pcr產物的檢測方法

❶ 如何用PCR技術檢測結核桿菌

結核桿菌可以導致全身性疾病，特別是在發展中國家，其發病率較高，危害性極大.近幾年結核桿菌的變異性較大，對抗癆葯物的耐葯性增加，從而使結核病的發病大幅度增高.雖然傳統的塗片抗酸染色、細菌培養以及胸片檢查對大部分結核能作出正確的診斷，但對某些病人亦可造成誤診或漏診;動物接種雖特異性較高，但因時間較長，不能滿足臨床快速診斷的需要.近幾年也出現了幾種快速診斷方法，但也存在較大的缺陷，如短期培養後抗原免疫原性分析，即用放免方法或酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測BACTEC培養瓶中被培養標本所分泌的抗原，該方法可在BACTEC瓶本身鑒定出細菌之前，結合ELISA和塗片抗酸染色有效地鑒別典型和非典型分枝桿菌，敏感性較高，但存在培養時間長，重復性尚差的缺點.另一種是短期培養後核酸探針雜交法，即用特異性DNA探針與BACTEC瓶中培養的細菌染色體DNA雜交.該方法能有效地防止培養的假陰性結果，但卻易發生假陽性結果，加之採用的方法較為復雜和繁瑣，又有涉及同位素操作之嫌等，因而近來已較少應用.上面兩種方法都要藉助細菌培養來進行，雖然在時間上比傳統培養大大縮短，但缺乏快速診斷的優勢.近幾年興起的PCR方法基本實現了快速、靈敏、准確地診斷結核的目的，並且該方法正趨於常規化地應用於臨床一般實驗室.應用PCR方法檢測結核桿菌的首要條件是設計一對特異性DNA引物.該引物所引導的DNA擴增序列應是結核桿菌獨有的，且是結核桿菌的保守序列，這樣才能保證檢測結果的特異性.PCR方法的另外幾個關鍵因素是:①DNA提取，即對有限的結核桿菌應盡量地將其DNA完整、全部地提取;②TaqDNA聚合酶的活性;③PCR產物的檢測方法，即將PCR產物進行快速、靈敏、安全、准確的檢測.

一、結核桿菌DNA的提取

在該技術上，目前仍無一種統一常規化的方法.現有各方法都存在著提取DNA不足的缺點，因此，敏感性受到影響.現在主要的細菌裂解方法是:①蛋白酶K加表面活性劑法;②蛋白變性劑加表面活性劑煮沸法;③反復凍融法;④超聲波法;⑤溶菌酶加表面活性劑法.提取DNA的方法主要有:①酚一氯仿提取法:即用酚一氯仿抽提含有裂解菌體的溶液，然後用乙醇從抽提後的溶液中沉澱DNA.有的學者將硅酮加入酚一氯仿中，使水相和有機相的界面更牢固，這樣不但能減少抑制因子混入水相，而且使DNA提取量比未加硅酮方法高20%～30%;②Chaotrop-silica法:用二氧化硅(sio2)吸附裂解菌體釋放出的DNA，該二氧化硅用70%乙醇洗滌，而後乾燥，最後用雙蒸水洗脫(55℃).有報道認為該方法可以消除痰中的某些抑制因子.有的學者發現未預裂解的結核桿菌直接煮沸進行PCR的效果與預先處理的相仿，提示結核桿菌不預裂解也可直接進PCR.但加入的菌數應<約1000個，否則細菌蛋白會對PCR產生抑製作用.

二、引物的設計

根據不同型結核桿菌的序列，目前常在下列幾種序列內進行引物設計.

(一)編碼結核桿菌抗原的基因序列

1.編碼65-KDa蛋白抗原的基因序列:結核桿菌65-KDa蛋白抗原為存在於所有分枝桿菌細胞壁中的熱休克蛋白，也是一種交叉反應蛋白.所以依據該序列設計合成的引物，PCR能擴增出所有分枝桿菌的靶DNA片段，沒有屬內特異性.這種PCR較適用於結核病高發區大規模篩選和流行病普查.另外，對65-KDa蛋白基因的PCR擴增產物進行限制性酶切分析(RFLP)，也可以准確地檢測出結核桿菌的屬內歸屬.

2.編碼MPB64蛋白的基因序列：MPB64蛋白為結核桿菌復合群(MTBC，包括人型結核桿菌、牛型結核桿菌、BCG、非洲分枝桿菌、田鼠分枝桿菌)所特有.根據該蛋白的基因序列設計的引物進行PCR，對MTBC模板DNA顯示出高的特異性.

3.編碼38-KDa蛋白抗原b(Pab)的DNA序列:該序列僅存在於人型和牛型結核桿菌.採用在此基因內設計合成的引物和探針進行PCR，只能擴增人型和牛型結桿菌的DNA序列，能檢出少至10個結核桿菌的純化DNA.

4.編碼32-KDa蛋白的基因序列:32-KDa是蛋白分枝桿菌的一種分泌蛋白，由它的基因序列設計的引物和探針進行PCR，可以特異地檢測出分枝桿菌的DNA片段，能檢測出50fg的純化DNA，相當於10個結核桿菌.

5.編碼MPB70抗原的基因序列:MPB70為牛型結核桿菌所特有，由該基因序列設計的引物進行PCR，對牛型結核桿菌的檢測具有高度的特異性和敏感性.

(二)結核桿菌基因組重復序列

1.克隆DNA序列:目前所應用的DNA序列都是MTBC所特有，拷貝數在10個以上，包括亞克隆重組質粒pPH7301和克隆質粒PMTb4，分別含KpnI-SmaI插入片段和EcoRI-BamHI插入片段.根據這些基因序列設計的引物，其檢出限在20個結核桿菌以下.

2.插入序列:結核桿菌的插入序列主要有IS6110和IS986，它們僅見於MTBC.這兩種插入序列在基因組中的拷貝數為1--20個，選擇插入序列作為擴增的靶序列，可以得到較高的敏感性和特異性.尤其是IS6110，是目前進行臨床PCR檢測的首選區段.

