外源性基因連接方法

❶ 外源性dna離開染色體是不能復制的，將什麼與什麼連接

是這樣的：有絲分裂前期，復制是指DNA和蛋白質的復制，復制後每一條染色體實際上包括兩條並列的姐妹染色單體，這兩條並列的姐妹染色單體之間不是完全分離開的，而是由一個共同的著絲點連接著，只要著絲點沒有分離，這兩個姐妹染色單體仍然是一個染色體。

線性DNA末端端粒部分並不是嚴格按照沃森和克里克的配對規則,形成了復雜的發卡結構.
端粒酶是一種核糖核蛋白復合物,具有逆轉錄酶的性質,以物種專一的內在RNA為模板,把合成的DNA添加到染色體的3』 端
因此,端粒復制時,沒有什麼前導鏈和後隨鏈.

❷ 常用的目的基因與載體的連接方法有哪些

目前已知有三種方法可以用來在體外連接DNA片段：
第一種方法是，用DNA連接酶連接具有互補粘性末端的DNA片段；（人教版高中生物選修3中提到的E·coliDNA連接酶，來源於大腸桿菌，可用於連接粘性末端；T4DNA連接酶，來源於T4噬菌體，可用於連接粘性末端和平末端，但連接效率低。）
第二種方法是，用T4DNA連接酶直接將平末端的DNA片段連接起來，或是用末端脫氧核苷酸轉移酶給具平末端的DNA片段加上poly（dA）-poly（dT）尾巴之後，再用DNA連接酶將它們連接起來；
第三種方法是，先在DNA片段末端加上化學合成的銜接物或接頭，使之形成粘性末端之後，再用DNA連接酶將它們連接起來。這三種方法雖然互有差異，但共同的一點都是利用DNA連接酶所具有的連接和封閉單鏈DNA的功能。
粘性末端DNA片段的連接
DNA連接酶最突出的特點是，它能夠催化外源DNA和載體分子之間發生連接作用，形成重組的DNA分子。
平末端DNA片段的連接
常用的平末端DNA片段連接法，主要有同聚物加尾法、銜接物連接法及接頭連接法。

