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高濃度抗原直接檢測方法

發布時間:2022-08-06 09:07:11

⑴ 指出ELISA有哪幾種常用方法各種方法在操作上有什麼異同

⑵ 酶聯免疫法的檢測方法

雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法,操作步驟如下:
一、將特異性抗體與固相載體連接,形成固相抗體:洗滌除去未結合的抗體及雜質。
二、加受檢標本:使之與固相抗體接觸反應一段時間,讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結合,形成固相抗原復合物。洗滌除去其他未結合的物質。
三、加酶標抗體:使固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質的量正相關。
四、加底物:夾心式復合物中的酶催化底物成為有色產物。根據顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量。
根據同樣原理,將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標抗原結合物,即可用雙抗原夾心法測定標本中的抗體。
在臨床檢驗中,此法適用於檢驗各種蛋白質等大分子抗原,例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體,就可用於包被固相載體和制備酶結合物而建立此法。如抗體的來源為抗血清,包被和酶標用的抗體最好分別取自不同種屬的動物。如應用單克隆抗體,一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗,分別用於包被固相載體和制備酶結合物。這種雙位點夾心法具有很高的特異性,而且可以將受檢標本和酶標抗體一起保溫反應,作一步法檢測。
在一步法測定中,當標本中受檢抗原的含量很高時,過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合,而不再形成夾心復合物。類同於沉澱反應中抗原過剩的後帶現象,此時反應後顯色的吸光值(位於抗原過剩帶上)與標准曲線(位於抗體過剩帶上)某一抗原濃度的吸光值相同,如按常法測讀,所得結果將低於實際的含量,這種現象被稱為鉤狀效應(hook effect),因為標准曲線到達高峰後呈鉤狀彎落。鉤狀效應嚴重時,反應甚至可不顯色而出現假陰性結果。因此在使用一步法試劑測定標本中含量可異常增高的物質(例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等)時,應注意可測范圍的最高值。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應。
假使在被測分子的不同位點上含有多個相同的決定簇,例如HBsAg的a決定簇,也可用針對此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結合物。但在HBsAg的檢測中應注意亞型問題,HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4個亞型,顯然每種亞型均有相同的a決定簇的反應性,這也是用單抗作夾心法應注意的問題。
雙抗體夾心法測抗原的另一注意點是類風濕因子(RF)的干擾。RF是一種自身抗體,多為IgM型,能和多種動物IgG的Fc段結合。用作雙抗體夾心法檢測的血清標本中如含有RF,它可充當抗原成份,同時與固相抗體和酶標抗體結合,表現出假陽性反應。採用F(ab')或Fab片段作酶結合物的試劑,由於去除了Fc段,從而可消除RF的干擾。雙抗體夾心法ELISA試劑是否受RF的影響,已被列為這類試劑的一項考核指標(參見6.2)。
雙抗體夾心法適用於測定二價或二價以上的大分子抗原,但不適用於測定半抗原及小分子單價抗原,因其不能形成兩位點夾心。
雙抗原夾心法測抗體
反應模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進行包被和制備酶結合物,以檢測相應的抗體。與間接法測抗體的不同之處為以酶標抗原代替酶標抗抗體。此法中受檢標本不需稀釋,可直接用於測定,因此其敏感度相對高於間接法。乙肝標志物中抗HBs的檢測常採用本法。本法關鍵在於酶標抗原的制備,應根據抗原結構的不同,尋找合適的標記方法。 在雙抗體夾心法測定抗原時,如應用針對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標抗體,則在測定時可使標本的加入和酶標抗體的加入兩步並作一步。這種雙位點一步不但簡化了操作,縮短了反應時間,如應用高親和力的單克隆抗體,測定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應用使測定抗原的ELISA提高到新水平。
在一步法測定中,應注意鉤狀效應(hookeffect),類同於沉澱反應中抗原過剩的後帶現象。當標本中待測抗原濃度相當高時,過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合,而不再形成夾心復合物,所得結果將低於實際含量。鉤狀效應嚴重時甚至可出現假陰性結果。 間接法是檢測抗體最常用的方法,其原理為利用酶標記的抗體以檢測已與固相結合的受檢抗體,故稱為間接法。操作步驟如下:
⑴將特異性抗原與固相載體連接,形成固相抗原:洗滌除去未結合的抗原及雜質。
⑵加稀釋的受檢血清:其中的特異抗體與抗原結合,形成固相抗原抗體復合物。經洗滌後,固相載體上只留下特異性抗體。其他抗體及血清中的雜質由於不能與固相抗原結合,在洗滌過程中被洗去。