(三)人型結核桿菌特異序列

mtp40是人型結核桿菌特異性DNA片段，Portillo等選擇mtp40作為靶序列，用PCR檢測結核桿菌，結果只能擴增人型結核桿菌DNA，敏感性達到10fg純化DNA量.

(四)分枝桿菌dnaJ基因

該基因為分枝桿菌共有，但種間又存在差別，在該基因序列內設計合成的引物和探針用於PCR檢測，能檢出50fg的純化分枝桿菌DNA，相當於10個結核桿菌.並可用於區分結核桿菌和非典型結核桿菌的鑒別診斷.

(五)rRNA序列

用「通用」引物在逆轉錄酶作用下，將16SRNA逆轉錄合成cDNA，然後對cDNA進行PCR擴增，檢出限達0.1fg化的結核桿菌rRNA.臨床標本中少至10個結核桿菌亦可被檢出，該方法由於加了一步反轉錄過程相對增加了難度，臨床一般少用.

三、PCR產物的檢測方法

通常PCR產物的檢測方法是經瓊脂糖電泳後，用溴化乙錠染色，然後在紫外燈下觀察或進一步採用標記的DNA探針雜交.為了進一步提高檢測的靈敏度，現多在引物和探針的標記上進行改進.由於放射性標記物的危害性，現多採用非放射性標記，如生物素、熒光素、酶及化學發光劑.Wilson等在巢式PCR的內側引物上分別摻入生物素和地高辛配基，這樣PCR產物兩端就分別帶有生物素和地高辛配基.PCR產物上的生物素和附著在微型滴定板表面的生物素蛋白結合，使PCR產物附著在滴定板上，另一端的地高辛配基和加入的抗地高辛配基鹼性磷酸脂酶結合形成抗地高辛配基鹼性磷酸脂酶偶合物，利用該偶合物405nm的吸收峰做光密度(OD)測定.另外，還可用吖啶酯標記探針進行雜交，用硼酸鈉將未雜交的探針分解，然後加入H2O2溶液和NaOH溶液使吖啶酯水解，最後測量吖啶的光通量.雖然這些方法安全、快速、但其敏感性還需進一步提高，操作還需進一步簡化.

四、PCR檢測結核桿菌的敏感性和特異性

(一)PCR的特異性

PCR特異性的關鍵首先取決於所選靶序列的特異性.現在常用的靶序列有:①分枝桿菌共有的靶序列，如65-KDa蛋白基因序列;②MTBC特有的靶序列，如MpB64蛋白基因序列、IS6110序列.③人型結核桿菌特異的靶序列，如mpt40序列.引物設計對PCR的特異性也至關重要.引物序列在靶DNA上的專一性、以及引物的特異性和保守性，以及引物本身的許多特性，如G+C含量引物3'未端序列的特異性和保守性及引物長度等都影響PCR的特異性，另外在設計引物時也要防止出現引物間的過多配對，以免形成過多的引物聚合體，造成非特異性擴增.

PCR擴增TB的特異性除上述先決條件外，也與PCR反應本身有極重要的關系.其中退火溫度是一個重要因素，退火溫度過低時，引物易發生非特異性結合，造成非特異性擴增.由於結核桿DNA中G+C含量高，因此可以適當提高退火溫度，以獲得更高的特異性.

另外，PCR緩沖液的組成，尤其是Mg2+濃度對PCR的特異性也有較大影響，Mg2+濃度過高，會提高PCR產物的產量，但同時也會增加非特異性擴增.

(二)PCR的敏感性

PCR的敏感性很高，一般可以檢測出1～100fg純化的結核桿菌DNA，相當於1～20個結核桿菌，這種敏感性明顯高於塗片法和培養法.PCR還可以檢出培養法易發生失敗的病例，從而大大提高菌陰結核病的診斷.另外PCR檢測TBDNA不受抗癆治療的影響，可以准確觀察抗癆治療的效果，防止血清學方法所帶來的假陰性結果.PCR敏感性受下列因素影響:①擴增靶序列的拷貝數.一般認為，結核桿菌染色體中含靶序列拷貝數越多，PCR敏感性越高，如38-KDa蛋白的基因序列在結核桿菌染色體中只有一個，而IS6110序列的拷貝數卻有10～12個，結果PCR敏感性後者比前者高100倍;②PCR的循環次數.在一定程度上，PCR循環次數越多，其敏感性就越高，但要合適.因為，循環次數過多會增加非特異性問題，造成結果判斷上的失誤，產生假陽性結果;③結核桿菌DNA的提取技術.處理標本時首先要富集(如離心)標本中的TB，使單位體積內TB含量變高，從而增加了起始模板數，有利於提高PCR的靈敏性.同時提取過程要盡可能減少抑製成份，並提高DNA的提取率.④PCR產物的檢測方法.雖然DNA探針雜交要比直接電泳法敏感性高得多，但步驟繁瑣，這也是影響PCR臨床應用的原因之一.但一般情況下，直接電泳法的敏感性完全能夠達到檢測的需要.

五.PCR在結核病臨床診斷中的應用

PCR檢測結核桿菌的優點決定了它在臨床上的應用價值和范圍，PCR檢測TB的優點主要表現如下:

1.能早期診斷TB菌血症:在TB感染的早期，特別是在TB病灶通過血源性外傳播時、及在外周血中存在極少量的TB時，PCR就能給於擴增並確診.此外，由於外周血中TB的含量甚微，又沒有新的病灶形成，因而血清學方法和物理方法均難以達到確診的目的，而對這類病灶的早期診斷在臨床治療上具有指導意義，因為早期菌血症是較易控制的，並可以防止繼發性TB病灶的形成.

