如何設計引物擴增的方法

1. 如何設計引物

一般是通過設計軟體，例如oligo6，primer5等，你可以在網上搜一下引物設計軟體下載和使用說明，是比較容易的。
至於設計引物的一般原則如下：
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序列選取應在基因的保守區段
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避免引物自身或與引物之間形成4個或4個以上連續配對，避免引物自身形成環狀發卡結構
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典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨特性，並降低序列存在於非目的序列位點的可能性。但是長度大於24核苷的引物並不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產量。
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Tm值在55－65℃（因為60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40%－60%
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引物之間的TM相差避免超過2℃
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引物的3』端避免使用鹼基A，引物的3』端避免出現3個或3個以上連續相同的鹼基
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為避免的擴增，引物設計最好能跨兩個外顯子。
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Taqman探針PCR要求片段長度在80bp－150bp
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引物末端（最後5個核苷酸）不能有超過2個的G和C。

2. pcr的技術的主要步驟及pcr引物設計的一般原則有哪些

PCR的技術的主要步驟及PCR引物設計的一般原則分述如下：

PCR的技術的主要步驟：

1、DNA變性：（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。

2、退火：（60℃-65℃）：系統溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈。

3、延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP為原料，從引物的3′端開始以從5′→3′端的方向延伸，合成與模板互補的DNA鏈。

每一循環經過變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。現在有些PCR因為擴增區很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時間內復制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行，以減少一次升降溫過程，提高了反應速度。

2、引物設計的基本原則

1、引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。

2、引物鹼基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C 過多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列參照。

3、引物內部不應出現互補序列。

4、兩個引物之間不應存在互補序列，尤其是避免3 ′端的互補重疊。

5、引物與非特異擴增區的序列的同源性不要超過70%，引物3′末端連續8個鹼基在待擴增區以外不能有完全互補序列，否則易導致非特異性擴增。

6、引物3『端的鹼基，特別是最末及倒數第二個鹼基，應嚴格要求配對，最佳選擇是G和C。

7、引物的5 ′端可以修飾。如附加限制酶位點，引入突變位點，用生物素、熒光物質、地高辛標記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。

(2)如何設計引物擴增的方法擴展閱讀

PCR技術的基本原理 類似於DNA的 天然復制過程，其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。

PCR是一種體外DNA 擴增技術，是在模板DNA、引物和4種脫氧核苷酸存在的條件下，依賴於DNA聚合酶的酶促合反應，將待擴增的DNA片段與其兩側互補的寡核苷酸鏈引物經「高溫變性——低溫退火——引物延伸」三步反應的多次循環，使DNA片段在數量上呈指數增加，從而在短時間內獲得我們所需的大量的特定基因片段。

在環境檢測中，靶核酸序列往往存在於—個復雜的混合物如細胞提取液中，且含量很低，對於探測這種復雜群體中的特異微生物或某個基因，雜交就顯得不敏感。使用PCR技術可將靶序列放大幾個數量級，再用探針雜交探測對被擴增序列作定性或定量研究分析微生物群體結構。PCR技術常與其他技術結合起來使用， 如RT-PCR、競爭PCR、巢式PCR、RAPf)、ARDRA等。

第一代PCR就是常見的定性PCR技術，它採用普通PCR儀來對靶基因進行擴增，採用瓊脂糖凝膠電泳來對產物進行分析。第二代PCR就是熒光定量PCR技術（Real-Time PCR，qPCR），它通過在反應體系中加入能指示反應進程的熒光試劑來實時監測擴增產物的積累，藉助熒光曲線的Cq值來定量起始靶基因的濃度。

第三代PCR技術--數字PCR（Digital PCR，dPCR，Dig-PCR），是一種全新的對核酸進行檢測和定量的方法。它採用直接計數目標分子而不再依賴任何校準物或外標，即可確定低至單拷貝的待檢靶分子的絕對數目。

PCR晶元技術PCR儀器發展的趨勢之一變得更加微型化，PCR晶元就是在這種趨勢下誕生的。PCR晶元就是在微型的載體上進行PCR反應，是微型化的PCR儀。晶元PCR不僅節省了大量反應試劑因此降低了實驗成本，還有助於提高反應速度。

3. 若給一指定DNA序列並需要通過PCR擴增此序列,如何設計擴增引物

你要分別得到這條序列的上下游的序列，然後再上下游區設計引物，如果片段過大還需要設計中間引物

4. 怎麼設計擴全長的引物

您應該使用巢式PCR來做這個實驗。

無論您是先提RNA再做反轉錄，還是直接從DNA中獲得基因，考慮到模板的復雜性，都應當使用巢式PCR。建議您先從目的基因的上下游設計一段引物，即外引物，再根據目的基因上下游設計一段內引物。

外引物不在目的基因上，可以在目的基因上下游100bp以內，這就可以利用引物設計找出最優秀的引物，提高了第一次PCR的成功率。將第一次PCR產物做模板，進行第二次PCR，這樣如果P出了大小正確的條帶，就可以肯定是你的目的條帶。因為兩次特異性擴增再加上大小正確，這樣的總特異性是極高的。

另外，由於在第二次PCR過程中，模板是第一次PCR產物，成分單一，就是內引物再糟糕，也沒有問題，這就規避了你提到的「那如果在CDS區兩端設計不出引物怎麼辦？」這個問題。

