Ⅰ 生化鑒定of怎麼配製
不同細菌所具有的酶系統各不相同，對營養物質的利用能力各異，它們在代謝過程中所產生的代謝產物也不同，通常用化學或生物化學方法檢測細菌的代謝產物，有助於細菌屬、種的鑒定。這種利用生化方法來鑒別細菌的實驗，稱之為細菌生化反應，是鑒定細菌的重要方法之一。通過本次實驗，要求熟悉常用生化實驗原理，掌握其方法、結果判定及其意義。
1 單糖發酵實驗
不同微生物分解利用糖類的能力有很大差別，有的能利用有的不能利用，能利用者，又可分為產氣或不產氣。可用指示劑及各種發酵管進行檢測。
本實驗主要是檢查細菌對各種糖、醇和糖苷等的發酵能力，從而進行各種細菌的鑒別。每次生化實驗，常需同時接種多管不同生化反應管。根據生化反應管的不同加不同指示劑，常用的指示劑有酚紅、溴甲酚紫，溴百里酚藍等。
【材料】
1．菌種：大腸埃希菌、傷寒沙門菌
2．培養基：葡萄糖、乳糖發酵管（內置倒管）或半固體培養基
【方法】
無菌操作，用接種環將上述兩種細菌接種葡萄糖及乳糖發酵管各一支；若為液體培養基，用接種環沾取少許細菌接種，置37℃培養18～24小時後觀察結果。觀察培養基顏色有無改變，小倒管中有無氣泡；若為半固體培養基，則用接種針接種，觀察穿刺線、管壁及管底有無微小氣泡，細菌有無動力，有動力時，細菌在培養基中沿穿刺線呈毛刷樣生長。
【結果】
觀察結果時，首先確定有無細菌生長，有細菌生長時，培養基常呈混濁狀。然後確定細菌對糖類分解情況，如發酵糖類產酸，則培養基中酸鹼指示劑變成其酸性顏色，可用「+」號表示。如發酵糖類產酸又產氣，此時培養基除變色外，在倒置小管中有氣泡出現，可用「 」表示。如細菌不分解該糖時，則指示劑不變顏色，倒置小管無氣泡，以「－」表示之。注意實驗時仔細觀察兩種細菌對兩種糖的發酵情況，並記錄好結果。
2 IMViC實驗
通常將吲哚實驗（I）、甲基紅實驗（M）、VP（Vi）實驗、枸櫞酸鹽利用實驗（C）稱為IMViC實驗，主要用於鑒別腸桿菌科各個菌屬，特別是大腸埃希菌和產氣腸桿菌的鑒別。
一、靛基質實驗
某些細菌具有色氨酸酶，能分解蛋白腖中的色氨酸，生成吲哚等產物。吲哚可用顯色反應檢測，吲哚能與對二甲基氨基苯甲醛結合，生成紅色化合物玫瑰吲哚。
實驗證明靛基質試劑可與17種不同的靛基質化合物作用而產生陽性反應，實驗前若先用二甲苯或乙醚等進行提取，再加試劑，只有靛基質或5-甲基靛基質在溶液中呈現紅色，因而結果更為可靠。
【材料】
1．菌種：大腸埃希菌，產氣腸桿菌斜面培養物
2．培養基：蛋白腖水培養基
3．試劑：吲哚試劑
【方法】
將上述兩種細菌分別接種於蛋白腖水培養基中，置37℃培養18～24小時後，沿管壁緩慢加入吲哚試劑0.5 mL（2～3滴），使試劑浮於培養物表面，形成兩層，立即觀察結果。
【結果】
兩液面交界處呈現紅色時為陽性，無變化者為陰性。
二、甲基紅實驗
有些細菌能分解葡萄糖產生丙酮酸，丙酮酸繼續分解生成乳酸、甲酸、乙酸等產物，由於產生大量有機酸，培養基pH下降至4.5以下，加入甲基紅指示劑時呈現紅色。而有些的細菌如產氣腸桿菌，由於分解葡萄糖時產酸量少，加上產生的酸進一步轉化為其它物質如醇、酮、醛等，培養基的pH維持在5.4以上，加入甲基紅指示劑時呈黃色。甲基紅為酸性指示劑，pH變色范圍為4.4～6.0。故在pH 5.0以下，隨酸度增加而顯紅色，在pH 5.0以上，則隨鹼度增加而呈黃色，在pH5.0或上下接近時，可能變色不明顯，此時應延長培養時間，重復一次實驗。