⑶加酶標抗抗體:與固相復合物中的抗體結合,從而使該抗體間接地標記上酶。洗滌後,固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。例如欲測人對某種疾病的抗體,可用酶標羊抗人IgG抗體。
⑷加底物顯色:顏色深度代表標本中受檢抗體的量。
本法主要用於對病原體抗體的檢測而進行傳染病的診斷。間接法的優點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。
間接法成功的關鍵在於抗原的純度。雖然有時用粗提抗原包被也能取得實際有效的結果,但應盡可能予以純化,以提高試驗的特異性。特別應注意除去能與一般健康人血清發生反應的雜質,例如以E.Coli為工程酶的重組抗原,如其中含有E.Coli成份,很可能與受過E.Coli感染者血清中的抗E.Coli抗體發生反應。抗原中也不能含有與酶標抗人Ig反應的物質,例如來自人血漿或人體組織的抗原,如不將其中的Ig去除,試驗中也發生假陽性反應。另外如抗原中含有無關蛋白,也會因競爭吸附而影響包被效果。
間接法中另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性抗體。病人血清中受檢的特異性IgG只佔總IgG中的一小部分。IgG的吸附性很強,非特異IgG可直接吸附到固相載體上,有時也可吸附到包被抗原的表面。因此在間接法中,抗原包被後一般用無關蛋白質(例如牛血清蛋白)再包被一次,以封閉(blocking)固相上的空餘間隙。另外,在檢測過程中標本須先行稀釋(1:40~1:200),以避免過高的陰性本底影響結果的判斷。 競爭法可用於測定抗原,也可用於測定抗體。以測定抗原為例,受檢抗原和酶標抗原競爭與固相抗體結合,因此結合於固相的酶標抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下:
⑴將特異抗體與固相載體連接,形成固相抗體。洗滌。
⑵待測管中加受檢標本和一定量酶標抗原的混合溶液,使之與固相抗體反應。如受檢標本中無抗原,則酶標抗原能順利地與固相抗體結合。如受檢標本中含有抗原,則與酶標抗原以同樣的機會與固相抗體結合,競爭性地佔去了酶標抗原與固相載體結合的機會,使酶標抗原與固相載體的結合量減少。參考管中只加酶標抗原,保溫後,酶標抗原與固相抗體的結合可達最充分的量。洗滌。
⑶加底物顯色:參考管中由於結合的酶標抗原最多,故顏色最深。參考管顏色深度與待測管顏色深度之差,代表受檢標本抗原的量。待測管顏色越淡,表示標本中抗原含量越多。一般情況,是通過方波伏安法,檢測培養體系的峰電流,通過峰電流與抗原抗體的線性關系來最終確定體系的最終檢測目標的濃度。
當抗原材料中的干擾物質不易除去,或不易得到足夠的純化抗原時,可用此法檢測特異性抗體。其原理為標本中的抗體和一定量的酶標抗體競爭與固相抗原結合。標本中抗體量越多,結合在固相上的酶標抗體愈少,因此陽性反應呈色淺於陰性反應。如抗原為高純度的,可直接包被固相。如抗原中會有干擾物質,直接包被不易成功,可採用捕獲包被法,即先包被與固相抗原相應的抗體,然後加入抗原,形成固相抗原。洗滌除去抗原中的雜質,然後再加標本和酶標抗體進行競爭結合反應。競爭法測抗體有多種模式,可將標本和酶標抗體與固相抗原競爭結合,抗HBc ELISA一般採用此法。另一種模式為將標本與抗原一起加入到固相抗體中進行競爭結合,洗滌後再加入酶標抗體,與結合在固相上的抗原反應。抗HBe的檢測一般採用此法。 血清中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時存在,後者會干擾IgM抗體的測定。因此測定IgM抗體多用捕獲法,先將所有血清IgM(包括異性IgM和非特異性IgM)固定在固相上,在去除IgG後再測定特異性IgM。操作步驟如下:
⑴將抗人IgM抗體連接在固相載體上,形成固相抗人IgM。洗滌。
⑵加入稀釋的血清標本:保溫反應後血清中的IgM抗體被固相抗體捕獲。洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質成分。
⑶加入特異性抗原試劑:它只與固相上的特異性IgM結合。洗滌。
⑷加入針對特異性的酶標抗體:使之與結合在固相上的抗原反應結合。洗滌。
⑸加底物顯色:如有顏色顯示,則表示血清標本中的特異性IgM抗體存在,是為陽性反應。 親和素是一種糖蛋白,可由蛋清中提取。分子量60kD,每個分子由4個亞基組成,可以和4個生物素分子親密結合。維生素H,分子量244.31,存在於蛋黃中。用化學方法製成的衍生物,生物素-羥基琥珀亞胺酯(biotin-hydroxysuccinimide,BNHS)可與蛋白質、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產物。親和素與生物素的結合,雖不屬免疫反應,但特異性強,親和力大,兩者一經結合就極為穩定。由於1個親和素分子有4個生物素分子的結合位置,可以連接更多的生物素化的分子,形成一種類似晶格的復合體。因此把親和素和生物素與ELISA偶聯起來,就可大提高ELISA的敏感度。
親和素-生物素系統在ELISA中的應用有多種形式,可用於間接包被,亦可用於終反應放大。可以在固相上先預包被親和素,原用吸附法包被固相的抗體或抗原與生物素結合,通過親和素-生物素反應而使生物素化的抗體或抗在相化。這種包被法不僅可增加吸附的抗體或抗原量,而且使其結合點充分暴露。另外,在常規ELISA中的酶標抗體也可用生物素化的抗體替代,然後連接親和素-酶結合物,以放大反應信號。 在臨床檢驗中一般採用商品試劑盒進行測定。ELISA中有三個必要的試劑:免疫吸附劑、結合物和酶的底物等。完整的ELISA試劑盒包含以下各組分:
⑴已包被抗原或抗體的固相載體(免疫吸附劑);⑵酶標記的抗原或抗體(結合物);
⑶酶的底物;
⑷陰性對照品和陽性對照品(定性測定中),參考標准品和控制血清(定量測定中);
⑸酶聯物(結合物)及標本的稀釋液;
⑹洗滌液;
⑺酶反應終止液。