2.時間短;PCR檢測TB僅需2-4h對於某些培養法難以實施的病例，PCR法則行之有效，同時提高了敏感性和特異性，可以檢測到1個TB菌.

3.有利於鑒別診斷:對於肺結核來說，其中的結核球和成人型原發性結核等，經常易於同肺癌的診斷相混淆.病灶中心部位經常出現既未見TB又未見癌細胞的壞死區.此時塗片檢測常是陰性的.在這種情況下，PCR檢測就顯得特別有效.它不但可以擴增能著色的活菌，還可以擴增已死亡的，但DNA尚未降解的死菌，從而確定這樣的病灶是惡性還是良性.在許多情況下，TB可以導致腦膜炎、胸膜炎、腹膜炎等.塗片法盡管在診斷上具有直接、簡便的優點，但敏感性差就局限了它的診斷范圍和實用價值.PCR檢測這類標本，可以說極其有效.其極高的特異性和敏感性可以很容易地確定TB性腦膜炎及TB性胸腹水.另外，對於腎結核、泌尿生殖系統結核的診斷，PCR都可以予以完成.

4.抗癆治療的評價:對於抗癆治療效果的評價，以前的方法顯得軟弱無力.而PCR法則可以通過定期檢測，採用定量PCR法確切地評價抗癆葯物的療效及殘存菌的數量和活性度.在體內一般情況下，細菌死後，其蛋白系統很快崩潰，而DNA則能相對較長時間地保存下來.這些DNA在某種情況下又會復活.所以，細胞的死亡最可靠的評價指標是其基因DNA的完全降解.特別是在許多問題未搞清楚以前，更應該以DNA的降解來判定病原體的死與活.從理論上講，PCR擴增結果將是最可靠的療效評價指標.

5.修正以往所謂「正確」的觀念:致病菌與機體的防禦系統是一對激烈的矛盾，致病菌可以以任何方式和通路打擊人體的防禦系統，以便其生存和繁殖.在健康人群和周圍環境中都攜帶或存在有大量的TB，但何時何地才會造成機體致病呢?以往認為TB很少存在於外周血，這主要是因為外周血中查不到TB，或TB已被局限在肺組織中.但很難讓人相信的是，肺部血管極其豐富，淋巴組織和血管網共同構成人體的細胞外液貯存和交換的場所.所以，二者之間的交換是經常的.這種交換就包括能透過毛細血管壁的致病菌.當然，對於TB來講，大多數細菌將被機體的免疫器官禁固起來.但仍有不少「漏網之魚」，只是以前所用的方法敏感性及特異性均不夠.但在某些情況下，如情緒低落、過度勞累、感冒等情況下，機體防禦系統功能減弱，就會造成致病菌的攻擊發生疾病.所以PCR技術對於評估臨床療效、疫情的檢控、發病機理的探討均有十分重要的意義.

六、PCR在檢測TB中的注意事項

PCR如操作不嚴格會出現假陽性和假陰性結果.

發生假陽性最常見的原因是:樣品間的污染和擴增產物的污染.樣品間的交叉污染最易發生在樣品的處理過程之中.如大家共用一個加樣器、剪刀、位置等，因此在處理活檢標本時，用剪刀剪碎組織塊，每個標本用後，剪刀應在火上燒數分鍾，以徹底清除污染在剪刀上的DNA.對於液態標本的處理，盡可能在同一管子內處理.用具應為一次性的.要解決好擴增物的污染，最佳的方式是減少操作的時間，簡化操作手續並使用一次性離心管及接頭.因為擴增產物的量一般很高，易於污染實驗室任何地方.所以減少打開反應管的次數會降低假陽性的發生率.

❷ PCR檢測的具體步驟是什麼

具體步驟就是：
1，制備瓊脂糖凝膠，或者聚丙烯醯胺凝膠
2，取少量（大概5ul）PCR產物（確定是否加入上樣緩沖液），點樣到凝膠孔里，記得點合適的maker
3，接通電源，調好電壓（120V）,開始運行
3，等跑到大概2/3處，在紫外成像儀里查看條帶。
就是如此，關鍵看你設備是否齊全

❸ PCR產物直接測序的原理

原理：
是來至於雙脫氧鏈終止法——現在應用最多的核酸測序技術,由Sanger等1977年提出：
模板經過測序PCR反應後形成3'末端帶有熒游標記（早期用同位素標記）的相差一個鹼基的不同長度的產物,再根據每段DNA產物的電泳速度來檢測整段DNA的序列.
以上——手打——希望對你有幫助
優點：
一是操作易於標准化與自動化,因為它是一個單一的酶的反應過程,不依賴於生物體；
二是通過一次測序反應就能確定樣品中某個等位基因的順序,而PCR產物克隆後測序時,樣品順序要在測定了數個克隆片段之後才能確定.因為只有這樣,才能區別突變是基因組本來就有的,還是由於Tag聚合酶在PCR過程中錯誤摻入核苷酸引起的.

