磷酸化nfkb檢測方法

1. NF- kB Signaling Pathways 你那篇文章 謝謝

NF-kappaB是一個大家族，包括：RelA(p65)、c-Rel、RelB、NF-kappaB1
(p50/p105)、NF-kappaB2 (p52/p100)。其中以RelA(p65)研究最為深入。
通常所說的是左邊的經典途徑，大致意思是這樣：非激活狀態下，RelA(p65)與一種名為IkappaB的蛋白結合，停留在胞漿中，不發揮轉錄活性。當炎症因子等刺激時，IkappaB的上游激酶IkappaB
kinase（IKK）磷酸化而激活。IKK使IkappaB降解。p50有核定位信號，沒有了IkappaB的束縛，p50會拽著RelA(p65)往核裡面跑。RelA(p65)識別特定的DNA序列，並結合上去，從而調控靶基因的轉錄（這些基因的啟動子上含有RelA(p65)的結合序列：5』-GGG(A/G)(C/A/T)T(C/T)-3』）。
一般來說，NF-kappaB的激活促進細胞生長，許多抗腫瘤葯物以NF-kappaB為靶點，有興趣的戰友可以找些相關文獻來看看。然而，某些情況下NF-kappaB的激活卻有誘導凋亡的作用。
在讀這篇文章以前，我一直認為NF-kappaB的激活包括這樣三個過程：
（1）NF-kappaB入核。
這個過程可以用Western
blot檢測核蛋白中NF-kappaB的水平，或者免疫熒光看NF-kappaB的亞細胞定位。
（2）NF-kappaB結合到DNA上。
這個過程可以用EMSA或ChIP來檢測NF-kappaB與DNA的結合能力。
（3）啟動某個基因的轉錄。
這個過程可以用熒光素酶報告基因技術檢測靶基因的轉錄水平。NF-kappaB對靶基因的調控不僅是促進的，還可以是抑制的。而NF-kappaB既有促生長又有促凋亡的作用，不僅是由於NF-kappaB選擇性地結合促生長基因或促凋亡基因啟動子，還可以是對靶基因的選擇性地激活或抑制。至於如何選擇，關鍵在於刺激因素。

2. 怎麼測一個基因是不是nf-kb的下游基因

有幾種方法可以選擇：
1.EMSA：一般都是用P標記的探針，具有放射性，要是用生物素標記的話，放射性就小了，但是花的錢就多了。最重要的是放射性的問題，必須有磷屏，否則沒法做。
2.western blot： 這個抗體應該用磷酸化的P65抗體，，因為只有磷酸化的蛋白才具有活性，你要是有錢的話，可以連總蛋白和磷酸化蛋白一起做，比較完善。
3.免疫組化： 也是可以的，原理跟western blot差不多。
4.雙熒光素酶：還有一種更好的方法就是promega的雙熒光素酶報告系統，採用海腎和螢火蟲兩種熒光素酶，一種報告目的基因，一種報告內參，很好的方法，但是很貴。
總體來說，做EMSA和雙熒光素酶是最好的方法，算是定量，但是EMSA有放射性，雙熒光素酶比較貴。western和免疫組化只能用來半定量，但是做的人比較多，也能發高水平的雜志，相對來說比較簡單，也省錢。

3. 腫瘤細胞中能檢測到磷酸化的nf-kb嗎

尿路出血，尿中有惡臭味等才懷疑惡性腫瘤，一般的尿液常規檢查，不含癌細胞的檢查。

答案補充
是否已經確診？胰腺癌的惡性的很高！

答案補充
不用說，你已經很明白的。

4. 怎麼用elisa法測定大鼠nf-kb

大鼠NF-kB Rat NF-kB ELISA Kit
ELISA試劑盒說明：
1．檢測原理：採用雙抗體夾心ABC-ELISA法
2．中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為准。
3．剛開啟的酶聯板孔中可能會含有少許水樣物質，此為正常現象，不會對實驗結果造成任何影響。
4．試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）；2-8℃（頻繁使用時）。
5．濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。

5. 測nf-kb的核轉錄水平能不能測總的磷酸化和核的磷酸化進行比較

nf-kb是怎樣實現入核調控基因轉錄的核因子kB(NF—kB)體系主要涉及機體防禦反應、組織損傷和應激、細胞分化和調亡以及腫瘤生長抑制過程的信息傳遞.在多數細胞類型,NF－kB在胞漿與抑制性蛋白質結合形成無活性的復合物.當腫瘤壞死因子等作用於相應受體後,可通過第二信使Cer等激活此系統,而病毒感染、脂多糖、活性氧中間體、佛波酯、雙鏈RNA以及前述信息傳遞途徑中活化的RKC、PkA等則可直接激活NF－kB.激活過程是通過磷酸化抑制性蛋白使其構象改變而從NF－kB脫落,使得NF－kB得以活化.活化的NF－kB進入細胞核,與DNA接觸,並啟動或抑制有關基因的轉錄.

