細菌營養缺陷的檢測方法

Ⅰ 篩選營養缺陷型細菌的基本步驟和方法及其原理

營養缺陷型是指某菌株經突變後，喪失了合成某營養素的功能，若在培養基上培養必須添加相應的營養素才能生長。用加有青黴素的培養基來選擇細菌的營養缺陷型的一種方法。也就是由於青黴素是細菌細胞壁的合成抑制劑，利用其可殺死正在繁殖的細菌的性質，對所有青黴素敏感菌的一種方便的選擇法。
例如將細菌先在完全培養基中培養24小時，離心分離菌體，即用生理鹽水（0.85％—0.95％NaCl溶液）反復離心洗滌2—3次，然後在加有青黴素（100—300單位/立升）的基本培養基中於最適溫度中培養24小時。
這時不是營養缺陷型的原來野生型細胞會因不斷分裂而被青黴素所殺死。然後將菌懸液放在完全瓊脂培養基進行平面培養，在平面上長出來的菌落大多為營養缺陷型。通過與影印法並用，可高效率地分離到變異菌株。
篩選營養缺陷型菌株般步驟和方法①誘變 ②淘汰野生型③檢出缺陷型④鑒定營養缺陷型——生長譜法

Ⅱ 怎樣篩選營養缺陷型菌株

一.篩選營養缺陷型菌株的一般步驟和方法
①誘變 常用紫外線等物理方法和化學誘變劑等誘變形成大量營養缺陷型菌株。用15W或20W紫外燈管，距離15cm～30cm，照射10sec～20min。在照射受試菌前，燈管須預熱20min，使燈光穩定。菌懸液要磁力攪拌，使所有單細胞或單孢子均勻受到照射。特別要注意，應在黑暗或紅外光下操作，接種後器皿用黑布包嚴，防止發生可見光的修復作用。
②淘汰野生型
a）抗生素法 某些抗生素能殺死生長繁殖著的微生物，而對處於休止狀態的微生物無殺傷作用。如青黴素能抑制細菌細胞壁肽聚糖的生物合成，制黴菌素可損傷真菌細胞膜，二者可分別殺死生長繁殖著的細菌、真菌。
b）菌絲過濾法 適用於放線菌、黴菌等絲狀微生物。在基本培養基中野生型孢子能萌發長成菌絲體，而營養缺陷型孢子則不生長。將經誘變處理的孢子接種於液態基本培養基中，振盪培養10h～12h，使原養型萌發（以肉眼剛能看見菌絲為度），然後以濾紙、棉花或玻璃過濾漏斗過濾，菌絲被濾除，未萌發的缺陷型孢子能順利通過，從而達到富集營養缺陷型的目的。
③檢出缺陷型的常用方法
a）逐個測定法（點種法）把經誘變處理並淘汰野生型後的菌液在完全培養基上塗布分離，將培養後長出的每一個菌落分別點種在基本培養基和另一個完全培養基上，凡在基本培養基上不能生長而在完全培養基的相應位置上能生長的菌落，表明其為營養缺陷型。
b）夾層培養法經誘變處理後的菌液，稀釋後與基本培養基混勻並傾入平皿中，待凝固後，再加上一薄層不含菌的基本培養基。培養後在皿底將長出的菌落做上標記。然後加上一層完全培養基，再經培養後，新出現的菌落多數是營養缺陷型（圖3－31）。此法適用於兼性厭氧的細菌。
C）影印法 將絲絨包在直徑小於平皿的圓柱台上，固定，作為影印接種工具，滅菌備用。將經誘變處理並淘汰野生型的菌液塗布於完全培養基表面上，培養，待長出菌落後，用影印接種工具在此平板上輕按一下，然後在另一基本培養基平板上按一下。經培養後在基本培養基上不長而在完全培養基的相應部位上生長的菌落，為營養缺陷型。
④鑒定營養缺陷型——生長譜法 將檢出的缺陷型菌株接種在完全培養基上培養，把生長的菌體或孢子洗下，離心清洗後製成濃度為107個／ml～108個／ml的菌懸液。取0.1ml該懸液與基本培養基混勻倒皿，冷凝並稍乾燥後，分區加沾有各種營養物的圓濾紙片，培養，觀察生長反應。
在篩選營養缺陷型的過程中必須注意表型延遲現象。由於誘變劑一般僅作用於DNA的某一單鏈，故突變無法反映在當代的表型上，需經DNA復制和細胞分裂後，才使表型發生變異，此即表型延遲現象。
二.富集和分離抗生素敏感菌的營養缺陷型突變株的抗生素法 將抗生素加入原養型培養基（即培養基中缺少營養缺陷型所需的養分）中，能殺死生長中的野生型細胞，而不能生長的突變株得以倖免。
抗生素敏感菌營養缺陷型菌株的篩選過程①菌懸液誘變處理。②死的和活的野生型細胞及一些活的前突變細胞的混合液在C．M．中培養，使已發生營養缺陷突變的細胞的缺陷表型得以充分表現。若無這一階段的培養，則許多細胞的基因型雖已改變，但表型仍和野生型一樣，這些突變細胞在以後接觸抗生素時也將被殺死。③在無氮培養液中培養，使營養缺陷型菌株細胞內所含養料盡量消耗，以便停止其生長繁殖。④在含抗生素的M．M．中培養，殺死能生長的野生型菌株。⑤檢出缺陷型。⑥鑒定缺陷型.
三.營養缺陷型在科研和生產實踐中的應用在科學研究中，營養缺陷型既可作為研究代謝途徑和雜交、轉化、轉導、原生質體融合等遺傳規律所必不可少的標記菌種，也可作為氨基酸、維生素或鹼基等生物測定的試驗菌種。在生產實踐中，營養缺陷型可作為菌種雜交、重組育種和構建工程菌時所不可缺少的帶有特定基因標記的親本菌株，它們還常被用作生產核苷酸、氨基酸等代謝產物的生產菌株。由於營養缺陷型在代謝途徑中某一步驟發生缺陷，致使終產物不能積累，從而遺傳性地解除反饋抑制，使中間代謝產物或另一分支途徑的末端產物得以積累。
例如，用高絲氨酸營養缺陷型作為賴氨酸的生產菌株，由於該突變株的遺傳性，解除了賴氨酸與蘇氨酸的協同反饋抑制，因此，在培養系統中限量補充蘇氨酸，就可使天冬氨酸半醛全部向賴氨酸方向轉化，賴氨酸產量大大提高。