❸ 要將外源基因轉入到生物體中包括哪些主要步驟

1、獲取目的基因 2、形成重組DNA分子 3、將重組DNA分子導入受體細胞 4、篩選含有目的基因的受體細胞 5、目的基因表達

• 工具：限制性核酸內切酶（切割磷酸二酯鍵）、DNA連接酶（鏈接磷酸二酯鍵）、載體（主 要為質粒、原核小型環狀DNA）

• 獲取目的基因：若序列已知則用PCR擴增或化學方法合成：若序列未知則建立基因文庫，從中獲取

• 形成重組DNA分子：用同一限制性核酸內切酶切割質粒和目的基因形成相同的粘性末端，再用目的基因鏈接

• 將重組DNA分子導入受體細胞：若受體為動物用顯微注射法：若受體為植物用農桿菌轉化法或花粉管法：若受體為微生物用氯化鈣處理法（增加細胞壁通透性）

• 篩選含有目的基因的受體細胞：利用載體上的標記基因進行篩選

• 目的基因表達：個體水平上的性狀，分子水平上的相應蛋白質、mRNA

❹ 簡述 如何將外源DNA連接到載體上

先用限制性核酸內切酶分別處理載體及目的基因，再用DNA連接酶連接。然後用載體上的標記基因篩選重組DNA，然後導入受體細胞，轉基因完成

❺ 外源DNA和質粒載體的連接反應原理與步驟在哪些生物論壇可以了解求大神幫助

在生物幫那裡就可以找到詳細的介紹，樓主有空的話可以自己去詳細的了解一下。那裡提供最新、領先、精準、高效、全面的生物產品和技術信息。 外源DNA片段和線狀質粒載體的連接，也就是在雙鏈DNA5'磷酸和相鄰的3'羥基之間 形成的新的共價鏈。如質粒載體的兩條鏈都帶5'磷酸，可生成4個新的磷酸二酯鏈。但如果質粒DNA已去磷酸化，則吸能形成2個新的磷酸二酯鏈。在這種情況下產生的兩個雜交體分子帶有2個單鏈切口，當雜本導入感受態細胞後可被修復。相鄰的5'磷酸和3'羥基間磷酸二酯鍵的形成可在體外由兩種不同的DNA連接酶催化，這兩種酶就是大腸桿菌DNA連接酶和T4噬菌體DNA連接酶。實際上在有克隆用途中，T4噬菌體DNA連接酶都是首選的用酶。這是因為在下沉反應條件下，它就能有效地將平端DNA片段連接起來。 DNA一端與另一端的連接可認為是雙分子反應，在標准條件下，其反應速度完全由互相匹配的DNA末端的濃度決定。不論末端位於同一DNA分子(分子內連接)還是位於不同分子(分子間連接)，都是如此。現考慮一種簡單的情況，即連接混合物中只含有一種DNA，也就是用可產生粘端的單個限制酶切割制備的磷酸化載體DNA。在瓜作用的底物。如果反應中DNA濃度低，則配對的兩個末端同一DNA分子的機會較大(因為DNA分子的一個末端找到同一分子的另一末端的概率要高於找到不同DNA分子的末端的概率)。這倦，在DNA濃度低時，質粒DNA重新環化將卓有成效。如果連接反應中DNA濃度有所增高，則在分子內連接反應發生以前，某一個DNA分子的末端碰到另一DNA分子末端的可能性也有所增大。因此在DNA濃度高時，連接反的初產物將是質粒二聚體和更大一些的寡聚體。Dugaiczyk等(1975;同時參見Bethesda Res,Lab.出版的Focus第2卷，第2、3期合刊)從理論上探討了DNA濃度對連接產物性質的影響。簡而言之，環化的連接產物與多聯體連接產物的比取決於兩個參數：j和i。j是DNA分子的一個末端在同一分子的另一末端附近的有效濃度，j的數值是根據如下一種假設作出的：沉吟液中的DNA呈隨機捲曲。這樣，j與DNA分子的長度成反比(因為DNA越長，某一給定分子的兩末端的越不可能相互作用)，因此j對給定長度的DNA分子來說是一個常數，與DNA深度無關。j=[3/(3πlb0)]3/2其中l是DNA長度，以cm計，b是隨機捲曲的DNA區段的長度。b的值以緩沖液的離子強度為轉移，而後者可影響DNA的剛度。 可以參考： That can help you.Click www.bio1000.com/zt/protein/225128.html, Sign in account. i是溶液中所有互補末端的深度的測量值，對於具有自身互補粘端的雙鏈dna而言，i=2NoMx10-3末端/ml這里No是阿佛伽德羅常數，M是DNA的摩爾濃度(單位：mol/L)。理論上，當j=i時，給定DNA分子的一個末端與同一分子的另一末端，以及與不同分子的末端相接觸的可能性相等。因而在這樣的條件下，在反應的初始階段中，環狀分子與多聯體分子的生成速率相等。而當j>i時，有利於重新環化;當i>j，則有利於產生多聯體。圖1.9顯示了DNA區段的大小與連接反應混合物中j:i之比分別為0.5、1、2和5時所需DNA濃度之間關系(Dugaiczyk等，1985)。 現在考慮如下的連接反應混合物：其中除線狀質粒之外，還含有帶匹配末端的外源DNA片段。對於一個給定的連接混合物而言，產生單體環狀重組基因組的效率不僅受反應中末端的絕對濃度影響， 而且還受質粒和外源DNA末端的相對濃度的影響。當i是j的2-3倍(即末端的絕對濃度足以滿足分子間連接的要求，而又不致引起大量寡聚體分子的形成時)外源DNA末端濃度的2倍時，有效重組體的產量可達到最大。這些條什下，連接反應終產物的大約40%都是由單體質粒與外源DNA所形成的嵌合體。當連接混合物中線瘃質粒的量恆定(j:i=3)而帶匹配末端的外源DNA的量遞增時，這種嵌合體在連接反應之末的理論產量。 涉及帶粘端的線狀磷酸化質粒DNA的連接反應應包含： 1)足量的載體DNA，以滿足j:i>1和j:i<3。對一個職pUC18一般大小的質粒，這意味著連接反應中應含有載體DNA為20-60μg/ml。 2)未端濃度等於或稍高於載體DNA的外源DNA，如外源DNA濃度比載體低得多，在效連接產物的數量會很低，這樣就很難別小部分帶重組抽粒的轉化菌落。這種情況下，可考慮採用一些步驟來減少帶非重組質粒的背景菌落。如用磷酸酶處理線狀質粒DNA或發跡克隆策略以便通過定向克隆的方法構建重組質粒。