6. NF-kB信號通路的中文版本

哺乳動物的轉錄因子NF-kB家族由P50（P105的處理產物，兩者都被稱為NF-kB1）,P52(p100的處理產物,兩者都被稱為NF-kB2)，REL(也被稱為cREL)，REL-A(也被稱為P65)和REL-B組成。這些蛋白質二聚化後形成有功能的NF-kB。除了REL-B只能與P50或者P52有效的結合外，存在所有的同源或異源二聚體組合的可能性，並且都具有NF-kB 的活性。每一個NF-kB家族的成員都有一個保守的REL同源區（RHD），它包含三種類型的基序：結合特異性DNA序列的基序；二聚化的基序；和一個核定位的基序，也被稱為核定位信號（NLS）。P50型的NF-kB1及P52型的NF-kB2 包含僅僅一個RHD，而REL、REL-A、和REL-B除包含一個RHD外，還包含一個轉錄活化區。在沒有刺激的細胞中，大部分的NF-kB 二聚體通過與細胞質中三個抑制因子（IkBa、IkBβ、IkBε）中的一個結合而以無活性的狀態存在。這些抑制因子通過它們的錨蛋白區與NF-kB二聚體結合，掩蓋至少一個NLSs。原型抑制因子IkBa，也阻止其結合的二聚體與DNA的結合，並且通過其末端的一個氨基末端輸出序列促進二聚體的出核作用。
各種信號通過降解IkBs的方式來活化NF-kB，活化的NF-kB然後進入細胞核內與DNA結合。IkBs首先是在IkBs激酶（IKK）催化下使其的兩個保守的絲氨酸殘基磷酸化。IKK是由一個調節亞單位，IKK-γ(也被稱為NEMO)和兩個催化亞單位IKK-a，IKKβ組成。接著IkBs在SCF-E3泛素化酶復合體的催化作用下多泛素化而被蛋白酶降解。活化的NF-kB轉位到核內與與其相關的DNA基序結合以誘導靶基因的轉錄。包括多種病原的組分例如脂多糖，前炎性細胞因子，如TNF、IL-1及絲裂原等在內的多種信號活化這種途徑。依賴Ikk-和IKK-降解IkBs的NF-kB活化途徑被稱為經典的NF-kB活化途徑。其他的不被人所熟知的途徑也能從IkBs中活化部分的NF-kB。這些途徑包括 氨酸磷酸化誘導的IkBs解離途徑和 蛋白激酶-2誘導的IkBs的流動加快的方式。釋放後的NF-kB可以通過例如修飾自身的亞單位的方式來影響自身的轉錄激活效能。活化的NF-kB快速的誘導編碼IkBa的基因的轉錄，因此產生高水平的自身抑制劑。新合成的自由的IkBa進入細胞核內，然後使DNA上NF-kB解離並且將NF-kB排出細胞核，因而恢復到靜息狀態。
廣泛的IkBs家族也包括P50和P52前體形式的NF-kB1和NF-kB2，分別是P105和P100。除了P50和P52序列外，這些前體還包括IkB樣的錨蛋白區，它抑制與其相關的NF-kB亞單位的活性。從前體產生P50和P52的過程還沒有被人完全的理解，但他需要翻譯時和翻譯後的蛋白酶的加工處理活動。在翻譯的同時有就會組成性的產生約等量的P50和P105，雖然這時P50還沒有加工完成。P52的產生主要但不完全是由於信號誘導的P100的加工完成的。不像是IkBa、IkBβ、IkBε的降解，信號誘導的磷酸化及加工P100成P52不需要經典的IKK-γ依賴的信號途徑。IKK-a和NF-kB誘導激酶（NIK）是必不可少的，但IKK-β和IKK-γ是不需要的。因而這個途徑又被稱為非經典的，替代的或者新的NF-kB活化途徑。雖然非經典的途徑並不作用於未經處理的P105，但經典的途徑可以有時可以像降解IkBs那樣被完全的降解，因此釋放被結合的NF-kB家族成員。
REL-B很少與小IkBs結合，而P100是其主要的抑制子。非傳統的途徑加工處理P100產生P52-REL-B二聚體。腫瘤壞死因子超家族成員包括B細胞活化因子（BAFF，也被稱為BLYS）、CD40配體、淋巴細胞毒素 和NF-kB受體活化因子配體（也被稱為TRANCER）能夠誘導P100的加工處理。
轉自生物谷