Ⅲ 歸納概括細菌檢驗方法

10種常用的細菌檢測方法

一、[3H]脫氧胸苷攝入法測定細胞數：
1、用RPMI-1640培養液洗滌對數生長期（培養3天）的CTLL-2細胞兩次，每次250×g離心10分鍾，洗去培養液中殘存的IL-2。
2、用台盼藍（1% Trypan blue）染色法計數細胞並決定細胞的活力，用10%小牛血清的RPMI-1640培養液懸浮細胞至1×105/ml。
3、在96孔細胞培養板中每孔加0.1ml倍比稀釋的標准IL-2或待測樣品，每個稀釋度三個復孔，標准IL-2從40 IU/ml稀釋到0.019 IU/ml（8～10個稀釋度），陰性對照孔不加IL-2。
4、每孔加0.1ml細胞懸液，在37℃ 5% CO2的飽和水汽二氧化碳培養箱中培養18～24小時。每孔加10μl（0.5μCi或1.85×104Bq）[3H]脫氧胸苷，繼續培養4小時。
5、用多頭細胞收集器將細胞收集到玻璃纖維濾紙上，用3%醋酸水溶液濾紙3次，洗去游離的[3H]TdR。將濾紙置液體閃爍瓶中，加入5ml閃爍液。在液體閃爍儀上計數細胞攝入的同位素活性（每分鍾放射性計數，cpm），根據儀器效率換算成dpm（每分鍾衰變數）。
6、用dpm值對樣品稀釋倍數作圖。在圖上，標准IL-2的曲線與待測樣品的曲線應當呈平行的S型，說明是同樣的分子反應。比較同樣dpm處的不同稀釋倍數，決定待測樣品的相應濃度。
二、MTT檢測法：
1、取96孔細胞培養板，每孔中加0.1ml含2×104～10×104靶細胞的培養液（含10%小牛血清的RPMI-1640培養液），在37℃ 5% CO2的飽和水汽二氧化碳培養箱中培養2～3小時讓細胞帖壁（如果是懸浮細胞可直接進行下一步）
2、用RPMI-1640培養液2～10倍遞次稀釋細胞因子標准品，根據情況2～5倍遞次稀釋待檢樣品，每孔加0.1ml稀釋的標准品和待檢樣品，每個稀釋度3個重復孔。對照孔6個：3個陽性對照孔，每孔加0.1ml含大劑量細胞因子的RPMI-1640培養液，3個陰性對照孔，每孔加0.1ml RPMI-1640培養液。在37℃ 5% CO2的飽和水汽二氧化碳培養箱中培養24～48小時或預定的時間。
3、吸去培養液，用PBS洗滌一次（如為懸浮細胞，應在吸去上清液前離心培養板）。
4、每孔加0.1ml PBS和10μl MTT染液，在37℃ 5% CO2的飽和水汽二氧化碳培養箱中培養4～6小時。
5、每孔加0.1ml酸化異丙醇，也可用含10% SDS的10mmol/L HCl代替酸化異丙醇，在振盪器上振盪混勻，讓還原產物充分溶解。置酶聯檢測儀上測定光密度（OD）值，檢測波長570nm，參考波長630nm。以OD值對樣品稀釋度作圖，比較標准曲線和待測樣品曲線即可求得待測樣品中細胞因子的含量。
三、XTT檢測法：
用XTT代替MTT可省去溶解還原產物結晶的步驟，XTT可以被活細胞中的代謝酶還原成黃色水溶性的代謝產物（formazan）。代謝產物在OD450處有吸收峰。
四、MTS檢測法：
1、培養IL-2依賴細胞株CTLL-2細胞或HT-2細胞（檢測IL-2），或者IL-3依賴細胞株FDC-P1細胞或FL5.12細胞（檢測IL-3）到對數生長期。