⑶ 免疫學的檢測方法

免疫學檢測方法可分為體液免疫和細胞免疫。

⑷ 可用於elisa的抗體有哪些類型

⑸ 細胞免疫功能檢測常用有哪幾種方法

細胞免疫(CMⅠ)是由多種細胞相互作用的結果。免疫細胞間相互作用導致多種細胞因子的釋放。因此細胞功能測定不僅涉及T細胞的數量和功能與包括各類因子活性測定,因此評價機體的細胞免疫功能不僅程序復雜,且很難標准化。
一、遲發型過敏反應的體外檢測方法
皮膚試驗和接觸性過敏的誘發是檢測遲發型過敏反應(DTH)的兩種常用方法。皮膚試驗中誘發對曾經使病人致敏的抗原的再次應答,而接觸性過敏是測試受者對從未接觸過的物質發生致敏的能力。
1.皮膚試驗 用皮膚試驗診斷DTH,常用的抗原有結核菌純蛋白衍生物(PPD)、腮腺炎病毒、念珠菌素等,在人類試驗時在前臂皮內注射少量可溶性抗原,24~48小後,測量紅腫硬結的大小,硬結直徑大於10mm即被看作為陽性。表明受試者對該病原菌有了一定的細胞免疫能力,若皮試無反應,可用更高濃度的抗原重復試驗,若仍無反應即為陰性,需排除皮試技術誤差,也可能受試者從未接觸過此抗原,也可能由於細胞免疫功能缺損,或由於細胞免疫功能缺損,或由於嚴重感染(麻疹、慢性播散性結核)造成的無反應性。
2.接觸性過敏常應用低分子量化合物如二硝基氯苯(DNCB)誘生接觸性過敏。化合物與皮膚蛋白質結合而導至DTH反應。在動物試驗時,初次皮膚上塗抹DNCB後間隔7~10天再激發刺激,則皮膚出現即為陽性。此試驗人類已不使用。
二、細胞免疫的體外檢測方法
體外檢測淋巴細胞的數量和功能,最易採集的是血標本,首先需分離或純化淋巴細胞,一般使用萄聚糖-泛影葡胺配成比重為1.077的淋巴細胞分層液,當將血液重疊於淋巴細胞分層液之上離心時,由於紅細胞(1.092)、多形核白細胞(1.090)、淋巴細胞(1.070)的比重不同而相互分開。淋巴細胞和單核細胞在血漿和分層液交界處形成一薄層。仔細分出這一薄層的細胞,其中淋巴細胞佔80%,單核細胞佔20%,淋巴細胞中T細胞佔80%,B細胞佔4%~10%,其作為非DT、非B細胞。
1.T細胞計數
(1)E花環法:人類T細胞表面有SRBC受體(CD2)能與SRBC結合形成玫瑰花環樣結構,將經分層液分離現的RBM懸液與SRBC在含有血清的平衡鹽水中混合,經37℃培養5~10分鍾放4℃過夜,取細胞懸計數,外周血淋巴細胞中約70%~80%淋巴細胞結成花環即為T細胞。目前此方法已用來分離T細胞,而不用做T細胞計數。
(2)用單克隆抗體計數T細胞:將人的PBM分成三等份,分別用小鼠抗人CD3、CD4和CD8的單克隆抗體作第一抗體與細胞結合,再用FITC標記的兔抗小鼠IgG抗體作第二抗體進行間接免疫熒光染色,在熒光顯微鏡下或流式細胞儀檢測結果,在PBM中被CD3抗體染上熒光的細胞稱為CD3 細胞即總T細胞。正常人在PBM中T細胞佔70%~80%。正常人的CD4 細胞和CD8 細胞之和應與CD3 細胞數一致。CD4 細胞與CD8 細胞的比值正常人約為2/1而艾滋病患者則比值小於1.7。
