A. 分子生物學 蛋白質磷酸化分析技術
在所 有 的 翻譯後修飾中，可逆的磷酸化，幾乎調節著生命活動的整個過程，包括細胞的增殖、發育和分化，神
經活動，肌肉收縮，新陳代謝，腫瘤發生等。據統計，哺乳動物細胞內有三分之一以上的蛋白質可以被磷酸化川，蛋白質的可逆磷酸化使得蛋白質組學研究更為復雜。 真核 生 物 細胞蛋白質中主要的磷酸化氨基酸為
絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸，其比例大概為1800:200:11 21。大多數磷酸化蛋白質都有多個磷酸化位點，並且其磷酸化位點是可變的。因此，一種蛋白可能有多種磷酸化形式。雖然對磷酸化蛋白質組學分析已有很大進步，但依然存在多個難點19待解決包括磷酸化蛋白和膚段的富集，可逆性磷酸化位點的鑒定以及磷酸化位點的定量等。1 磷酸化蛋白的識別
磷 酸 化 蛋白在細胞中含量甚微。在質譜分析中，磷酸化肚段的信號往往被非磷酸化膚段的信號所抑制。因而磷酸化蛋白和膚段的富集在提高磷酸化 位點的檢測中佔有非常重要的地位。
1. 1 磷酸化蛋白的富集
過 去 關 於 磷 酸化蛋白富集的方法主要應用針對特 定蛋白的抗體進行免疫沉澱。但該法需要首先對
蛋 白有所了解，且不適合大規模研究。雖然，近來關 於針對磷酸化基團的抗體已經出現，但只有抗磷
酸化酪氨酸的抗體效果較好[41。而抗磷酸化絲氨酸 、蘇氨酸的抗體特異性均不強。近來，商品化的
磷 酸化蛋白提純和富集試劑盒，在酵母中已成功應用，但在其它組織的應用還未見報道川。
1.2 磷酸化蛋白膠染色
檢測 蛋 白 混合物中磷酸化蛋白的經典方法是先
行電泳分離蛋白質，然後用放射自顯影術或針對磷
酸化蛋白的免疫印記方法來檢測。近來，Pro-Q Diaround
磷酸化蛋白膠染色是一項重大的技術突
。破b]。這種特殊的熒光染料可以直接在膠內檢測
針對磷酸化絲氨酸、蘇氮酸和酪氨酸的蛋白，而不
需特殊的抗體或同位素標記。這種染色適用於
SDS-聚丙烯酸胺凝膠和二維聚丙烯酞胺凝膠，並旦
這種染色和後續的質譜鑒定是完全兼容的。SYPRO
Ruby染色是針對總蛋白的染色。通過每條泳帶或
每個點的Pro-Q Diamond染色和SYPRO Ruby染色
的比值，可以了解磷酸化蛋白在總蛋白中的比值。
兩種蛋白染色結合使用，可以將高豐度蛋白的低磷
酸化狀態與低豐度蛋白的高磷酸化狀態區分開
2 磷酸化膚段的富集
磷酸 化 位 點的檢測往往不是直接從蛋白水平檢
測，而是從膚段水平檢測。但由於L述提到的抑制
現象的存在，在分析之前應首先對磷酸化膚段進行
富集。
2.1 固定金屬親和色譜
目前 使 用 最廣泛的分離和富集磷酸化肚段的方
法是固定金屬親合色譜(immobilized metal affinity
chromatography, IMAC)。此方法中，鍵合在鰲合
底物上的金屬離子(如Fe3. , Gas. , Cue'等)選
擇性地與磷酸化臉中的磷酸基團結合，在高pH值
或磷酸鹽緩沖液中磷酸化膚可以釋放出來。洗脫下
來的溶液經脫鹽處理後可直接用於質譜分析。
IMAC通常可富集到磷酸化的酪氨酸、絲氮酸和蘇
氨酸殘基。但這種方法的局限性在於:可熊會丟失
掉一些低豐度的沒有結合到IMAC柱上的磷酸化膚
段;具有多磷酸化位點的膚由於其較強的親和力很
難被洗脫下來;某些酸性基團(如天冬氨酸和谷氨
酸)、電子供體文如組氨酸)也會結合到柱上·，造
成非磷酸化膚的污染。所以用IMAC方法富集磷酸
化膚的效果如何，絕大部分依賴於所選擇的金屬離
子、填充柱的材料、及洗脫的程序。最近，Ficarro
等[C1在IMAC富集以前，將膚的酸性殘基進行酷化
處理，使其特異性大大提高，預期對大范圍磷酸化
分析具有廣闊的前景。
2.2 磷酸化肚段的化學修飾
近來 ， O da等[1-1將膚或蛋白混合物置於鹼性硫
代二乙醇溶液中，通過P2消除從磷酸化絲氨酸或
蘇氨酸中去掉磷酸基團H3P0 ,，形成的雙鍵受到硫
代二乙醇的作用，琉基取代磷酸根。生物素與琉基
相連，被標記的膚或蛋白質上樣於固定有親和素的
層析柱，通過生物素與親和素的高親和力作用而達
到磷酸化膚或蛋白質富集的目的。這一方法的主要
缺點在於它不能富集酪氨酸磷酸化的蛋白質和膚。
Zhou等I〕用另外一種方法修飾磷酸化骯，用碳二
亞胺濃縮反應將半朧氨酸加在磷酸鹽部分，修飾過
的膚段以共價鍵與碘乙酞胺樹脂結合，酸洗滌釋
放。此方法既可用於富集磷酸化酪氨酸也可用於富
集磷酸化絲氨酸和磷酸化蘇氨酸，但需要許多步化
學反應和柱純化過程。
B. 如何檢測蛋白是否發生磷酸化
有磷酸化的抗體，
磷酸化抗體可以識別蛋白質的磷酸化或者非磷酸化形式，而且可以在避免放射污染的情況下，對磷酸化蛋白進行定性和定量分析，因此特異性磷酸化抗體是研究蛋白質磷酸化的重要工具。