2、取96孔細胞培養板，每孔加0.1ml含1×104～2×104上述細胞之一的DMEM培養液（加10%小牛血清）。
3、每孔加0.1ml系列稀釋的待測細胞因子（IL-2或IL-3）樣品或細胞因子標准品，在37℃ 5% CO2的飽和水汽二氧化碳培養箱中培養24小時。
4、每孔加20μl MTS/PMS混合液，繼續培養3～4小時顯色。
5、檢測前搖晃培養板10秒鍾，混勻顏色。在酶聯檢測儀上，波長570nm（或490nm，或570nm和690nm）處檢測各孔的光吸收值（OD）。用樣品稀釋度對OD值（OD570、OD490或OD570/OD690）繪制劑量-反應曲線，根據標准品曲線計算樣品中細胞因子的量。
五、NAG檢測法：
1、按MTT檢測法培養細胞和用不同稀釋度的細胞因子處理細胞。
2、吸去培養液，用PBS洗滌兩次（如為懸浮細胞，應在吸去上清液前先離心）。
3、每孔加60μl NAG染液，在37℃ 5% CO2的飽和水汽二氧化碳培養箱中培養4小時。
4、每孔加90μl終止液，混勻後置酶聯檢測儀上測定光密度（OD）值，檢測波長402nm。以OD值對樣品稀釋度作圖，比較標准曲線和待測樣品曲線即可求得待測樣品中細胞因子的含量。
六、AlamarBlueTM攝入法：
1、按MTT檢測法培養細胞和用不同稀釋度的細胞因子處理細胞。
2、在培養結束前24小時加入Alamar Blue染料，96孔細胞培養板每孔20μl。
3、在培養結束後，直接在酶聯檢測儀上測定光吸收值。氧化型Alamar Blue的最大光吸收在570nm，用OD570減去OD600即為活細胞還原的Alamar Blue染料，顏色深淺與活細胞數成正比。
七、鹼性磷酸酶檢測法（AKP法）：
1、按MTT法用細胞因子處理靶細胞適當時間，用PBS洗去死亡細胞，洗兩次。
2、向96孔細胞培養板各孔中加0.2ml新鮮配製的底物液（0.2mol/L 硼酸，1mmol/L MgCl2，1.2mmol/L甲傘基磷酸）。在37℃ 5% CO2的飽和水汽二氧化碳培養箱中培養3小時。
3、在熒光計數儀上測定熒光的量。根據測定已知不同數目細胞的熒光量作出標准曲線，根據標准曲線可得到各孔中的活細胞數。
八、三磷酸腺苷檢測法（ATP法）：
1、ATP反應液（Bio-Orbit）是粉末狀混合物，含有熒光素、熒光素酶、0.5mmol醋酸鎂、50mg BSA和0.1μmol無機焦磷酸。在4℃可以保存1個月。用前用10ml含2mmol/L EDTA的0.1mol/L pH7.75 Tris-醋酸緩沖液稀釋。稀釋液分裝後可在－20℃長期保存。
2、在已經完成促增殖或抑生長試驗後的96孔細胞培養板中（每孔含100μL細胞培養液），每孔加0.1ml ATP釋放因子，室溫中反應5分鍾。取另一塊96孔細胞培養板，從第一塊板的各孔中吸0.1ml細胞溶解物到第二塊板的相應各孔。
3、在低於25℃中，將第二塊板置自動多孔熒光檢測儀中。用自動加樣器，每孔加入20μl ATP反應液，立即檢測10秒鍾的熒光強度。溫度升高，檢測敏感性就下降。
4、用RLU（Y軸）對細胞因子標准品的稀釋度（X軸）作標准曲線，根據標准曲線確定待測樣品中細胞因子的含量。
九、染料染色法測定細胞數：