2.T細胞活化試驗 T細胞能被非特異的物質稱為有絲分裂原所激活而向淋巴母細胞轉化。T細胞轉化過程可伴隨有DNA、RNA、蛋白質的合成增加,最圖導致細胞分裂。在光學顯微鏡下可計數轉化後的淋巴細胞數,也可用氚標記的胸腺嘧啶核苷(3HTdR)摻入正在分裂的淋巴細胞,用液閃測定儀檢查摻入正在分裂的淋巴細胞,用液測量儀檢查摻入的3H-TdR的多少確定淋巴細胞轉化率。最近有一種不用同位素,又可用儀器測量的淋巴細胞增殖反應的檢查法,稱為MTT檢測法,MTT是一種甲氮唑鹽,它是細胞線粒體脫氫酶的底物,細胞內的酶可將MTT分解產生藍黑色甲(fromazan)產物。該產物的多少與活性細胞數正相關。結果可用酶標檢測儀(595mm)測量匯豐銀行密度,做為MTT法的檢查指標。此法的結果與3H-TdR摻入法平行,並能反應試驗中的活細胞數。
3.細胞毒試驗 TC細胞、NK細胞、LAK細胞、TIL細胞對其靶細胞有直接的細胞毒(殺傷)作用。常用的栓測細胞毒效應的方法是51Cr-Na2Cro4鹽水溶液與靶細胞胞混合,於37℃培養1小時左右,51Cr即可進入靶細胞,與胞漿蛋白結合,洗去游離的51Cr後,即可得到51Cr標記的靶細胞,將待檢細胞毒性的細胞與51Cr標記的靶細胞混合(比例約為50:1或100:1)靶細胞被殺傷越多,釋放到上清液中的液游離的51Cr越多,且不能被其他細胞吸收。用γ射線測量儀檢測上清液中的cpm值,即可計算出待檢細胞殺傷活性的高低。
細胞毒試驗檢測Tc細胞效應功能是否健全,及經IgG介導的ADCC效應,或NK細胞在抗腫瘤免疫中的作用是有意義的。
4.混合淋巴細胞的反應(MIR) 是體外研究T細胞的較好的方法,雙向MLR常被用來篩選骨髓移植的供體。來自不同供體的淋巴細胞分別與病人的淋巴細胞混合培養4~5天,在最後8小時摻入51TdR摻入法測T細胞的反應性。或用細胞毒法觀察受刺激的T細胞與活的靶細胞混合(靶細胞來自與刺激細胞相同的個體)如果T細胞受刺激後產生了細胞毒T細胞,可殺死活的細胞,根據靶細胞釋放51Cr的多少算出T細胞移動抑制因子)和LIF(白細胞移動抑制因子)來評估細胞免疫功能。近年來應用測定IL-2的免疫酶技術,操作簡單,並能定量以取代了MIF和LIF的測定。單個核細胞與分裂原一起培養24小時,然後測定清液中的IL-2活性。在細胞免疫功能缺損時,特別是AIDS病人,IL-2分泌明顯降低。而有些疾病,如多發性硬化、類風濕關節炎、移植排斥反應等病人體內血清中IL-2水平升高,表明病人T細胞活性增高。發生移植排斥反應的病人尿中IL-2也可升高。
也可用酶聯免疫吸附試驗測定各種體液中活化的T細胞脫落的IL-2受體(CD25),一般來說IL-2的水平和IL-2受體水平是平行的,IL-2和IL-2受體的檢測可用於對某些疾病的監測,如移桿排斥、自身免疫病以及接受免疫抑制治療的病人。
對體外培養的細胞進行細胞因子產生能力檢測是檢查細胞培養上清液中細胞因子的生物活性或抗原性。現已可用核酸雜交技術,即從組織中或細胞中提取RNA,與同位素或酶標記的該種細胞因子的cDNA探針作分子雜交試驗,即印跡(dot blotting)或Northern印跡,若查出有某種因子的mRNA存在,即說明該細胞在所處培養條件下有產生某種細胞因子的能力。

