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酶內雜質可採用的檢測方法

發布時間:2022-09-23 07:30:08

1. 酶的分離和純化方法是什麼

酶的分離純化一般包括三個基本步驟:即抽提、純化、結晶或制劑。

首先將所需的酶從原料中引入溶液,此時不可避免地夾帶著一些雜質,然後再將此酶從溶液中選擇性地分離出來,或者從此溶液中選擇性地除去雜質,然後製成純化的酶制劑。

酶分離純化的最終目的是獲得單一純凈的酶,因此,容許在不破壞「目的酶」的限度內,使用各種手段;酶與底物和抑制劑的結合常使其理化性質和穩定性發生改變,這種特性已被用於酶的分離純化。

由於酶及其來源的多樣性及與之共存的高分子物質的復雜性,目前還很難找到一種通用的方法以適用於一切酶的純化。為了使一種酶達到高度純化,往往需要多種方法協同作用,通過酶活性的跟蹤檢測確定最佳流程。

(1)酶內雜質可採用的檢測方法擴展閱讀:

酶的本性是蛋白質,凡可用於蛋白質分離純化的方法都同樣適用於酶,但酶易失活,故分離純化需在低溫(4℃)、溫和pH(4<pH>10)等條件下進行。

與蛋白質類似,酶易在溶液表面或界面處形成薄膜而變性,因此操作中應盡量減少泡沫形成,此外重金屬易使酶失效,有機溶劑能使酶變性,微生物污染以及蛋白水解酶的存在能使酶分解破壞。

在進行菌種鑒定時,所用的微生物一般均要求為純的培養物。得到純培養的過程稱是分離純化。

2. 酶活力測定的方式方法有哪些

測定酶活力,可用物理法,化學法或酶分析法等方法。常用的方法有:第一,在適當的條件下,把酶和底物混合,測定生成一定量產物所需的時間,此即終點法。第二,將酶和底物混合後隔一定時間,間斷地或連續地測定反應的連續變化,如吸收度的增加或減少。
第三,將酶與底物混合後,讓其反應一定時間,然後停止反應,定量測定底物減少或產物生成的量。後兩種方法稱為動力學法或反應速率法:按取樣及檢測的方式可稱為取樣測定法或連續測定法。
(1)定時法:(兩點法)

通過測定酶反應開始後某一時間段內(t1到t2)產物或底物濃度的總變化量來求取酶反應初速度的方法。其中t1往往取反應開始的時間。

酶與底物在一定溫度下作用一段固定的時間,通過加入強酸、強鹼、蛋白醫學教育網整理沉澱劑等,使反應完全停止(也叫中止反應法)。加入試劑進入化學反應呈色測出底物和產物的變化。

該法最基本的一點是停止反應後才測定底物或物的變化。

優點:簡單易行,對試劑要求不高。

缺點:難保證測定結果的真實性。

難以確定反應時間段酶促反應是否處於線性期。隨著保溫時間的延續,酶變性失活加速。

(2)連續監測法:

又稱為動力學法或速率法、連續反應法。

在酶反應過程中,用儀器監測某一反應產物或底物濃度隨時間的變化所發生的改變,通過計算求出酶反應初速度。

連續監測法根據連續測得的數據,可選擇線性期的底物或產物變化速率用於計算酶活力。

因此連續監測法測定酶活性比定時法更准確。

實際工作中,採用工具酶的酶偶聯法已經成為醫學教育網整理應用最廣、最頻繁測酶活性濃度的方法。

(3)平衡法:

通過測定酶反應開始至反應達到平衡時產物或底物濃度總變化量來求出酶活力的方法,又叫終點法。

3. 酶聯免疫吸附測定的方法類型和操作步驟

ELISA可用於測定抗原,也可用於測定抗體。該法適於測定細胞培養上清、血清、血漿及組織液中的樣本,干擾小可以測到每毫升納克水平的細胞因子(或受體)的水平。在這種測定方法中有3種必要的試劑:①固相的抗原或抗體,②酶標記的抗原或抗體,③酶作用的底物。根據試劑的來源和標本的性狀以及檢測的具備條件,可設計出各種不同類型的檢測方法。 雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法,操作步驟如下:
(1)將特異性抗體與固相載體連接,形成固相抗體:洗滌除去未結合的抗體及雜質。
(2)用脫脂奶粉或BSA進行封閉。洗滌除去多餘的脫脂奶粉或BSA。
(3)加受檢標本:使之與固相抗體接觸反應一段時間,讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結合,形成固相抗原復合物。洗滌除去其他未結合的物質。
(4)加酶標抗體:使固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質的量正相關。
(5)加底物:夾心式復合物中的酶催化底物成為有色產物。根據顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量。
根據同樣原理,將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標抗原結合物,即可用雙抗原夾心法測定標本中的抗體。 在雙抗體夾心法測定抗原時,如應用針對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標抗體,則在測定時可使標本的加入和酶標抗體的加入兩步並作一步(圖15-5)。這種雙位點一步不但簡化了操作,縮短了反應時間,如應用高親和力的單克隆抗體,測定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應用使測定抗原的ELISA提高到新水平。
在一步法測定中,應注意鉤狀效應(hookeffect),類同於沉澱反應中抗原過剩的後帶現象。當標本中待測抗原濃度相當高時,過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合,而不再形成夾心復合物,所得結果將低於實際含量。鉤狀效應嚴重時甚至可出現假陰性結果。 間接法是檢測抗體最常用的方法,其原理為利用酶標記的抗抗體以檢測已與固相結合的受檢抗體,故稱為間接法。操作步驟如下:
(1)將特異性抗原與固相載體連接,形成固相抗原:洗滌除去未結合的抗原及雜質。
(2)加稀釋的受檢血清:其中的特異抗體與抗原結合,形成固相抗原抗體復合物。經洗滌後,固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及血清中的雜質由於不能與固相抗原結合,在洗滌過程中被洗去。
(3)加酶標抗抗體:與固相復合物中的抗體結合,從而使該抗體間接地標記上酶。洗滌後,固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。例如欲測人對某種疾病的抗體,可用酶標羊抗人IgG抗體。
(4)加底物顯色:顏色深度代表標本中受檢抗體的量。
本法只要更換不同的固相抗原,可以用一種酶標抗抗體檢測各種與抗原相應的抗體。 競爭法可用於測定抗原,也可用於測定抗體。以測定抗原為例,受檢抗原和酶標抗原競爭與固相抗體結合,因此結合於固相的酶標抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下:
(1)將特異抗體與固相載體連接,形成固相抗體。洗滌。
(2)待測管中加受檢標本和一定量酶標抗原的混合溶液,使之與固相抗體反應。如受檢標本中無抗原,則酶標抗原能順利地與固相抗體結合。如受檢標本中含有抗原,則與酶標抗原以同樣的機會與固相抗體結合,競爭性地佔去了酶標抗原與固相載體結合的機會,使酶標抗原與固相載體的結合量減少。參考管中只加酶標抗原,保溫後,酶標抗原與固相抗體的結合可達最充分的量。洗滌。 (3)加底物顯色:參考管中由於結合的酶標抗原最多,故顏色最深。參考管顏色深度與待測管顏色深度之差,代表受檢標本抗原的量。待測管顏色越淡,表示標本中抗原含量越多。 血清中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時存在,後者會干擾IgM抗體的測定。因此測定IgM抗本多用捕獲法,先將所有血清IgM(包括異性IgM和非特異性IgM)固定在固相上,在去除IgG後再測定特異性IgM。操作步驟如下:
(1)將抗人IgM抗體連接在固相載體上,形成固相抗人IgM。洗滌。
(2)加入稀釋的血清標本:保溫反應後血清中的IgM抗體被固相抗體捕獲。洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質成分。
(3)加入特異性抗原試劑:它只與固相上的特異性IgM結合。洗滌。
(4)加入針對特異性的酶標抗體:使之與結合在固相上的抗原反應結合。洗滌。
(5)加底物顯色:如有顏色顯示,則表示血清標本中的特異性IgM抗體存在,是為陽性反應。 親和素是一種糖蛋白,可由蛋清中提取。分子量60kD,每個分子由4個亞基組成,可以和4個生物素分子親密結合。現在使用更多的是從鏈黴菌中提取的鏈霉和素(strepavidin)。生物素(biotin)又稱維生素H,分子量244.31,存在於蛋黃中。用化學方法製成的衍生物,生物素-羥基琥珀亞胺酯(biotin-hydroxysuccinimide,BNHS)可與蛋白質、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產物。親和素與生物素的結合,雖不屬免疫反應,但特異性強,親和力大,兩者一經結合就極為穩定。由於1個親和素分子有4個生物素分子的結合位置,可以連接更多的生物素化的分子,形成一種類似晶格的復合體。因此把親和素和生物素與ELISA偶聯起來,就可大提高ELISA的敏感度。
親和素-生物素系統在ELISA中的應用有多種形式,可用於間接包被,亦可用於終反應放大。可以在固相上先預包被親和素,原用吸附法包被固相的抗體或抗原與生物素結合,通過親和素-生物素反應而使生物素化的抗體或抗在相化。這種包被法不僅可增加吸附的抗體或抗原量,而且使其結合點充分暴露。另外,在常規ELISA中的酶標抗體也可用生物素化的抗體替代,然後連接親和素-酶結合物,以放大反應信號。
ELISA 普遍用作非放射性同位素的成鍵化驗. 在這種方法中, 通常標准配體是固定的, 通過加入溶液相受體或蛋白質來使之成鍵. 通過加入與受體特異性反應的抗體來定量成鍵的受體, 而且最初抗體的量以加入第二種能顯色的抗體測量. 第二種抗體能識別抗體的末端, 在其末端的鹼性磷酸酯或過氧化物酶等與酶發生反應, 從而使溶液顯色.