❹ PCR實驗方法步驟

PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面小編就向大家介紹PCR實驗方法步驟：

方法

• 1/4

  
  在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。

  10×PCR buffer

  5 μl dNTP mix （2mM）

  4 μl 引物1（10pM）

  2 μl 引物2（10pM）

  2 μl Taq酶 （2U/μl）

  1 μl DNA模板（50ng-1μg/μl）

  1 μl 加ddH2O至 50 μl

  視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
  

• 

❺ RT-PCR檢測方法的具體步驟

RT-PCR檢測方法的具體步驟如下：

（一）RNA提取
1、根據標本數量分裝RLT液：從Kit中取出RLT液，用1.5mL離心管分裝，每管500μL（在體系配製區操作）。
2、在生物安全櫃內將采樣液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培養物（雞胚尿囊液或細胞培養液）取100μL加入RLT液管中，充分混勻。 3、每管分別加入5μL β-巰基乙醇，混勻後依次加入600μL 70%的乙醇，充分混勻。
4、從Kit中取出帶濾柱的2mL收集管，打開包裝將其做好標記。取步驟（3）中的混合液600μL加入濾柱中，12000rpm，離心15s，棄收集管中的離心液。
5、濾柱仍放回收集管上，將步驟（3）剩餘的混合液全部吸入濾柱中，12000rpm，離心15s，棄離心液。
6、於濾柱中加入700μL Wash Buffer RW1液，12000rpm，離心15s。
7、從QIAGEN RNeasy Mini Kit中取一支幹凈的2mL收集管，將離心後的濾柱移到新的收集管上，於濾柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，12000rpm，離心15s。
8、棄收集管中的離心液，再於濾柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，13000~14000rpm，離心2min。
9、將濾柱移到一個干凈的1.5mL eppendorf管上，向濾柱中加入30~50μL的Rnase-free Water，室溫靜置1~3min。
10、12000rpm，離心1min，收集離心液即為提取的病毒RNA，立即做實驗或-20℃以下保存。
注意：Buffer RPE使用之間加44mL無水乙醇。
（二）反應體系配製
1、實驗設計： 檢測標本RNA
陰性對照：無菌水（標本RNA提取時，跟標本同時提取無菌水。） 陽性對照：已知病毒RNA

2、PCR反應體系配製（在體系配製區配反應液） 1）按下表加入試劑： PCR反應體系
對每一個建立的反應確定反應數（n=擬進行的PCR管數，包括陰性，陽性對）。考慮到陰性無模板對照，陽性對照，誤差，制備過量的反應混合物是必要的。具體如下：
（1）如果包括對照，樣品的數量（n）為1到14，那麼N=n+1；
（2）如果包括對照，樣品的數量（n）大於15，那麼N=n+2。
2）將上述反應液混勻，分裝到0.2mL PCR小管中，每管20μL，分別做好標記。

3）加RNA模板（在核酸提取區）
將上述分裝好的PCR小管分別加入模板。首先加入陰性對照管（5μL無菌水），然後分別加標本RNA（每管5μL），最後加入陽性對照RNA（每管5μL）。
3、RT-PCR反應
將上述加好模板的反應管混勻，短暫離心後放入PCR儀進行RT-PCR 擴增。

4、RT-PCR產物檢測
1）2.0％瓊脂糖凝膠制備：稱取2.0g Agarose，倒入耐熱玻璃瓶內，再加入電泳液（1×TBE）100mL，輕輕混勻後加熱，使Agarose完全熔化。待Agarose膠溫度降至50～60℃左右，加入核酸染料，輕輕混勻（不要產生氣泡）。待膠溫度降至50℃左右時，將其倒入制膠板，插好電泳梳子。待膠完全凝固（約30～60min）之後，將梳子拔出。
2）將制備好的電泳膠放入電泳槽（帶梳子孔的一端在陰極），倒入電泳液（1×TBE）浸過膠面即可。
3）PCR產物各取10μL，加入2μL上樣緩沖液（6×Loading Buffer），混勻後加入電泳膠孔內（先加Marker（DL－2000）5μL，然後依次加標本PCR產物，再加陰性對照，最後加陽性對照產物）。 4）電泳電壓100V，約30～40min後看結果。 5）將電泳膠放入凝膠成像系統觀察結果並照相。
5、結果判斷。

❻ 什麼是PCR檢測他的原理是什麼需要什麼材料

• 聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期發展起來的體外核酸擴增技術。它具有特異、敏感、產率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等突出優點；能在一個試管內將所要研究 的目的基因或某一DNA片段於數小時內擴增至十萬乃至百萬倍,使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發、一滴血、甚至一個細胞中擴增出足量的DNA供分析研 究和檢測鑒定。過去幾天幾星期才能做到的事情，用PCR幾小時便可完成。PCR技術是生物醫學領域中的一項革命性創舉和里程碑。

• PCR技術簡史

• PCR的最早設想 核酸研究已有100多年的歷史，本世紀60年代末、70年代初人們致力於研究基因的體外分離技術，Korana於1971年最早提出核酸體外擴增的設想：「經過DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，並不斷重復該過程便可克隆tRNA基因」。

• PCR的實現 1985年美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis等發明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應。其原理類似於DNA的體內復制，只是在試管中給 DNA的體外合成提供以致一種合適的條件---摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖體系，DNA變性、復性及延伸的溫度與時間。

• PCR的改進與完善 Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌DNA聚合酶I的 Klenow片段，其缺點是：①Klenow酶不耐高溫，90℃會變性失活，每次循環都要重新加。②引物鏈延伸反應在37℃下進行，容易發生模板和引物之 間的鹼基錯配，其PCR產物特異性較差，合成的DNA片段不均一。此種以Klenow酶催化的PCR技術雖較傳統的基因擴增具備許多突出的優點，但由於 Klenow酶不耐熱，在DNA模板進行熱變性時，會導致此酶鈍化，每加入一次酶只能完成一個擴增反應周期，給PCR技術操作程序添了不少困難。這使得 PCR技術在一段時間內沒能引起生物醫學界的足夠重視。1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶進行PCR，其擴增的DNA片段很均一，真實性也較高，只有所期望的一種DNA片段。但每循環一次，仍需加入新酶。1988年Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermus aquaticus) 中提取到一種耐熱DNA聚合酶。此酶具有以下特點：①耐高溫，在70℃下反應2h後其殘留活性大於原來的90%，在93℃下反應2h後其殘留活性是原來的 60%，在95℃下反應2h後其殘留活性是原來的40%。②在熱變性時不會被鈍化，不必在每次擴增反應後再加新酶。③大大提高了擴增片段特異性和擴增效 率，增加了擴增長度(2.0Kb)。由於提高了擴增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高。為與大腸桿菌多聚酶I Klenow片段區別，將此酶命名為Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的發現使PCR廣泛的被應用。