⑹ elisa步驟

方法一:用於檢測未知抗原的雙抗體夾心法:
1.包被:用0.05M PH9,碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質含量為1~10μg/ml,在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml,4℃過夜。次日,棄去孔內溶液,用洗滌緩沖液洗3次,每次3分鍾。
2.加樣:加一定稀釋的待檢樣品0.1ml於上述已包被之反應孔中,置37℃孵育1小時。然後洗滌。(同時做空白孔,陰性對照孔及陽性對照孔)。
3.加酶標抗體:於各反應孔中,加入新鮮稀釋的酶標抗體(經滴定後的稀釋度)0.1ml,37℃孵育0.5~1小時,洗滌。
4.加底物液顯色:於各反應孔中加入臨時配製的TMB底物溶液0.1ml,37℃10~30分鍾。
5.終止反應:於各反應孔中加入2M硫酸0.05ml。
6.結果判定:可於白色背景上,直接用肉眼觀察結果:反應孔內顏色越深,陽性程度越強,陰性反應為無色或極淺,依據所呈顏色的深淺,以「+」、「-」號表示。也可測OD值:在ELISA檢測儀上,於450nm(若以ABTS顯色,則410nm)處,以空白對照孔調零後測各孔OD值,若大於規定的陰性對照OD值的2.1倍,即為陽性。
方法二:用於檢測未知抗體的間接法:
用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1~10μg/ml,每孔加0.1ml,4℃過夜。次日洗滌3次。加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml於上述已包被之反應孔中,置37℃孵育1小時,洗滌。(同時做空白、陰性及陽性孔對照)於反應孔中,加入新鮮稀釋的酶標第二抗體(抗抗體)0.1ml,37℃孵育30~60分鍾,洗滌,最後一遍用DDW洗滌。其餘步驟同「雙抗體夾心法」的4、5、6。

⑺ 在定量測定抗原時,直接elisa與間接elisa有何區別

直接競爭ELISA和間接競爭ELISA區別
1、直接競爭,標記抗原,與檢測樣品中的抗原競爭抗體。
2、間接競爭,標記抗體,固相抗原與液相抗原(樣品)競爭標記抗體。
3、定義
間接競爭法的模型:包被抗原,用HRP-抗體與樣本一起加入。樣本中的Ag與Solid-Ag競爭HRP-Ab,固相吸附的HRP-Ab與樣本中的Ag濃度成反比。
直接競爭法的模型:包被抗體,用HRP-抗原與樣本一起加入。樣本中的Ag與HRP-Ag競爭Solid-Ab,固相吸附的HRP-Ag與樣本中的Ag濃度成反比。
4、競爭法的理論基礎:是限量抗體。只有在限量抗體基礎上,兩種抗原才會形成競爭關系。
5、、間接競爭法具備較高靈敏度原因。
直接競爭法里,標記抗原與待測抗原均是液相,與抗體的結合機會是一樣的,例如有1份標記抗原與1份待測抗原競爭1份抗體,那麼有50%的標記抗原能與抗體結合,所以標記抗原的相對結合率為50%。間接法里,固相抗原與抗體的接觸面積較小,固相抗原與待測抗原的結合抗體機會是不平等的,接近順序飽和法,即只有與待測抗原結合剩餘的抗體才會與固相抗原結合,同樣有1份固相抗原與1份待測抗原競爭1份抗體時,基本上抗體會被待測抗原中和掉,與固相抗原結合的抗體非常少。固相抗原的相對結合率為0%。因此,間接法的抑制曲線斜率會大於競爭法。
因為抑制率越大則斜率越大,從而靈敏度越大。(假設零管變異5%,以兩倍SD為靈敏度限,則為90%相對結合率,則間接法可以在較低的待測抗原濃度達到這一相對結合率,因此靈敏度要高。)
在進行系統放大時,間接法一般可以使用酶標二抗。因為二抗可以針對抗體的多個部位,所以存在放大效應,從而能提高間接法的靈敏度。直接法一般難以進行放大,常用的有生物 素化抗原與酶標親和素,但模式上似乎不存在放大效應。
6、間接法的高靈敏度難以實現的原因:
雙抗體 夾心的免放(IRMA)模式剛出現時,也被模型證明靈敏度優於競爭法的放免(RIA),原因也是較大的斜率,但是IRMA的高靈敏度一直到單抗發展後才得以實現。

⑻ 新冠抗原自測產品正式上市,誰能測怎麼測准確率如何

新冠抗原自測產品已經通過我國葯監局的審批成功上市,抗原自測產品將為我國新冠防控防控工作帶來更大的便利。

一、抗原自測產品的適用人群

這三類人群可以採用抗原自測試劑:1、不具備核酸檢測條件有自我檢測需求的個體。2、屬於居家隔離、密接隔離、入境隔離或者管控區域內的個體。3、連續幾天內有發熱、咳嗽等症狀的個體。抗原自測可以根據個體內是否有病毒抗原確定個體是否有感染新冠,抗原自測一般十幾分鍾就可以有結果,因此對於以上三個群體進一步診斷有著提效的作用。