1）結晶紫檢測法：
1、在96孔細胞培養板各孔中加0.1ml含5×104～10×4 WEHI-164細胞的培養液（含10%小牛血清的RPMI-1640培養液），37℃ 5% CO2的二氧化碳培養箱中培養2～3小時，讓細胞帖壁。
2、用RPMI-1640培養液10倍遞次稀釋TNF標准品，根據需要3～5倍遞次稀釋待檢樣品，每孔加0.1ml稀釋的標准品或待檢樣品，每個稀釋度3個重復孔。對照孔6個，3個陽性對照孔各加0.1ml含4μg TNF的RPMI-1640培養液，3個陰性對照孔各加100μl RPMI-1640培養液。繼續培養18～24小時。
3、甩去培養液，用PBS小心洗滌一次，每孔加0.1ml 10%甲醇溶液固定細胞30秒鍾。
4、吸去甲醇溶液，每孔加0.1ml結晶紫染液，室溫中放置20分鍾。
5、輕輕甩去染色液，用蒸餾水洗滌各孔，將培養板倒置於吸水紙上吸干水分。自然乾燥或37℃烘乾。此板可以在室溫中長期保存。
6、測定前，每孔加0.1ml 33%醋酸脫色，充分振盪後在570nm處測定光吸收度。用光吸收度（OD）值對樣品稀釋度作圖，比較標准品曲線和待檢樣品曲線即可得到待測樣品中的細胞因子活性
2）NBB檢測法：
1、在用細胞因子處理靶細胞以後傾去培養液，倒置培養板於吸水紙上吸干培養液。再用100μl磷酸緩沖鹽水小心洗去死細胞，用吸水紙吸干培養液。
2、每孔加100μl NBB染液，室溫中染色30分鍾。輕輕染液。用吸水紙吸干染液。</P< p>
3、每孔加100μl福爾馬林固定液固定15分鍾。用自來水輕輕洗去固定液，倒置培養板，用吸水紙吸干染液。
4、每孔加150μl 50mmol/L氫氧化鈉。輕輕振盪培養板直到染料全部溶解並均勻分布。在分光光度計上讀取各孔在620nm處的光密度（OD）值。計算TNF的活性。
3）美藍染色檢測法：
1、用細胞因子處理靶細胞，在含100μL細胞培養液的檢測孔中，每孔加0.02ml 25%戊二醛固定活細胞15分鍾，用自來水緩緩洗去死細胞和固定液。
2、每孔加0.1ml 0.05%美藍染液，染色20分鍾，用自來水緩緩沖凈染液，晾乾。
3、每孔加0.2ml 0.33mol/L鹽酸溶解美藍，振盪混勻。在665nm波長處測定光吸收度。計算TNF的活性。
4）中性紅染色檢測法：
1、用細胞因子處理靶細胞，在含100μL細胞培養液的檢測孔中，每孔加50μl 5%中性紅染液。繼續培養2小時。
2、小心倒去培養液。用200μl Hanks液洗滌細胞1次。小心倒去培養液，減少細胞丟失。
3、每孔加100μl脫色液，在搖床中輕輕搖晃溶解30分鍾。在550nm波長處測定OD值。
十、直接計數細胞：
1、如果靶細胞是帖壁細胞，在細胞因子作用適當時間後，用生理鹽水洗去死亡細胞，用0.25%胰蛋白酶液消化細胞。加適量生理鹽水吹打，使細胞分散成單個細胞。直接在血細胞計數板上計數細胞。
2、如果靶細胞是懸浮細胞，則需要用染色劑區分死細胞和活細胞然後再計數。通常用台盼藍染色細胞，活細胞可以排除進入細胞的台盼藍而不著染，死細胞著染呈深藍色。
3、計數血細胞計數板上4個大方格中的全部活細胞，按下式計算活細胞數：活細胞數（個/ml）＝計數的全部活細胞數×10 000×2×1/4。