7. NF-KB是什麼

NF-KB（核因子激活的B細胞的κ-輕鏈增強）是一種蛋白質復合物，其控制轉錄的DNA，細胞因子產生和細胞存活。

NF-KB幾乎存在於所有動物細胞類型中，並參與細胞對刺激的反應，如應激，細胞因子，自由基，重金屬，紫外線照射，氧化LDL和細菌或病毒抗原。NF-KB在調節對感染的免疫應答中起關鍵作用。

NF-KB的不正確調節與癌症，炎症和自身免疫疾病，感染性休克，病毒感染和免疫發育不當有關。NF-KB也與突觸可塑性和記憶過程有關。

(7)磷酸化nfkb檢測方法擴展閱讀：

NF-κB由Ranjan Sen（NIH）在諾貝爾獎獲得者David Baltimore的實驗室中通過其與B細胞中免疫球蛋白輕鏈增強子中的11鹼基對序列的相互作用而發現。

核因子-kB（NF-kB），是細胞內重要的核轉錄因子。它參與機體的炎症反應、免疫應答，能調節細胞凋亡、應激反應，NF-kB過度激活，與人類許多疾病如類風濕關節炎、心臟與腦部疾病的炎症變化等相關，因此通過葯物來抑制NF-kB信號轉導通路，可能會成為治療的手段。

NF-kB分子的N端含Rel同源域，參與其和DNA結合、參與二聚體化，能被NF-kB抑制物（TeB）結合、抑制；NF-kB分子內還有核輸出域、核定位域、轉位活性域等，C端有反式轉錄激活域。

p50/p65NF-KB能與靶基因啟動子免疫球蛋白k輕鏈基因轉錄增強序列（kB序列）特異結合。RelA/c-Rel二聚體，能與靶基因啟動子其他序列結合。

參考資料來源：網路-NF-kB信號通路

8. 測NF-kB P65的表達。急！！！！！！！

我幫你看了一下,如果是磷酸化的抗體,那肯定要買2個了.如果是沒磷酸化的抗體,目前我還沒有查到能一起抗2個的.他們是來自同一個轉錄本嗎?

產品名稱 貨號 宿主 用途 規格 種類特異性 價格 說明書
Anti-Actiated NF-κB p65 (NLS specific) Rabbit pAb KC-5N02 Rabbit W 100 μl H, M, R 988元 詳細資料
Anti-NF-κB p65 (Rel A) Mouse mAb KC-5N03 Mouse W 100 μl H, M, R 988元 詳細資料
Anti-NF-κB p65 (Rel A) Rabbit pAb KC-5N01 Rabbit W 100 μl H, M, R 988元 詳細資料
Anti-Phosoho-NF-κB p65 (Ser276) Rabbit pAb KC-5N05 Rabbit W, IHC 100 μl H, M, (R) 1488元 詳細資料
Anti-Phosoho-NF-κB p65 (Ser536) Rabbit pAb KC-5N04

9. 請教NF-KB檢測方法

NF-kB比較特殊，他基本上是ready-to-use，也就是胞內總有一定量的轉錄和表達，總在那裡，但是被IkB所抑制不發揮作用，當信號來時，IkB被IKK磷酸化失活被泛素蛋白酶體降解，NFkB釋放進入核發揮轉錄因子的作用
可參考下面的圖
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/5/5e/NFKB_mechanism_of_action.png

因此對NF-kB的研究，如果只檢測NFkB的WB就很難有結果了，而至少需要檢測：

1. 胞內和核內NF-kB的量，也就是要區別核蛋白和胞漿蛋白，這個可以用WB；
2. 檢測IkB的磷酸化，這個也可用WB，不過IkB有兩個不同的泛素化位點作用不同，因此也不是很特異的方法；
3. 最經典的還是要做EMSA，直接檢測NF-kB與DNA的結合，這個應該是目前最權威的試驗了，推薦！！

10. 如何檢測轉錄因子nf-kb從細胞質轉移進入細胞核

mRNA通核孔細胞核轉移細胞質主運輸
解析：RNA蛋白質等物質通核孔進細胞核種式主運輸
主運輸針物質需要載體蛋白並且耗能