⑼ 用125I標記抗原,直接標記法最常用於以下哪些物質的碘化標記

簡單說,放射性碘標記法,標記的化合物內部必須有碘原子可結合的基團,即結構上要含有酪胺基或組織胺殘基。凡蛋白質、肽類等抗原,在結構上含有上述基團的可直接用放射性碘進行標記。如不含上述基團的,放射性碘無法標記,必須在這些化合物的結構上連接上述基團後才能進行碘標記。具體點,放射性碘標記在RIA中,標記抗原質量的優劣,直接影響測定結果,必須制備比放射性強、純度高的標記抗原,並保持免疫活性不受喪失。一、同位素的選擇同位素有穩定性和放射性兩種。放射性同位素可利用其衰變時放出的放射線進行測量,這種測量較靈敏而方便,故多用放射性同位素。標記抗原,常用的放射性同位素有3H、14C、131I和125I等。在使用上各有其優缺點,可根據所進行的放射免疫分析的類型特點,標記物制備和供應情況以及實驗室設備條件等作適當的選擇(表8-1)。大多數抗原分子中都含有C、H等原子,所以用14C或3H標記不改變抗原的結構及其免疫學活性,且14C、3H半衰期長,所標記的抗原長時間放置後仍可使用,這都是其優點。14C或3H標記的不足之處是操作較繁瑣,並難以獲得高比放射性的標記物;3H及14C放出的都是弱β射線,需用較昂貴的液體閃爍計數器方能獲得較高效率的測量,且測定操作也較麻煩。但某些抗原用放射性碘標記容易喪失免疫化學或生物學活性者,則仍以採用3H或14C標記物為佳。表8-1標記抗原常用的放射性同位素及其性質放射性元素半衰期射線種類及能量(百萬電子伏特)βγ14C5720年0.155-3H12.5年0.0189-125I60天-0.035131I8.05天0.608,0.335,0.2500.364,0.637,0.722大多數抗原分子中是不含碘的,引入碘原子就改變了抗原的分子結構,往往容易損傷抗原的免疫化學活性;且放射性碘的半衰期較短,標記物放置後因衰變使放射性降低,因而需要經常制備標記物或要求能定期提供放射性碘標記都能適用,放射性碘放出γ—射線,用一般晶體閃爍計數器就能獲得較高效率而精確的測量,測量操作也很簡單。由於這些突出的優點,目前在放射免疫分析中,使用放射性碘標記物最多。從應用角度來看,131I和125I又各有其優缺點,可根據實驗的要求、儀器的條件和放射性碘制劑的規格等條件合理選用。但相對而言,125I有較多的優點,一是半衰期適中,允許標記化合物的商品化及貯存應用一段時間;二是它只發射28keV能量的X射線和35keV能量的γ射線,而無β粒子,因而輻射自分解少,標記化合物有足夠的穩定性。放射性碘適用於放射免疫分析許多對象(包括蛋白質、肽類、固醇類、核酸類以及環型核苷酸衍生物等)的標記,且操作簡單,一般實驗室都不難做到。二、蛋白質與多肽激素的放射性碘標記要制備高比度、高純度與免疫化學活性好的標記物,首先要有高純度、良好免疫活性的抗原。用作放射標記加網免疫分析的特異性,所以若用純度不高的抗原作標記,則標記後必須採取適當的步驟除去雜質,以獲得高純度的標記物。標記對象的純化應盡量採用溫和的方法,否則在純化操作中已受潛在性損傷的蛋白質(這時表面上活性可能還是良好的),再經標記反應時所受的損傷,活性就會顯著降低,影響以後的放射分析結果。有了好的純抗原,還要採用適當方法加以標記,盡量獲取高比放射性、而又能保持良好的特異免疫化學活性的標記物。這些都是放射免疫分析能取得高特異性和高靈敏度的關鍵問題。多肽激素與蛋白質多用碘標記,最常用的是125I。碘化反應的基本過程如下:通過氧化劑的作用,使碘化物(125I-)氧化成的碘分子(125I2),再與多肽激素、蛋白質分子中的酪氨酸殘基發生碘化作用。所以不管採用哪一種放射性碘標記法,標記的化合物內部必須有碘原子可結合的基團,即結構上要含有酪胺基或組織胺殘基。凡蛋白質、肽類等抗原,在結構上含有上述基團的可直接用放射性碘進行標記。如不含上述基團的,放射性碘無法標記,必須在這些化合物的結構上連接上述基團後才能進行碘標記。因此影響蛋白質、多肽碘化效率的因素,主要決定於蛋白質、多肽分子中酪氨酸殘基的數量及它們在分子結構中暴露的程度;此外,碘化物的用量、反應條件(pH、溫度、反應時間等)及所用氧化劑的性質等也有影響。常用的標記方法有:(一)氯胺T法氯胺T法標記效率高、重復性好、試劑便宜易得,是目前使用最多的碘標記方法。1.原理氯氨—T(Chloramine--T)是一種溫和的氧化劑,在水溶液中產生次氯酸,可使碘陰離子氧化成碘分子。這活性碘可取代肽鏈上酪氨酸苯環上羥基位的一個或兩個氫,使之成為含有放射性碘化酪氨酸的多肽鏈。2.方法以125I—AVP的制備為例。(1)碘化反應:AVP5μg+0.5mol/lPB50μl(pH7.5)+1251800μCi,混合後,加入新配置的Ch—t30μg/15μl(0.05mol/lPB,pH7.5)。迅速振盪混勻,室溫下反應40s。(2)終止碘化反應:加入還原劑偏重亞硫酸鈉40μg/20μl(0.05mol/lPB,pH7.5),以終止碘化反應。(3)Bio—GelP2層析純化:將碘化反應混合液注入Bio—GelP2柱,用0.1nHAC溶液洗脫,分部收集,每2min收集一管,共收集60管。