【材料】
1．菌種：大腸埃希菌，產氣腸桿菌斜面培養物
2．培養基：葡萄糖蛋白腖水培養基
3．試劑：甲基紅試劑（pH變色范圍為4.4～6.0）
【方法】
將兩種細菌分別接種於上述培養基中，置37℃恆溫箱中培養18～24小時後，各取2 mL培養液，加入甲基紅試劑2滴，輕搖後觀察。
【結果】
出現紅色反應為甲基紅實驗陽性，黃色為甲基紅實驗陰性。
三、VP（Voges－Proskauer）實驗
某些細菌在葡萄糖蛋白腖水培養基中能分解葡萄糖產生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧生成乙醯甲基甲醇，後者在強鹼環境下，被空氣中O2氧化為二乙醯，二乙醯與蛋白腖中的胍基化合物反應生成紅色化合物，稱V－P（＋）反應。本實驗一般用於腸桿菌科各菌屬的鑒別。用於芽胞桿菌和葡萄球菌等其它細菌鑒別時，普通培養基中的磷酸鹽因阻礙乙醯甲基甲醇的產生，操作時應省去或以NaCl代替。
【材料】
1．菌種：大腸埃希菌，產氣腸桿菌斜面培養物
2．培養基：葡萄糖蛋白腖水培養基
3．試劑：VP試劑（6% α－萘酚乙醇溶液，40% 氫氧化鉀溶液）
【方法】
將細菌分別接種於上述培養基中，置37℃恆溫箱中培養24～48小時後，分別取2 mL培養物，加入6%α－萘酚乙醇溶液1 mL，再加入40%氫氧化鉀溶液0.4 mL，充分振盪後，室溫下靜置5～30分鍾觀察結果。
【結果】
呈紅色反應為陽性，如無紅色出現，且置37℃4小時仍無紅色反應者為陰性。
本實驗常與甲基紅實驗一起使用。本實驗陽性，甲基紅實驗陰性，反之亦然。
四、枸櫞酸鹽（Citrate）利用實驗
枸櫞酸鹽培養基中不含任何糖類，枸櫞酸鹽為唯一碳源，磷酸二氫銨為唯一氮源。如果細菌能利用銨鹽作為唯一氮源，並能利用枸櫞酸鹽作為唯一碳源，則可在此培養基上生長，分解枸櫞酸鈉，生成碳酸鈉，使培養基變鹼，此時培養基中的溴麝香草酚藍指示劑由綠色變為深藍色。
【材料】
1．菌種：大腸埃希菌，產氣腸桿菌斜面培養物
2．培養基：枸櫞酸鹽斜面培養基
【方法】
將細菌分別接種於上述培養基斜面上，於37℃培養1～4天，每日觀察結果。
【結果】
培養基斜面上有細菌生長，而且培養基由綠色變深藍色者為陽性；無細菌生長，培養基顏色不變，保持綠色為陰性。
觀察並記錄以上實驗結果。
3 硫化氫實驗
有的細菌能分解培養基中含硫氨基酸（如胱氨酸、半胱氨酸），生成硫化氫，硫化氫遇鉛或鐵離子形成黑色的硫化鉛或硫化亞鐵沉澱物。該實驗在腸桿菌科的細菌生化鑒別中有重要作用。
【材料】
1．菌種：大腸埃希菌，普通變形桿菌。
2．培養基：醋酸鉛或克氏鐵瓊脂培養基。
【方法】
將細菌分別接種於上述培養基中，置37℃恆溫培養箱中培養1～2天後，觀察並記錄結果。
【結果】
醋酸鉛培養基出現黑色沉澱為陽性。不變色為陰性。克氏鐵瓊脂在底層和斜面交界處出現黑色沉澱者為陽性，不變色為陰性。普通變形桿菌：＋，大腸埃希菌：－。
4 脲酶實驗