• PCR技術基本原理

• PCR技術的基本原理 類似於DNA的 天然復制過程，其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經加 熱至93℃左右一定時間後，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引 物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈後，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物的延伸：DNA模板--引物結合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按鹼基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈重復循環變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的「半保留復制鏈」，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需 2～4分鍾，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。到達平台期(Plateau)所需循環次數取決於樣品中模板的拷貝。

• PCR的反應動力學 PCR的三個反應步驟反復進行，使DNA擴增量呈指數上升。反應最終的DNA 擴增量可用Y＝(1＋X)n計算。Y代表DNA片段擴增後的拷貝數，X表示平(Y)均每次的擴增效率，n代表循環次數。平均擴增效率的理論值為100%， 但在實際反應中平均效率達不到理論值。反應初期，靶序列DNA片段的增加呈指數形式，隨著PCR產物的逐漸積累，被擴增的DNA片段不再呈指數增加，而進 入線性增長期或靜止期，即出現「停滯效應」，這種效應稱平台期數、PCR擴增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產物的竟爭等因素。大多數情 況下，平台期的到來是不可避免的。

• PCR擴增產物 可分為長產物片段和短產物片段兩部分。短產物片段的長度嚴格地限定在兩個引物鏈5』端之間，是需要擴增的特定片段。短產物片段和長產物片段是由於引物所 結合的模板不一樣而形成的，以一個原始模板為例，在第一個反應周期中，以兩條互補的DNA為模板，引物是從3』端開始延伸，其5』端是固定的，3』端則沒 有固定的止點，長短不一，這就是「長產物片段」。進入第二周期後，引物除與原始模板結合外，還要同新合成的鏈(即「長產物片段」)結合。引物在與新鏈結合 時，由於新鏈模板的5』端序列是固定的，這就等於這次延伸的片段3』端被固定了止點，保證了新片段的起點和止點都限定於引物擴增序列以內、形成長短一致的 「短產物片段」。不難看出「短產物片段」是按指數倍數增加，而「長產物片段」則以算術倍數增加，幾乎可以忽略不計， 這使得PCR的反應產物不需要再純化，就能保證足夠純DNA片段供分析與檢測用。

• PCR反應體系與反應條件

• 標準的PCR反應體系：

• 10×擴增緩沖液 10ul

• 4種dNTP混合物 各200umol/L

• 引物 各10～100pmol

• 模板DNA 0.1～2ug

• Taq DNA聚合酶 2.5u

• Mg2+ 1.5mmol/L

• 加雙或三蒸水至 100ul

• PCR反應五要素： 參加PCR反應的物質主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

• 引物： 引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR 產物的特異性取決於引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。

• 設計引物應遵循以下原則：

• ①引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右。

• ②引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。

• ③引物鹼基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

• ④避免引物內部出現二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3』端的互補，否則會形成引物二聚體，產生非特異的擴增條帶。

• ⑤引物3』端的鹼基，特別是最末及倒數第二個鹼基，應嚴格要求配對，以避免因末端鹼基不配對而導致PCR失敗。

• ⑥引物中有或能加上合適的酶切位點，被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處。

• ⑦引物的特異性：引物應與核酸序列資料庫的其它序列無明顯同源性。

• 引物量： 每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量產生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。

• 酶及其濃度 目前有兩種Taq DNA聚合酶供應， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應約需酶量2.5U(指總反應體積為100ul時)，濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產物量減少。

• dNTP的質量與濃度 dNTP的質量與濃度和PCR擴增效率有密切關系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學活性。dNTP溶液呈酸性，使用時應配成高濃度後，以1M NaOH或1M Tris。HCL的緩沖液將其PH調節到7.0～7.5，小量分裝， -20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。在PCR反應中，dNTP應為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配製)，如其中任何一種濃度不同於其它幾種時(偏高或偏低)，就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產物的產量。dNTP能與Mg2+結合，使游離的Mg2+濃度降低。

• 模板(靶基因)核酸 模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關鍵環節之一，傳統的DNA純化方法通常採用SDS和蛋白酶K來消化處理標本。 SDS的主要功能是： 溶解細胞膜上的脂類與蛋白質，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜，並解離細胞中的核蛋白，SDS 還能與蛋白質結合而沉澱；蛋白酶K能水解消化蛋白質，特別是與DNA結合的組蛋白，再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質和其它細胞組份，用乙醇或異丙醇沉澱 核酸。提取的核酸即可作為模板用於PCR反應。一般臨床檢測標本，可採用快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質使靶基因游離，直接 用於PCR擴增。RNA模板提取一般採用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。

• Mg2+濃度 Mg2+對PCR擴增的特異性和產量有顯著的影響，在一般的PCR反應中，各種dNTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應特異性降低，出現非特異擴增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應產物減少。

• PCR反應條件的選擇

• PCR反應條件為溫度、時間和循環次數。

• 溫度與時間的設置： 基於PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點。在標准反應中採用三溫度點法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40 ～60℃，引物退火並結合到靶序列上，然後快速升溫至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對於較短靶基因(長度為100～300bp時)可採用二溫度點法， 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般採用94℃變性，65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性)。

• ①變性溫度與時間：變性溫度低，解鏈不完全是導致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性，若低於93℃則 需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產物完全變性，就會導致PCR失敗。

• ②退火(復性)溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性後溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發生結合。由於模板DNA 比引物復雜得多，引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高於模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決於引物的長度、鹼基組成及其濃度，還有靶基序列的長 度。對於20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想。引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：

• Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)

• 復性溫度=Tm值-(5～10℃)

• 在Tm值允許范圍內， 選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合，提高PCR反應的特異性。復性時間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結合。

• ③延伸溫度與時間：Taq DNA聚合酶的生物學活性：

• 70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子

• 70℃ 60核苷酸/S/酶分子

• 55℃ 24核苷酸/S/酶分子

• 高於90℃時， DNA合成幾乎不能進行。

• PCR反應的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利於引物和模板的結合。PCR延伸反應的時間，可根據待擴增片段的長度而定，一般1Kb以內的DNA片段，延伸時間1min是足夠 的。3～4kb的靶序列需3～4min；擴增10Kb需延伸至15min。延伸進間過長會導致非特異性擴增帶的出現。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。