(4)放射性測量:測定各收集管的放射性,出現兩個峰,第一峰為125I—AVP,第二峰為游離碘鹽峰。第一個峰中計算最高的幾管,留下備用。為了解標記抗原的質量,每次碘標記後應計算出碘的利用率,標記上多少放射性碘,以及每微克抗原結合上多少放射性碘。(5)標記抗原的貯存:經純化與檢查後的標記物、加入1/8體積的異丙醇,分成若干小份,置於鉛罐中,在-20℃以下的冰箱中貯存備用,應避免反復凍融。標記抗原在貯存中是不穩定的,這是因為:一是脫碘,標記的碘從原來位置上脫落,變成游離碘;二是蛋白損傷、變性,成為聚合大分子或斷鍵成小分子碎片。由於上述原因,使B/F明顯降低,標准曲線斜率變小,以致不能使用,故需分離純化,其方法是用SephadexG100長柱(40~80cm)過柱,洗脫後出現3個峰。第1個峰分子量大,是蛋白變性的聚合的大分子,尚保留部分抗原決定簇,免疫活性弱;第2個峰是純抗原的蛋白峰,免疫活性好;第3個峰是游離125I或小分子碎片,不具備免疫活性。收集到的第2個純抗原蛋白峰,免疫活性好;第3個峰是游離125I或小分子碎片,不具備免疫活性。收集到的第2個純抗原蛋白峰,其性能類似於新鮮標記的抗原。分離純化的方法解決了標記抗原的貯存、長期使用問題,特別對來之不易的抗原更顯得重要。2.注意事項(1)放射性碘源的選用:無載體的131I或125I均可用於碘化標記,但應盡量選用新鮮的、比放射強度高的、含還原劑量少的放射性碘源。碘源的比放射強度最好≥50~100mCi/ml,至少也要>30mCi/ml,否則加入碘源的容量要增加,隨著帶入碘源中含有的還原劑(為放射性碘源運輸保存所需加入)量也增加,這將會顯著降低碘利用率及標記蛋白比放射強度。放置較久和放射性碘源,一方面因衰變致比放射強度降低,另一方面因水的輻射化學產物增多(主要是131I源),都會降低標記時的碘利用率。放射性碘源含還原劑(如Na2S2O5等)量多時,會抵消氯胺T的作用,降低碘利用率,甚至導致標記完全失敗。放射性碘源要用無載體的,標記所用全部用具和試劑必須不含碘;只要有極少量的碘的污染,非放射性碘就會稀釋放射性碘,使放射性碘利用率顯著降低。為了便於放射性防護和除污染,以及減少射線對蛋白質分子的損傷,標記投入的放射碘量不宜過大,一般以0.5~1.0ml)時則影響較小。微量氯胺T法放射碘標記時,一般多控制碘化反應體積<100μl。(5)碘化反應溫度:溫度升高,碘化反應速度加快,碘利用率有所增加。但總的來看,反應溫度的影響不很大,一般從0℃到20℃碘利用率相差不過百分之幾,故一般在室溫下進行標記操作就可能獲得重復性好的結果。有些蛋白質或肽類極易喪失活性,則可在0℃進行碘化反應。(6)碘化反應的pH值:受氧化劑氧化生成的活性碘,對多肽鏈的酪氨酸基苯環羥基鄰位的碘化作用,最適pH是7.3~7.8之間。當pH變化時,碘化位置也會發生變化,例如pH值較高時,組氧酸的咪唑環也可被碘化;當pH4~5時,活性碘能迅速氧化色氨酸基生成羥基吲哚,導致肽鏈斷裂。這些都會影響蛋白質或多肽的放射性碘化反應,或引起降解或失活。因此作放射性碘化標記時,除放射性碘源外,所有的試劑都應用適當的緩沖液配製,保證碘化反應在最佳pH條件下進行。(7)微量蛋白質或多肽的吸附損失:界面的吸附損失,在使用大量蛋白質或多肽類時是可以忽略的,但作微量法標記時投入的蛋白質或多肽類只在微克甚至毫克甚至毫微克水平,界面吸附導致的損失就不能忽略。例如制備131I—ACTH時,所用ACTH濃度低到50Pg/ml時,因表面吸附可損失10%~30%,甚至高達75%。改變pH、加入非特異性載體蛋白、或使用聚苯乙烯、聚乙烯容器時,能減少吸附,但不能完全消除。一般殘留在反應管和滴管上的放射性為投入總放射性的2%~8%、殘留在層析柱上折佔5%~10%。殘留量隨標記蛋白比放射性強度而直線增減,殘留者幾乎全部都是標記蛋白。由此可見,微量蛋白質或多肽受吸附而損失的量是不容忽略的。由於微量蛋白質、多肽會被顯著吸附而丟失,所以標記時投入蛋白質、多肽量過微(如<2μg)也是不適宜的,否則標記蛋白質、多肽的收回率會太低,並在計算上會造成較大的誤差。(8)不同蛋白質、多肽碘化標記的差別:由於不同的蛋白質和多肽分子中含有的酪氨酸數目不同,而且其空間結構也不相同,分子中的酪按酸殘基有的容易發生碘化反應,有的就不容易碘化,因此同樣條件下進行碘化標記,不同蛋白質或多肽對碘的利用率是不相同的。不同蛋白質經碘化標記後生物活性受損的情況也各不相同。例如ACTH、促性腺激素釋放激素(GRH)、促黃體激素釋放激素(LRH)等多肽,碘化標記後容易喪失激素活性或與受體結合的活性;而AFP及人絨毛膜促性腺激素(HCG)等的碘化標記,則較容易保存良好的免疫化學活性。盡管不同多肽、蛋白度的碘化標記結果有所差別,但上述討論的因素對不同多肽、蛋白質碘化標記的影響有共同的規律。掌握了這些因素,就容易成功地獲得合格的標記物。不同多肽、蛋白質的分子量大小、理化性質各不相同,放射碘化標記反應後,可根據具體情況採取不同的方法將標記蛋白質(或多肽)與未反應的游離放射性碘及受損傷的標記物分開,常用的方法有凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析、各種電泳法等。