❻ 請教，外源基因是怎樣整合到基因組上

T-DNA是Ti質粒上的一個片斷。利用農桿菌等微生物可將人工合成的目的基因片段通過T-DNA載體轉移到受體植物的基因組中，是基因工程的重要技術手段。（度娘復制，個人認為沒錯。最佳答案別誤導）

❼ 將外源基因導入原核細胞或真核細胞分別有哪些方法

1 物理方法
1.1 DNA直接注射法: 是目的基因導入的最簡單方法, 但注入量有限, 能夠接觸到的腫瘤細胞有限,故獲得的腫瘤細胞轉化率很低, 多通過腫瘤局部多點注射給葯。
1.2 顆粒轟擊技術:將目的基因包被金屬以後,利用高壓發射裝置, 加速包裹目的基因的金屬顆粒進入細胞,從而提高腫瘤細胞的轉化率。
2 化學方法
即用化學方法構建非病毒載體系統，借之完成基因轉導。主要包括以下兩種。
2.1 脂質體載體：方法具有安全、簡單、低毒、無免疫原性等優點，適用於注射方法進行器官靶向性轉移並有一定的轉移效率。是除病毒載體轉移方法之外的另一種有價值的體內基因轉移方法。多用於體外轉化細胞，或通過瘤組織內注射〔1〕進行體內轉化,並已有少數臨床應用的報告。目前常用的是陽離子脂質體(商品名為Lipofectin)。它可自發的與DNA形成復合物，保護外源DNA不被核酸酶降解，具有制備簡單、安全無毒、無免疫原性、重復性、對基因片段大小無限制且轉染操作方便等優點。由於它可與細胞膜直接融合而能有效地避免溶酶體破壞，故遠比傳統的脂質體效率高。缺點是靶向性有限。Nishikawa等〔2〕從BALB/c小鼠的尾靜脈注射以熒光素酶基因為報告基因的質粒DNA-脂質體復合物， 發現肺、肝、脾等器官組織中都有熒光素酶基因及其產物，持續表達超過3個月。常規脂質體易被網狀內皮系統(RES)細胞攝取，在巨噬細胞本身可成為靶細胞的部位，RES的這種親合性是有利的。Hasegawa等〔3〕採用日本血凝病毒( hemagglutinating virus of Japan , HVJ)脂質體為載體，用HSV-tk/Gcv系統治療肝癌發現，在體外試驗中當Gcv的濃度100microg/ml時幾乎所有腫瘤均被殺死，甚至當轉導率只有20％時，也有1/3腫瘤被消滅。此方法重復應用效果更佳，且皮下注射未見明顯的炎症反應。
2.2 受體介導法：利用肝細胞上富含轉移因子和糖蛋白受體的特點，人工合成多聚陽離子氨基酸，進而連接轉移因子(或糖蛋白)和目的基因構成復合物，通過與肝細胞表面的受體結合來實現目的基因的轉移。此法靶向性好，但受體介導的內吞小泡會被轉運到溶酶體，易被溶酶體降解而造成目的基因表達時間短暫，表達效率低下。利用氯哇抑制溶酶體酶或腺病毒與內吞小泡相融合而將其破壞釋放出外源DNA，可提高轉化效率。
3 生物學方法
主要通過構建病毒載體來完成。
3.1 逆轉錄病毒(retrovirus，Rv):構建簡單，裝載外源基因容量最大達8kb，整合入宿主細胞基因組而無病毒蛋白表達。但僅能感染分裂期細胞，體外製備滴度較低，且其隨機整合有引起「插入性突變」的可能〔4〕。
3.2 腺病毒(adenovirus, Adv): 為近年肝細胞肝癌基因治療中報告最多的一種病毒載體〔5〕。體外製備滴度較大 ，裝載外源基因容量最大達35kb，不整合入宿主細胞基因組因而避免插入突變的危險，能感染分裂細胞和非分裂細胞。但易引起宿主免疫反應而使轉染效率下降，且大劑量靜脈給予可導致嚴重的肝臟炎症反應，因此通過全身給葯受到限制。Nagao等〔6〕發現瘤內注射重組Adv後，目的基因可有效表達，但表達時間短暫，重復注射後表達效率降低且誘發體液和細胞免疫反應。
3.3 單純皰疹病毒：單純皰疹病毒(herps simplex virus，HSV)對非分裂細胞有天然的親合力，裝載外源基因容量達30kb，體外製備滴度接近腺病毒。但構建時難以除去與裂解細胞有關的基因而對細胞毒性大〔7〕。
3.4 腺相關病毒：腺相關病毒(adeno-associated virus，AAV)在人類不引起任何病理性後果，它能感染非分裂S相細胞，還能將基因轉人非周期(noncyling)腫瘤細胞。AAV是一種缺陷前病毒，對人類無致病性。能用於運載外源性重組基因組，已應用於肝和肝癌細胞的治療基因轉移〔8〕。
3.5 其他病毒：痘苗病毒〔9〕(vaccini virus)可以獨立在細胞之中復制和轉錄，並能以較強的方式表達多個腫瘤抗原。桿狀病毒〔10〕(bacul virus)能夠感染肝細胞和肝腫瘤細胞，並能增強肝細胞腫瘤壞死因子a(TNFa)、IL-1a、IL-lβ的表達。