• 循環次數 循環次數決定PCR擴增程度。PCR循環次數主要取決於模板DNA的濃度。一般的循環次數選在30～40次之間，循環次數越多，非特異性產物的量亦隨之增多。

• PCR反應特點

• 特異性強 PCR反應的特異性決定因素為：

• ①引物與模板DNA特異正確的結合；

• ②鹼基配對原則；

• ③Taq DNA聚合酶合成反應的忠實性；

• ④靶基因的特異性與保守性。

• 其中引物與模板的正確結合是關鍵。引物與模板的結合及引物鏈的延伸是遵循鹼基配對原則的。聚合酶合成反應的忠實性及Taq DNA聚合酶耐高溫性，使反應中模板與引物的結合(復性)可以在較高的溫度下進行，結合的特異性大大增加，被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區，其特異性程度就更高。

• 靈敏度高 PCR產物的生成量是以指數方式增加的，能將皮克(pg=10-12g)量級的起始待測模板擴增到微克(ug=10-6g)水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位)；在細菌學中最小檢出率為3個細菌。

• 簡便、快速 PCR反應用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應液加好後，即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應，一般在2～4 小時完成擴增反應。擴增產物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。

• 對標本的純度要求低 不需要分離病毒或細菌及培養細胞，DNA 粗製品及總RNA均可作為擴增模板。可直接用臨床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發、細胞、活組織等粗製的DNA擴增檢測。 PCR擴增產物分析

• PCR產物是否為特異性擴增 ，其結果是否准確可靠，必須對其進行嚴格的分析與鑒定，才能得出正確的結論。PCR產物的分析，可依據研究對象和目的不同而採用不同的分析方法。

• 凝膠電泳分析：PCR產物電泳，EB溴乙錠染色紫外儀下觀察，初步判斷產物的特異性。PCR產物片段的大小應與預計的一致，特別是多重PCR，應用多對引物，其產物片斷都應符合預訐的大小，這是起碼條件。

• 瓊脂糖凝膠電泳： 通常應用1～2%的瓊脂糖凝膠，供檢測用。

• 聚丙烯醯胺凝膠電泳：6～10%聚丙烯醯胺凝膠電泳分離效果比瓊脂糖好，條帶比較集中，可用於科研及檢測分析。

• 酶切分析：根據PCR產物中限制性內切酶的位點，用相應的酶切、電泳分離後，獲得符合理論的片段，此法既能進行產物的鑒定，又能對靶基因分型，還能進行變異性研究。

• 分子雜交：分子雜交是檢測PCR產物特異性的有力證據，也是檢測PCR 產物鹼基突變的有效方法。

• Southern印跡雜交： 在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈(內部寡核苷酸)標記後做探針，與PCR產物雜交。此法既可作特異性鑒定，又可以提高檢測PCR產物的靈敏度，還可知其分子量及條帶形狀，主要用於科研。

• 斑點雜交： 將PCR產物點在硝酸纖維素膜或尼膜薄膜上，再用內部寡核苷酸探針雜交，觀察有無著色斑點，主要用於PCR產物特異性鑒定及變異分析。

• 
  

❼ PCR產物的檢測方法有哪些都有什麼原理

1.瓊脂糖凝膠電泳 同時點分子量marker,根據marker條帶判斷產物分子量大小,從而大致判斷是不是你要的
2.酶切 已知你產物的序列,看上面有什麼酶切位點,用一個酶或者兩個酶切斷,看與理論預測的條帶數目和大小是否一致.一般檢測有以上兩步就行了,如果需要知道確切的需要進行3
3.測序 連接到pMD-18t 載體上,轉到大腸桿菌中.拿到公司去測序,測序結果通過gene bank比對看與哪個基因一致,這種方法最准確
4.表達 pcr產物連到真核或者原核表達載體上,適宜條件表達出來以後的蛋白做質譜分析,看與理論產物表達的蛋白是否有一致的片段

❽ 普通PCR、原位PCR、反向PCR和反轉錄PCR的 基本原理和操作步驟（二）

在科學研究中，每一項新技術的創立都會帶來一系列新的研究成果問世，從而推動著各學科的發展。縱觀形態研究領域，50年代電子顯微鏡引入形態學觀察領域，帶來了從細胞水平到亞細胞水平的深入研究；60-70年代，免疫組織化學與免疫細胞化學技術的廣泛應用，又將觀察的水平由亞細胞結構推向了蛋白質分子水平，使細胞內眾多的活性物質得以進行細胞或亞細胞水平的定位，對醫學生物學的發展無疑產生了深刻的影響。70年代，分子生物學技術在形態學中的廣泛應用，隨著原位雜交技術的出現，使組織細胞內特定的DNA或RNA序列能夠被定位，將蛋白質水平又提高到基因水平即核酸分子的觀察和定位，從而使人類對許多生命現象在基因水平上的認識得以深化；80年代，分子生物學領域中一項具有強大生命力的技術PCR——多聚酶鏈反應技術問世了，很快地就被引入形態學觀察的領域，使細胞內低拷貝或單拷貝的特定DNA或RNA得以進行定位及觀察。這一技術的問世，必將帶來更多的研究成果，使形態學的研究又向前邁出一大步。