⑽ 檢測乙肝表面抗原的方法都有什麼具體一點點

國內最常使用的測定表面抗原的方法是酶聯免疫吸附試驗(ELISA),其次是放射免疫試驗(RIA)。 ELISA簡單、方便、快速,進口試劑盒可測到的血清表面抗原最低濃度為0.2ng/ml,國產試劑盒目前能達到0.5ng/ml。 乙肝表面抗原檢查用於判斷是否感染了乙肝病毒。 1.乙肝表面抗原陽性是感染乙肝病毒的指標,乙肝表面抗原本身具有抗原性,無傳染性。 2.其他肝功能正常而僅僅乙肝表面抗原陽性者,稱為乙肝病毒攜帶者。 3.乙肝表面抗原的滴度高低可判斷患者的傳染性,HBsAg的滴度越高,HBsAg及乙肝病毒DNA陽性的可能性越大,傳染性也就越大。 4.大三陽:是指在乙肝兩對半檢測中,乙肝表面抗原(HBsAg)、E抗原(HBeAg)和核心抗體(HBcAb)檢測均是陽性,提示乙肝病毒感染病毒復制活躍,有傳染性,並不能提示病情是否嚴重。 5.小三陽:是指在乙肝兩對半檢測中,乙肝表面抗原(HBsAg)、E抗體(HBeAb)和核心抗體(HBcAb)檢測均是陽性提示: (1)大多數情況下表示乙肝病毒復制減少,仍然有傳染性。 (2)由大三陽轉向小三陽並不意味著乙肝病毒復制完全停止。少數小三陽病人其血清HBV-DNA持續陽性,病毒復制活躍,病情較嚴重,病情進展迅速。

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