4. 溶菌酶含量的測定方法

那要看你用什麼方法測定dna和rna:
(1)紫外吸收法也就是測量od(260)和od(280)的吸收值,這樣的方法其它的雜質對測量結果影響大一點,因為其它雜質在這兩個吸收波長也有吸收。
(2)熒光法,用picogreen熒光染料,測定dna,rna濃度比較靈敏,並且適合測量低濃度和微量dna和rna,並且受其它雜質的影響不大,缺點要有專門的熒光檢測儀器,試劑比較昂貴。
純化dna可以買試劑盒,主要有膜吸附法,磁珠分離法,都很方便。

5. 酶聯免疫檢測的幾種方法及其原理

(1)酶聯免疫吸附試驗(enzyme
linked
immunosorbent
assay,ELISA):是將抗原或抗體吸附在固相載體表面。使抗原抗體反應在固相載體表面進行。可用間接法、雙抗體夾心法或競爭法測定抗原或抗體。
(2)夾心法(sandwich
assay):將已知的特異抗體包裝在固相載體(塑料板凹孔或紙片上),加入待檢標本,標本中的抗原即可與載體上的抗原結合,洗去未結合的材料後加入該抗原的酶標記抗體,洗去未結合的酶標抗體,加底物顯色,用酶免疫檢測儀測量顏色的光密度,可定量測定抗原。
間接法(indirecr
ELISA)常用於檢查特異抗體。先將已知特異抗原包被固相載體,加入待檢標本(可能含有相應抗體),再加入酶標抗Ig的抗全(即第二抗體),經加底物顯色後,根據顏色的光密度計算出標本中抗體的含量。
(3)BAS-ELISA:近年來對酶免設分析法的改進是使用生物素-親合素-過氧化物酶復合物作為指示劑,組成一新的生物放大系統進一步提高檢測的敏感度。可用來檢測多種抗原抗體系統如細菌、病毒、腫瘤細胞表面抗原等。一個親合素(avidin)分子可以結合4個生物素分子(biotin)。結合非常穩定。親合素和生物素都可與抗全、酶、熒光素等分子結合,而不影響後者的生物活性。一個抗體分子可偶聯90個生物素分子,通過生物素又可連接多個親合素。因此大提高檢測的敏感度。目前應用生物-酶標親合素系統(biotinavidin
system-
ELISA,BAS-ELISA),它是通過生物素標記抗體連接免疫反應系統,同時藉助生物素化酶或酶標親合素引入酶與底物反應系統。

6. 澱粉酶的測定方法有哪些

植物中的澱粉酶能將貯藏的澱粉水解成麥芽糖。澱粉酶幾乎存在於所有植物中,其中以禾穀類種子的澱粉酶活性最強。植物中有α–澱粉酶和β–澱粉酶,其活性因植物的生長發育時期不同而有所變化。通過本實驗掌握澱粉酶的提取和測定方法。
原理:
α–澱粉酶和β–澱粉酶,各有其一定的特性,如β–澱粉酶不耐熱,在高溫下易鈍化,而α–澱粉酶不耐酸,在pH3.6以下則發生鈍化。通常提取液中同時有兩種澱粉酶存在,測定時,可根據它們的特性分別加以處理,鈍化其中之一,即可測出另一酶的活性。將提取液加熱到70℃維持15 min以鈍化β–澱粉酶,便可測定α–澱粉酶的活性。或者將提取液用pH3.6之醋酸在0℃加以處理,鈍化α–澱粉酶,以求出β–澱粉酶的活性。
澱粉酶水解澱粉生成的麥芽糖,可用3,5–二硝基水楊酸試劑測定。由於麥芽糖能將後者還原生成3–氨基–5–硝基水楊酸的顯色基團,在一定范圍內其顏色的深淺與糖的濃度成正比,故可求出麥芽糖的含量。以單位重量樣品在一定時間內生成的麥芽糖的量表示酶活力。

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