Ⅳ 如何用營養缺陷型微生物檢測出環境中的「三致」化學物質

艾姆氏試驗是一種利用細菌營養缺陷型的回復突變來檢測環境或食品中是否存在「三致」物質的簡便有效的方法。在含待測可疑「三致」物質例如黃麴黴素，二甲氨基偶氮苯等的試樣中加入鼠肝勻漿液，經一段時間保溫後吸入濾紙片中然後將濾紙片放置於上述平板中央，經培養後出現了三種情況：①在平板上無大量菌落產生，說明試樣中不含誘變劑②在紙片周圍有一個抑制圈，其外周出現大量菌落，說明試樣中有某種高濃度的誘變劑存在③在紙片周圍長有大量菌落，說明試樣中有濃度適中的誘變劑存在

Ⅳ 病原微生物中細菌常見檢測方法有哪些

1、快速測試片技術法

快速測試片是指以紙片、紙膜、膠片等作為培養基載體，將特定的培養基和顯色物質附著在上面，通過微生物在上面的生長、顯色來測定食品中微生物的方法。

細菌總數檢測紙片的研製始於 20 世紀 80 年代，其主要優點是簡便、實用、經濟、操作性強。近年來以濾紙和美國某公司的 Petrifilm 為載體的測試片已開始被廣泛應用。

2、生物電化學方法

生物電化學方法是指通過電極測定微生物產生或消耗的電荷，從而提供分析信號的方法。微生物在滋生代謝過程中，培養基的電化學性質如電流、電位、電阻和電導等會發生變化，所以可以通過檢測分析這些電化學參量的變化來實現對微生物的快速測定。

常見的有：阻抗分析法、電位分析法、電流分析法等。生物電化學方法具有測量快速、直觀、操作簡單、測量設備成本低和信號的可控性等特點。

3、微菌落技術

微菌落是指細菌生長繁殖早期在固相載體上所形成的只能藉助於顯微鏡觀察的微小菌落。微菌落技術具有快速、經濟、實用的特點，其研究始於 20 世紀50年代，定量測定技術從 20 世紀 70 年代開始，國外已有報道將該法應用於水、食品中細菌總數的快速檢測。

4、氣相色譜法

氣相色譜應用到微生物的檢測中，主要是依據不同微生物的化學組成或其產生的代謝產物各異，利用上述色譜檢測可直接分析各種體液中的細菌代謝產物、細胞中的脂肪酸、蛋白質、氨基酸、多肽、多糖等，以確定病原微生物的特異性化學標志成分，協助病原診斷和檢測。

5、高效液相色譜法

利用高效液相色譜檢測可分析各種體液中的細菌代謝產物、病原微生物等，以確定病原微生物的特異性化學標志成分，協助病原診斷和檢測。

Ⅵ 什麼是營養缺陷型細菌

1. 無法合成某種生物必需的物質，通常是酶或氨基酸

2. 需要在富含這種物質的培養基中才能存活
   

3. 可以用來挑選一些突變型菌落