關閉電源,將膠片取出。

    (3)銀染

    分開兩塊玻璃板,將凝膠片放入100ml銀染固定液中振盪15min,雙蒸水洗3次,每次2min,然後將凝膠片轉入100ml0.2%的AgNO3中於搖床上染色約10min,吸去AgNO3液,用雙蒸水洗3次,每次30s,加入100ml顯色液約7-10min,待DNA帶顯示清除時,吸去顯色液,加入固定液Na2CO3,靜置2-3min,取出凝膠觀察。

3. 科普講堂|實時熒光定量PCR檢測方法

聚合酶鏈式反應(PCR)是一種用於放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術,它可看作是生物體外的特殊DNA復制,PCR的最大特點是能將微量的DNA大幅增加。目前,PCR成為分子生物學研究必不可少的一部分。實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)技術,是指在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程,最後通過標准曲線對模板進行定量分析的方法。該項技術可以對DNA、RNA樣品進行相對定量、絕對定量和定性分析,提高了普通PCR技術的特異性和准確性,被廣泛應用於基礎研究、疾病診斷、農業檢測和法醫調查等領域。

一、常規PCR

利用DNA分子會在體外95°高溫時會發生變性解旋變成單鏈,然後降溫到60°C左右時引物會與單鏈DNA按鹼基互補配對原則結合,接著再升高溫度到72°C左右,即DNA聚合酶最適反應溫度,DNA聚合酶會沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成相應的互補鏈,如此循環往復以達到DNA分子擴增的目的,常規PCR技術無法實現精確定量。

二、實時熒光定量PCR

如要對DNA、RNA樣品進行精確定量研究,就需要採用實時熒光定量PCR,根據檢測實時熒光PCR產物的方式不同,實時熒光定量PCR主要有DNA結合染料法、基於探針的化學法、淬滅染料引物法等類型。

1.  DNA 結合染料法

原理 :應用一種帶有熒光的、非特異的DNA結合染料檢測PCR過程中積累的擴增產物。

應用於核算定量和基因表達驗證。

優缺點: 它們的優點是可以對任何雙鏈DNA 進行定量,不需要探針,具有相對高的靈敏度和可靠性,並且成本低,簡單易用,缺點是它們能在反應中結合所有的DNA雙鏈,其中包括在PCR過程中產生的引物二聚體或其他非特異產物。

染料法一般使用的是SYBR Green I染料,這是一種可以與雙鏈DNA小溝結合的熒光染料,不會與單鏈DNA結合,並且在游離狀態下幾乎無熒光,只有與雙鏈DNA結合才會發出熒光,因此將PCR擴增產生的雙鏈DNA數量與熒光強度直接關聯,產生實時監測的效果。

2.  基於探針的化學法

原理: 應用一個或多個熒游標記的寡核苷酸探針檢測PCR擴增產物;依賴熒光能量共振傳遞檢測特異性擴增產物。

應用於核酸定量、基因表達驗證、等位基因鑒別、SNP分型、病原體和病毒檢測、多重PCR。

優缺點: 探針法的鑒別能力遠遠大於DNA結合染料法,因為它們只與目的產物結合,從不與引物二聚體或其他非特異產物結合,缺點是它的合成價格高。

探針法中最常用的TaqMan探針是一種寡核苷酸探針,熒光基團連接在探針的5』末端,而淬滅基團則在3』末端,PCR擴增時在加入引物的同時加入探針,探針完整時,熒光信號被淬滅基團吸收,PCR擴增時,5』→3』外切酶活性將探針酶切降解,使熒光基團和淬滅基團分離,從而檢測器可以接收到熒光信號。

3.  淬滅染料引物法

原理: 採用熒游標記引物擴增,從而使熒游標記基團直接摻入PCR擴增產物中,依賴熒光能量共振傳遞。

應用於核酸定量、基因表達驗證、等位基因鑒別、SNP分型、病原體和病毒檢測、多重PCR

優缺點:探針和目標片段的特異性結合產生熒光信號,因此減少了背景熒光和假陽性,還可進行多重PCR擴增,缺點是原料成本價格高

三、實時熒光PCR儀

實時熒光PCR系統包括熱循環儀,用於熒光激發的光學系統以及用於收集熒光數據和管理分析的計算機軟體,數據通過實時分析軟體以圖表的形式顯示。

4. PCR擴增後的片段 用什麼方法檢測

聚合酶鏈式擴增反應。

通過電泳進行產物定量只是相對的大概估算,一般的marker都有這樣的功能,比如你的產物小於2000bp的話,你在泳道加入5ul 的TAKARA的DL2000marker,其中最亮的一條帶750bp含量約為150ng,其他的條帶約為50ng,根據你的條帶的明暗和marker進行比較,即可粗略的估算你的產物的量。

5. PCR產物的檢測方法有哪些都有什麼原理

1.瓊脂糖凝膠電泳 同時點分子量marker,根據marker條帶判斷產物分子量大小,從而大致判斷是不是你要的
2.酶切 已知你產物的序列,看上面有什麼酶切位點,用一個酶或者兩個酶切斷,看與理論預測的條帶數目和大小是否一致.一般檢測有以上兩步就行了,如果需要知道確切的需要進行3
3.測序 連接到pMD-18t 載體上,轉到大腸桿菌中.拿到公司去測序,測序結果通過gene bank比對看與哪個基因一致,這種方法最准確
4.表達 pcr產物連到真核或者原核表達載體上,適宜條件表達出來以後的蛋白做質譜分析,看與理論產物表達的蛋白是否有一致的片段

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