您明白了嗎？歡迎追問！

5. 要擴增全長cDNA 引物怎樣設計

其實要看你的目的，如果你是要擴增基因組的基因的話，那你就去ncbi－genome上面找到你要研究的那段基因，如果基因不太長1kbp以內的話，那就可以直接選取兩頭約20bp的片段設計互補引物。如果基因太長了，那就設計多段引物，一段一段把基因pcr出來再連在一起。如果你要擴增的是cDNA的話，也就是蛋白質的cDNA序列的話，就去ncbi－gene裡面找到相應蛋白質的序列，再設計引物，以cDNA文庫位模版把目標基因給pcr出來。

6. 實時熒光定量pcr引物怎麼設計

1、查找該物種或近緣物種信息，看是否能確定內含子序列的位置，在CDS上設計跨內含子的引物，以避免基因組污染；
2、擴增片段大小最好在200bp左右，太大會影響擴增效率；
3、最好一次分別設計兩條上游（距離較近）和下游引物（距離較近），組合成4個擴增片段；
4、用任何方法或軟體設計好的引用都要用少量cDNA樣本來驗證引物擴增效果：主要是有無二聚體？有無非特異性擴增？
5、篩選出一對最滿意的引物上機，祝你實驗順利。

7. 如果要使用PCR擴增一段已知的DNA序列,要如何設計引物

把這段基因輸入設計軟體里，調節引物位置，使變性溫度在94度，退火溫度=Tm-（5到10度） 延伸溫度72度左右，滿足這些條件基本就可以了，當然還要根據實際情況多次實驗得到最佳引物。如果你要擴增整個的基因，引物必須要在起始密碼子之前，或包含起始密碼子。最後加上酶切位點就可以了。

8. 怎樣設計PCR引物

引物設計需要注意的地方很多，在大多數情況下，我們都是在知道已知模板序列時進行PCR擴增的。
設計的目的是在兩個目標間取得平衡：擴增特異性和擴增效率。引物分析軟體將試圖通過使用每一引物設計變化的預定值在這兩個目標間取得平衡。設計引用有一些需要注意的基本原理：
① 引物長度
一般引物長度為18~30鹼基。總的說來，決定引物退火溫度（Tm值）最重要的因素就是引物的長度。有以下公式可以用於粗略計算引物的退火溫度。
在引物長度小於20bp時：[4(G+C)+2(A+T)]-5℃
在引物長度大於20bp時：62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃

另外有許多軟體也可以對退火溫度進行計算，其計算原理會各有不同，因此有時計算出的數值可能會有少量差距。為了優化PCR反應，使用確保退火溫度不低於54℃的最短的引物可獲得最好的效率和特異性。

引物長度的上限並不很重要，主要與反應效率有關。由於熵的原因，引物越長，它退火結合到靶DNA上形成供DNA聚合酶結合的穩定雙鏈模板的速率越小。

② GC含量
一般引物序列中G+C含量一般為40%~60%，一對引物的GC含量和Tm值應該協調。若是引物存在嚴重的GC傾向或AT傾向則可以在引物5』端加適量的A、T或G、C尾巴。

③ 退火溫度
退火溫度需要比解鏈溫度低5℃，如果引物鹼基數較少，可以適當提高退火溫度，這樣可以使PCR的特異性增加；如果鹼基數較多，那麼可以適當減低退火溫度，是DNA雙鏈結合。一對引物的退火溫度相差4℃～6℃不會影響PCR的產率，但是理想情況下一對引物的退火
溫度是一樣的，可以在55℃～75℃間變化。

④ 避免擴增模板的二級結構區域
選擇擴增片段時最好避開模板的二級結構區域。用有關計算機軟體可以預測估計目的片段的穩定二級結構，有助於選擇模板。實驗表明，待擴區域自由能（△G）小於58.6lkJ/mol時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區域時，用7-deaza-2』-脫氧GTP取代dGTP對擴增
的成功是有幫助的。

⑤ 與靶DNA的錯配
當被擴增的靶DNA序列較大的時候，一個引物就有可能與靶DNA的多個地方結合，造成結果中有多個條帶出現。這個時候有必要先使用BLAST軟體進行檢測，網址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。

9. pcr如何設計引物如何進行擴增

若是根據已知序列擴增未知物種的相應序列，可以根據先根據已知序列進行blast搜索，發現其他同源序列，保存後進行比對，找出其中較保守區域，並根據primer或oligo等軟體對某條序列進行分析，搜索其中適合做引物的片段，並人工修正不合適部分。也可以設計成兼並引物。
如果已經獲得序列，只是需要設計引物將其中某段擴增出來，相對就簡單些了，可以直接用上述軟體進行設計就可以了。
當然，實際操作起來還要看運氣啦。------更多交流，中國西部生命科學論壇

10. 如何設計引物，擴增目的基因的ORF

如何設計引物，擴增目的基因的ORF
無論您是先提RNA再做反轉錄,還是直接從DNA中獲得基因,考慮到模板的復雜性,都應當使用巢式PCR.建議您先從目的基因的上下游設計一段引物,即外引物,再根據目的基因上下游設計一段內引物.
外引物不在目的基因上,可以在目的基因上下游100bp以內,這就可以利用引物設計軟體找出最優秀的引物,提高了第一次PCR的成功率.將第一次PCR產物做模板,進行第二次PCR,這樣如果P出了大小正確的條帶,就可以肯定是你的目的條帶.因為兩次特異性擴增再加上大小正確,這樣的總特異性是極高的.
另外,由於在第二次PCR過程中,模板是第一次PCR產物,成分單一,就是內引物再糟糕,也沒有問題,這就規避了你提到的「那如果在CDS區兩端設計不出引物怎麼辦?」這個問題.