有些細菌能產生脲酶，分解尿素產生2個分子的氨，使培養基變為鹼性，使酚紅呈現粉紅色。脲酶不是誘導酶，因而不論底物尿素是否存在，細菌均能合成此酶。其最適pH為7.0。主要用於腸桿科細菌的鑒定。
【材料】
1．菌種：大腸埃希菌、普通變形桿菌。
2．培養基：尿素培養基
【方法】
將細菌分別接種於尿素培養基中，置37℃恆溫培養箱中培養18～24小時後，觀察並記錄結果。
【結果】
培養基變紅色者為陽性，不變色者為陰性。
5 微生物自動分析
常規細菌學檢查，需首先將標本進行分離純化，取純化後的細菌進行一系列的鑒定，包括形態學檢查、生化反應、血清學反應等，由於手續煩瑣，分析周期長，且由於是手工操作，造成質量難已保證，雖然後來出現了各種商品化的檢測試劑及培養基，但仍不能從根本上解決上述問題。20世紀70年代後，微生物學家與工程技術人員密切合作，發明製造了許多快速的細胞培養分析系統，使原來緩慢煩瑣的手工操作變成了簡單的自動化操作，縮短了工作時間，提高了工作效率及培養陽性率。
一、微生物自動分析的原理
微生物鑒定的自動化系統大致分為兩大類：一類是自動血液培養檢測和分析系統，即檢測血標本中是否有細胞存在；另一類是自動微生物鑒定及葯敏系統，即將分離的細菌進行生化實驗加以鑒定，並進行抗生素的敏感性實驗。
（一）自動血培養檢測及分析系統的工作原理
自動血培養儀的工作原理分為以下三種：
1． 檢測培養基導電性質和電壓的變化進行微生物的分析
培養基中因含不同電解質而具有一定的導電性，微生物在生長代謝過程中可產生質子、電子和各種帶電荷的原子團［如在液體培養基中二氧化碳（CO2）轉變成CO3-］，通過電極檢測培養基的導電性或電壓改變即可判斷有無細菌的生長。
2． 應用測壓原理進行微生物的分析鑒定
很多需氧菌在胰酶消化大豆肉湯中生長時，由於需消耗培養瓶中的氧氣，故首先表現為吸收氣體，而厭氧細菌生長時，最初無吸收氣體的現象，僅表現為產生氣體［主要是二氧化碳（CO2）］，因此利用培養瓶內氣體壓力的改變即可檢測微生物的生長情況。
3． 利用光電原理監測的細菌檢測和分析系統
微生物在代謝過程中必然會產生終代謝產物二氧化碳（CO2），引起培養基pH下降，氧化還原電位的改變，利用光電比色檢測血培養瓶中某些代謝產物量的改變即可判斷有無微生物的生長。
（二）細菌自動鑒定及葯敏系統
1．工作原理
（1） 鑒定原理
採用數碼鑒定原理。如VITEK－AMS中每個用於鑒定的測試卡內有30項生化反應，每3項生化反應為一組，第1項生化反應陽性值為「4」，第二項反應陽性值為「2」，第三項反應陽性值為「1」，各項反應陰性記為「0」。將每組3項反應的陰、陽性結果轉換成數值並相加，如3項生化反應全部為陽性，其組值為「7」。第1、3項生化反應為陽性，組值為「5」，依此類推。將各組反應的組值相加，30項生化反應可得到一組10位數的生物數碼，在鑒定時有時還需外加補充實驗，共可獲得11位生物數碼。而MicroScan的WalkAway系列則採用8進制計演算法分別將28個生化反應轉換成8位生物數碼。計算機系統自動將這些生物數碼與碥碼資料庫進行對比，獲得相似鑒定值。