❽ 外源基因是如何整合到受體細胞的DNA上的

用相同的限制性的內切酶，把外緣基因部分切出來，受體細胞的DNA上也打開同樣的缺口，這是具有了相同的黏性末端，混合後，然後再用DNA連接酶連接，即可把外源基因是整合到受體細胞的DNA上

❾ 基因片段用什麼拼接怎樣拼接

粘性末端法,又稱限制性內切酶酶切法。要求兩種DNA分子具備同一個限制性內切酶切點,能產生互補的粘性末端。主要缺點是較難選擇重組質粒,而且當外源DNA片段的長度超過載體DNA較多時,形成的重組質粒的轉化率較低

❿ 分子克隆中常用的連接方法及原理

方法：DNA片段的制備、載體的選擇、片段與載體連接。在分子水平上提供一種純化和擴增特定DNA片段的方法。

原理：外源DNA片段和線狀質粒載體的連接，也就是在雙鏈DNA5'磷酸和相鄰的3'羥基之間形成的新的共價鏈。如質粒載體的兩條鏈都帶5'磷酸，可生成4個新的磷酸二酯鏈。

但如果質粒DNA已去磷酸化，則吸能形成2個新的磷酸二酯鏈。在這種情況下產生的兩個雜交體分子帶有2個單鏈切口，當雜本導入感受態細胞後可被修復。

載體DNA的選擇

質粒是細菌染色體外遺傳因子，DNA呈環狀，大小為1-200千鹼基對(kb)。在細胞中以游離超螺旋狀存在，很容易制備。質粒DNA可通過轉化引入寄主菌。在細胞中有兩種狀態，一是「緊密型」；二是「鬆弛型」。此外還應具有分子量小，易轉化，有一至多個選擇標記的特點。質粒型載體一般只能攜帶10kb以下的DNA片段，適用於構建原核生物基因文庫，cDNA庫和次級克隆。

以上內容參考：網路-分子克隆