1基本原理

原位PCR技術的基本原理，就是將PCR技術的高效擴增與原位雜交的細胞定位結合起來，從而在組織細胞原位檢測單拷貝或低拷貝的特定的DNA或RNA序列。

PCR技術是在DNA聚合酶的作用下，經過模板的變性、退火和引物延伸三種循環，將引物引導下的特異性靶序列迅速地進行擴增，經過擴增的靶序列（一般能擴增106倍），很容易在凝膠電泳或Southern印記雜交中顯示出來，因此，PCR技術具有靈敏度高，特異性強的優勢，隨著熱循環自動化的提高與穩定也使得PCR技術的操作簡便易行。但是，PCR技術是在液相中進行的，在擴增前，需將細胞破壞，從中提取核酸作為模板，因此很難將PCR的結果與組織細胞的形態結構聯系起來，同時，也很難判斷含特異性靶序列的細胞類型。

原位PCR技術成功地將PCR技術和原位雜交技術結合起來，保持了兩項技術的優勢又彌補了各自的不足。原位PCR技術的待檢標本一般先經化學固定，以保持組織細胞的良好形態結構。細胞膜和核膜均具有一定的通透性，當進行PCR擴增時，各種成分，如引物，DNA聚合酶，核苷酸等均可進入細胞內或細胞核內，以固定在細胞內或細胞核內的RNA或DNA為模板，於原位進行擴增。擴增的產物一般分子較大，或互相交織，不易穿過細胞膜或在膜內外彌散，從而被保留在原位。這樣原有的細胞內單拷貝或低拷貝的特定DNA或RNA序列在原位以呈指數極擴增，擴增的產物就很容易被原位雜交技術檢查。

2 基本類型

根據在擴增反應中所用的三磷酸核苷原料或引物是否標記，原位PCR技術可分為直接法和間接法兩大類，此外，還有反轉錄原位PCR技術等。

2.1直接法原位PCR技術

直接法原位PCR技術是將擴增的產物直接攜帶標記分子，即使用標記的三磷酸腺苷或引物片斷。當標本進行PCR擴增時，標記的分子就摻入到擴增的產物中，顯示標記物，就能將特定的DNA或RNA在標本（原位）中顯現出來。

常用的標記物有放射性同位素35S，生物素和地高辛，用放射性自顯影的方法或用親和組織化學及免疫組織化學的方法去顯示標記物所在位置。

直接法原位PCR技術的優點是操作簡便，流程短，省時。缺點是特異性較差，易出現假陽性，擴增效率也較低，特別是在石蠟切片上，上述缺點更為突出。因為在製片過程中，無論是固定，脫水還是包埋，都會導致DNA的損害，而受損的DNA可利用反應體系中的標記三磷酸核苷進行修復，這樣標記物就會摻入到DNA的非靶序列中，造成假陽性。若用標記引物的方法進行直接法原位PCR，其擴增的效率比不標記更低。

2.2 間接法原位PCR技術

間接法原位PCR技術師現在細胞內進行特定DNA或RNA擴增，再用標記的探針進行原位雜交，明顯提高了特異性，是目前應用最為廣泛的原位PCR技術。

間接法原位PCR與直接法不同的是，反應體系與常規PCR相同，所用的引物或三磷酸腺苷均不帶任何標記物。即實現先擴增的目的，然後用原位雜交技術去檢測細胞內已擴增的特定的DNA產物，因此，實際上是將PCR技術和原位雜交技術結合起來的一種新技術，故又稱之為PCR原位雜交(PCR in situ hybridization , PISH)。

間接法PCR技術的優點是特異性較高，擴增效率也較高。缺點是操作步驟較直接法繁瑣。

2.3 原位反轉錄PCR技術

原位反轉錄PCR(in situ reverse transcription PCR, In Situ RT-PCR)是將液相的RT-PCR技術應用到組織細胞標本中的一種新技術，與RT-PCR（液相）不同點在於，進行原位反轉錄PCR反應之前，組織標本要先用DNA酶處理，以破壞組織中的DNA酶，這樣才能保證擴增的模板是從mRNA反轉錄合成的cDNA，而不是細胞中原有的DNA。其它基本步驟與液相的RT-PCR相似。

3 基本步驟

原位PCR技術的基本步驟包括標本的制備。原位擴增（PCR）及原位檢測等基本環節，現分述如下（重點以石蠟切片為例）。

3.1 標本的制備

原位PCR技術可應用於細胞懸液、細胞塗片、冰凍切片以及石蠟切片。相比較而言，以懸浮的完整細胞做原位PCR效果最好，石蠟切片效果最差。隨著技術方面的一些問題被解決，近年也有從石蠟切片中得到滿意的PCR效率的報道。效果不好的原因是多方面的，如：玻片上做PCR，熱傳導較差，熱對流不均勻，TaqDNA酶被玻璃片吸附等，更為主要的原因，可能是標本經製片後，細胞缺乏完整的胞漿或核膜，擴增產物易發生彌漫而導致擴增的產物在原位不易保留。絕大多數的病理標本都是以福爾馬林固定，石蠟包埋的形式保存的，若能很好地解決石蠟切片原位PCR的有關技術問題，意義顯然是十分重大的。

組織細胞的固定 一般認為組織細胞以10%的緩沖福爾馬林或4%的多聚甲醛固定後進行原位PCR效果較好。固定的時間一般不宜過長，視組織的大小，一般以4℃4-6小時為宜。

切片的厚度 一般而言，切片若厚一些，原位PCR的效果也較好一些，因為切片越厚，靶DNA的含量也就越多，同時膜結構也較多，防止擴增產物彌散的作用也越明顯。但厚切片細胞重疊多，形態學觀察的效果就差了，解析度也將下降。

玻片的處理 為防止石蠟切片在PCR和原位雜交過程中脫落，在玻片應作防脫片處理，常用的方法是塗以多聚賴氨酸或用硅烷化處理，一般能防止組織脫落。

蛋白酶的消化作用 在進行原位擴增之前，組織標本需經蛋白酶處理。經蛋白酶消化的組織細胞，可增加其通透性，充分允許反應體系中的各成分進入細胞內，並能很好的暴露靶序列，以利於擴增。常用的蛋白酶有蛋白酶K，胰蛋白酶或胃蛋白酶。蛋白酶消化的程度就要根據組織固定的程度進行調整。蛋白酶消化後，要注意加熱以滅活酶的活性或通過充分的洗滌將酶完全去除，因為只要有少量的殘留酶存在，都將對隨後進行的PCR反應體系的數量TaqDNA酶產生毀滅性的影響。