微生物自動鑒定系統的鑒定板包括常規革蘭陽（陰）性板和快速熒光革蘭陽（陰）性板兩種，其檢測原理各不相同，常規革蘭陽（陰）性板對各項生化反應結果（陰性或陽性）的判定是根據比色法的原理，將菌種接種到鑒定板後進行培養，由於細菌各自的酶系統不同，新陳代謝的產物也有所不同，而這些產物又具有不同的生化特性，因此各生化反應的顏色變化各不相同。儀器自動定時測定每一生化反應孔的透光度，當生長對照孔的透光度達到終點閾值時，指示已完成反應。快速熒光革蘭陽（陰）性板則根據熒光法的鑒定原理，熒光物質均勻地混在培養基中，將菌種接種到鑒定板後，通過檢測熒光底物的水解、底物被利用後的pH變化、特殊代謝產物的生成和某些代謝產物的生成率來進行菌種的鑒定。
（2） 葯物敏感實驗的測試原理
葯敏測試板的葯物敏感性實驗的實質是微型化的肉湯稀釋實驗，採用回歸法測定最低抑菌濃度（MIC）。每一種葯物一般選用3種不同葯物濃度，儀器每隔一定時間自動測定小孔中細菌生長狀況，得出待檢菌在各葯物濃度的生長斜率，經回歸分析得到MIC值，並根據NCCLS標准得到相應敏感度。
葯敏測試板也分為常規測試板和快速熒光測試板兩種。常規測試板的檢測原理為比濁法，即由於細菌生長情況不同而引起菌液濁度的變化，通過檢測濁度來確定MIC值；快速熒光測試板的檢測原理為熒光法，通過檢測熒光的增加間接地測定MIC值。
二、大腸桿菌的自動分析儀分析
【材料】
1．MicroScan主機：MicroScan微生物自動分析系統主要由主機，軟體系統，各種鑒定板（革蘭陽性板、革蘭陰性板，酵母菌板、厭氧菌板及HNID板），各種葯敏實驗板，專用取菌針， RENOK系統（用於將細菌懸液加入各種反應板中）等。
2．大腸桿菌肉湯培養物
3．革蘭陰性菌鑒定板
4．革蘭陰性葯敏板
5．專用取菌針
【方法】
1． 從包裝中取出反應板，要注意包裝內如沒有乾燥劑或板的外包裝有破損均不可使用。
2． 氧化酶實驗：在接種板前，先進行氧化酶實驗，把結果記錄在對應的工作單上。
3． 細菌懸液的配製：使用一校準過的專用取菌針沾取3～5個菌落，用環狀的蓋帽將針邊緣上多餘的細菌刮掉，將取菌針插入專用的prompt接種水瓶中，徹底混勻再接種。
4． 應用專用的RENOK系統在板孔中接種細菌懸液，每孔105～115 μL。
5． 滴加無菌礦物油：在GLU、URE、H2S、LYS、ARG、ORN和DCB孔中加入三滴礦物油。
6． 加密封條：對氧化酶陽性細菌，在CIT、MAL、ONPG、TAR、ACE、CET、OF/G和DCB孔上放置密封條，在DCB孔上密封條留一1/4英寸的定位孔。
7． 培養：將板置35℃非CO2培養箱中培育16小時左右。
8． 讀板：將板置MicroScan測試設備中讀板，計算機自動列印結果。
【注意事項】
1． 如果幹板是儲存於冰箱中，則要立即從錫紙包裝中取出干板，並讓其平衡至室溫後再水化，然後再加一干凈的蓋，已打開包裝的板應在同一天內使用。
2． 接種時，同時將被試懸液劃線接種到一血平板上，16～20小時培養後，如果平板上出現兩種或以上菌落形態，則必須重新測定。
3． 加礦物油時，孔中的培養基必須被礦物油完全封蓋，但不能使礦物油流出孔外。
4． 孵育時，為防止水分蒸發，在反應板上放置一塊干凈的蓋板。
5． 讀板前，用不含棉纖維的清潔紙將板底部抹凈。
6． 生長質控孔（G孔）無菌生長時不要讀板、控制孔（C孔）出現細菌生長或G孔無菌生長時不要讀取葯敏結果。