C. 如何檢測蛋白磷酸化表達大神們幫幫忙
有很多種方法，以下列舉幾種： 1，蛋白磷酸酶活力檢測 （kinase activity assay） 2，利用專一的磷酸根抗體 （phospho-specific antibody） 3，西方墨點法或蛋白質印漬法 （Western blot） 4，酶聯免疫吸附實驗 （ELISA） 5，胞內流式細胞術（Introcellular flow cytometry） 6，質譜分析 （mass spectrometry）
D. 檢測磷酸化PI3K水平到底能用western 么
檢測PI3K信號通路的激活程度，一般都是western Blot或者免疫組化的方法，檢測anti-pAkt（Ser473）或者anti-pAkt （Thr308），這兩個磷酸化位點都行，都能說明問題，你要是經費充足的話，可以兩個都做。 至於你說的「還有，需要anti-Akt進行對照 嗎？」，怎麼還進行對照？是這樣：Akt磷酸化以後才有活性，所以你要是經費有限，可以只檢測pAkt的水平，這樣也能說明問題，也能發文章。但是要是想 把實驗做得完善的話，還是應該加上Akt的總體蛋白水平。大部分文章還是把總蛋白和磷酸化蛋白都來檢測的，這樣比較完善。 本回答由電腦中國絡分類達人 郭強推薦
E. 檢測一種蛋白的磷酸化水平，用什麼細胞裂解緩沖液
其主要成份為SDS有含DTT的，也有含巰基還原劑的，看你個人需求。
4×蛋白上樣緩沖液（含巰基還原劑）適用於SDS-PAGE(SDS變性聚丙烯醯胺凝膠電泳)時作蛋白質上樣用，溴酚藍。其主要成份為SDS，DTT，β-巰基乙醇，溴酚藍，緩沖鹽溶液等。
4×蛋白上樣緩沖液（含DTT）適用於SDS-PAGE(SDS-變性聚丙烯醯胺凝膠電泳)時作蛋白質上樣用
F. 蛋白質磷酸化位點怎麼確定
鑒定了磷酸化肽後,還要進一步確定磷酸化肽中修飾了磷酸化位點的哪個殘基.用於確定磷酸化肽中磷酸化位點的質譜方法基於兩種不同原理,第一種方法取決於磷酸酯鍵的化學穩定性,如在ESI質譜儀的碰撞室或離子源中,或在MALDI-MS的PSD過程中.磷酸化肽可通過磷酸酯鍵斷裂產生的碎片離子鑒定.第二種方法基於肽段增加的磷酸酯基團的質量數.假如蛋白是已知的,可通過質量數來確定肽段.在某些情況下,肽段只含有一個絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基,則很輕易找到磷酸化位點,但在大多數情況下肽段含有很多個絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基,則確定磷酸化位點發生困難.
G. 如何用western來檢測基因的磷酸化水平
western一般是用來檢測蛋白質的 蛋白質的磷酸化水平在western上可以通過分子量來區分 有時也可以用只識別磷酸化蛋白的抗體來區分
H. 如何用western來檢測基因的磷酸化水平
應該是蛋白質的磷酸化水平吧。用特異性識別磷酸化位點的抗體來做western blot，再用普通的不識別磷酸化位點的抗體做一遍，比較一下強度比值即可。但很多磷酸化位點的抗體不好買或者識別效果不好，還有磷酸化水平很低，難以檢測到。這時可能需要先用TiO2等方法富集磷酸化蛋白，再按上面的方法用兩種抗體來做western blot。
I. 如何查看抗體是磷酸化還是非磷酸化
磷酸化和非磷酸化的抗體主要區別有：
1.磷酸化抗體的檢測的是出於活性狀態（磷酸化）的蛋白。
2.磷酸化抗體只針對磷酸化位點設計，是一種位點特異性的多抗，這到有些單抗的特性。3.普通抗體的合成（多抗）：原核表達蛋白-〉純化-〉免疫動物-〉收獲抗體。
4.磷酸化抗體合成：人工合成含磷酸化位點的多肽-〉人工體外磷酸化-〉鏈接半抗原-〉免疫動物-〉收獲抗體。
5.磷酸化的蛋白很大部分是轉錄相關因子。因此使用磷酸化抗體和普通抗體。檢測同一個蛋白，原位檢測可能具有不同的細胞定位。轉錄因子磷酸化後由細胞質進入細胞核。
6.一般而言，磷酸化蛋白的實驗結果與分子功能更直接相關。
非磷酸化抗體是測該蛋白的含量，不能知道其活性狀態，磷酸化抗體是測該蛋白的磷酸化水平如何，側重於了解該蛋白的一種活性狀態。
磷酸化抗體主要是針對磷酸化位點制備的,檢測該蛋白在細胞受到刺激時該蛋白的變化情況(磷酸化水平增強還是減弱)。
非磷酸化抗體(主要針對非磷酸化位點的肽段制備的)主要檢測組織或細胞中該蛋白的表達情況,組織分布或細胞中定位,同時可以作為磷酸化水平變化的內參等.。
J. 磷酸化蛋白的轉錄情況能用PCR檢測嗎
首先，磷酸化形式的蛋白屬於蛋白質，蛋白質不能用pcr檢測，pcr只能檢測dna；其次，蛋白需要用wb檢測，磷酸化蛋白有專用的wb檢測方法。