蛋白酶消化處理組織細胞可提高通透性，有利於後續進行的各反應成分進入細胞內或核內，但同時也使得擴增產物的彌散機會增多，有可能帶來假陽性或假陰性的結果。

原位擴增（PCR）
原位擴增即在組織細胞標本上進行PCR反應，其基本原理與液相PCR完全相同。

引物 PCR所用的引物一般為15-30bp為宜，擴增的片斷為100-1000bp左右。原位PCR宜用較短的引物。從石蠟切片中提取的DNA很少超過400bp，RNA很少超過200bp，較長序列的擴增易引起引物與模板的錯配而導致非特異性反應的出現。

反應體系 原位PCR的反應體系與常規的液相PCR基本相同，由於是在經過固定的組織切片上進行，為獲得較好的擴增效果，有人主張反應體系中的引物，TaqDNA聚合酶以及Mg2+的濃度均應高於液相的PCR反應體系。在反應體系中要加入牛血清白蛋白（BSA）,以防止TaqDNA聚合酶與玻片的結合而降低了擴增效率。

熱循環 原位PCR的熱循環可在專門的熱循環儀上進行，操作簡便。也可在一般的PCR熱循環儀上進行，通常在樣品台上覆蓋一層鋁箔，製成平台，樣品台上的空間用礦物油或水充填，將載玻片至於平台上，即可進行熱循環的步驟。

為了保證進行充分的擴增，原位PCR熱循環中每一步驟的時間可比常規PCR略長些，另外，也可採用熱啟動（hot start）的方法，即玻片加熱到80-94℃時，再立即加入TaqDNA聚合酶。

為了保證反應體系在熱循環過程不過多丟失，可用清亮的指甲油，礦物油或PAP筆把蓋片四周封閉起來。

洗滌 原位擴增結束後，標本應清洗，以除去彌散到細胞外的擴增產物。洗滌不充分，會導致擴增產物在檢測時顯現，造成背景過深或假陽性結果的出現。但是，洗滌過度，也會造成細胞內擴增的產物被洗脫，是陽性信號減弱或丟失。

有作者在擴增後用4%多聚甲醛2小時或2%戊二醛5分鍾進行後固定，以使擴增的產物在檢測時能很好地保留在細胞內，提高檢測的敏感性和特異性。

原位檢測 原位PCR的擴增產物檢測方法，取決於原位PCR的設計方案，直接法則根據標記分子的性質對擴增產物直接進行原位檢測。間接法則需用原位雜交的方法進行檢測。

4 原位PCR技術的應用

原位PCR技術的突出優勢，就是能在組織細胞原位檢測出拷貝數較低的特異性基因序列。按照待測基因的性質，可將原位PCR的應用分為檢測外源性基因和內源性基因兩方面。

4.1用於外源性基因的檢測

4.1.1病毒基因的檢測

感染病毒的細胞常無較好的檢測手段，但當原位PCR技術應用後，使這一極為困難的問題有望解決。

對HIV、HPV、HSV、HBV、HCV等多種病毒的檢測，使我們能夠成功等觀察到這些病毒在艾滋病、生殖系統腫瘤、肝炎及肝癌中的作用，能夠及時發現受感染的人群。

4.1.2細菌基因的檢測

最突出的應用是在結核桿菌的檢測上，當結核病變不夠典型時，經過特殊染色的方法很難在鏡下找到結核桿菌，而應用原位PCR技術可幫助明確診斷，當結核桿菌很少時仍能在鏡下被很容易地找出來。

4.1.3導入基因的檢測

在轉基因動物的研究中，是否導入了基因，在接受基因治療的患者體內，是否接受了導入的基因，均可用原位PCR技術來證實。因此，原位PCR技術成為重要的檢測手段。

4.2 用於內源性基因的檢測

4.2.1異常基因的檢測

機體內基因的突變、重排、也可用原位PCR技術進行檢測，原癌基因，抑癌基因的突變，惡性淋巴瘤免疫球蛋白重鏈基因的重排，對腫瘤的研究和診斷無一均提供了廣闊的應用前景。

4.2.2固有基因的檢測

對於機體細胞內只有單個或幾個拷貝的低表達固有基因，原位雜交技術因基因拷貝數太少而無能為力，液相PCR雖可進行擴增檢測出來，但不能確定含有該基因的細胞類型，原位PCR技術則彌補了上述兩種技術的不足，使得我們能夠對人類各種基因進行檢測，而完成人類基因圖的繪制。

❾ PCR產物的檢測方法有哪些都有什麼原理

1.瓊脂糖凝膠電泳
同時點分子量marker，根據marker條帶判斷產物分子量大小，從而大致判斷是不是你要的
2.酶切
已知你產物的序列，看上面有什麼酶切位點，用一個酶或者兩個酶切斷，看與理論預測的條帶數目和大小是否一致。一般檢測有以上兩步就行了，如果需要知道確切的需要進行3
3.測序
連接到pMD-18t
載體上，轉到大腸桿菌中。拿到公司去測序，測序結果通過gene
bank比對看與哪個基因一致，這種方法最准確
4.表達
pcr產物連到真核或者原核表達載體上，適宜條件表達出來以後的蛋白做質譜分析，看與理論產物表達的蛋白是否有一致的片段

❿ pcr的各種試劑怎樣檢測是否合格

PCR產物的檢測方法： 瓊脂糖凝膠電泳 這是實驗室最常用的方法，簡便易行，只需少量DNA即可進行實驗。其原理是不同大小的DNA分子通過瓊脂糖凝膠時，由於泳動速度不同而被分離，經溴化乙錠（EB）染色