如何構建載體的方法

『壹』 如何構建載體

1 啟動子的選用和改造外源基因表達量不足往往是得不到理想的轉基因植物的重要原因。由於啟動子在決定基因表達方面起關鍵作用，因此，選擇合適的植物啟動子和改進其活性是增強外源基因表達首先要考慮的問題。目前在植物表達載體中廣泛應用的啟動子是組成型啟動子，例如，絕大多數雙子葉轉基因植物均使用 C a M V 3 5 S 啟動子，單子葉轉基因植物主要使用來自玉米的 U b i q u i t i n 啟動子和來自水稻的 A c t i n l 啟動子。在這些組成型表達啟動子的控制下，外源基因在轉基因植物的所有部位和所有的發育階段都會表達。然而，外源基因在受體植物內持續、高效的表達不但造成浪費，往往還會引起植物的形態發生改變，影響植物的生長發育。為了使外源基因在植物體內有效發揮作用，同時又可減少對植物的不利影響，目前人們對特異表達啟動子的研究和應用越來越重視。已發現的特異性啟動子主要包括器官特異性啟動子和誘導特異性啟動子。例如，種子特異性啟動子、果實特異性啟動子、葉肉細胞特異性啟動子、根特異性啟動子、損傷誘導特異性啟動子、化學誘導特異性啟動子、光誘導特異性啟動子、熱激誘導特異性啟動子等。這些特異性啟動子的克隆和應用為在植物中特異性地表達外源基因奠定了基礎。例如，瑞士 C I B A - G E I G Y 公司使用 P R - I A 啟動子控制轉基因煙草中 B t 毒蛋白基因的表達，由於該啟動子可受水楊酸及其衍生物誘導，通過噴酒廉價、無公害的化學物質，誘導抗蟲基因在蟲害重發生季節表達，顯然是一個十分有效的途徑。在植物轉基因研究中，使用天然的啟動子往往不能取得令人滿意的結果，尤其是在進行特異表達和誘導表達時，表達水平大多不夠理想。對現有啟動子進行改造，構建復合式啟動子將是十分重要的途徑。例如， N i 等人將章魚鹼合成酶基因啟動子的轉錄激活區與甘露鹼合成酶基因啟動子構成了復合啟動子， G U S 表達結果表示：改造後的啟動子活性比 3 5 S 啟動子明顯提高。吳瑞等人將操作誘導型的 P I - I I 基因啟動子與水稻 A c t i n l 基因內含子 1 進行組合，新型啟動子的表達活性提高了近 1 0 倍（專利）。在植物基因工程研究中，這些人工組建的啟動子發揮了重要作用。 2 增強翻譯效率為了增強外源基因的翻譯效率，構建載體時一般要對基因進行修飾，主要考慮三方面內容： 2 . 1 添加 5 ｀ - 3 ｀ - 非翻譯序列許多實驗已經發現，真核基因的 5 ｀ - 3 ｀ - 非翻譯序列（ U T R ）對基因的正常表達是非常必要的，該區段的缺失常會導致 m R N A 的穩定性和翻譯水平顯著下降。例如，在煙草花葉病毒（ T M V ）的 1 2 6 k D a 蛋白基因翻譯起始位點上游，有一個由 6 8 b p 核苷酸組成的Ω元件，這一元件為核糖體提供了新的結合位點，能使 G u s 基因的翻譯活性提高數十倍。目前已有許多載體中外源基因的 5 ｀ - 端添加了Ω翻譯增強序列。 I n g e l b r e c h t 等曾對多種基因的 3 ｀ - 端序列進行過研究，發現章魚鹼合成酶基因的 3 ｀ - 端序列能使 N P T I I 基因的瞬間表達提高 2 0 倍以上。另外，不同基因的 3 ｀ - 端序列增進基因表達的效率有所不同，例如， r b c S 3 ｀ - 端序列對基因表達的促進作用比查爾酮合酶基因的 3 ｀ - 端序列高 6 0 倍。 2 . 2 優化起始密碼周邊序列雖然起始密碼子在生物界是通用的，然而，從不同生物來源的基因各有其特殊的起始密碼周邊序列。例如，植物起始密碼子周邊序列的典型特徵是 A A C C A U G C , 動物起始密碼子周邊序列為 C A C C A U G ，原核生物的則與二者差別較大。 K o z a k 詳細研究過起始密碼子 A T G 周邊鹼基定點突變後對轉錄和翻譯所造成的影響，並總結出在真核生物中，起始密碼子周邊序列為 A C C A T G G 時轉錄和翻譯效率最高，特別是 - 3 位的 A 對翻譯效率非常重要。該序列被後人稱為 K o z a k 序列，並被應用於表達載體的構建中。例如，有一個細菌的幾丁質酶基因，原來的起始密碼周邊序列為 U U U A U G G ，當被修飾為 A C C A U G G ，其在煙草中的表達水平提高了 8 倍。因此，利用非植物來源的基因構建表達載體時，應根據植物起始密碼子周邊序列的特徵加以修飾改造。 2 . 3 對基因編碼區加以改造 如果外源基因是來自於原核生物，由於表達機制的差異，這些基因在植物體內往往表達水平很低，例如，來自於蘇雲金芽孢桿菌的野生型殺蟲蛋白基因在植物中的表達量非常低，研究發現這是由於原核基因與植物基因的差異造成了 m R N A 穩定性下降。美國 M o n s a n t o 公司 P e r l a k 等人在不改變毒蛋白氨基酸序列的前提下，對殺蟲蛋白基因進行了改造，選用植物偏愛的密碼子，增加了 G C 含量，去除原序列下影響 m R N A 穩定的元件，結果在轉基因植株中毒蛋白的表達量增加了 3 0 ～ 1 0 0 倍，獲得了明顯的抗蟲效果。 3 消除位置效應當外源基因被移人受體植物中之後，它在不同的轉基因植株中的表達水平往往有很大差異。這主要是由於外源基因在受體植物的基因組內插入位點不同造成的。這就是所謂的 " 位置效應 " 。為了消除位置效應，使外源基因都能夠整合在植物基因組的轉錄活躍區，在目前的表達載體構建策略中通常會考慮到核基質結合區以及定點整合技術的應用。核基質結合區（ m a t r i x a s s o c i a t i o n r e g i o n , M A R ）是存在於真核細胞染色質中的一段與核基質特異結合的 D N A 序列。一般認為， M A R 序列位於轉錄活躍的 D N A 環狀結構哉的邊界，其功能是造成一種分割作用，使每個轉錄單元保持相對的獨立性，免受周圍染色質的影響。有關研究表明，將 M A R 置於目的基因的兩側，構建成包含 M A R - g e n e - M A R 結構的植物表達載體，用於遺傳轉化，能明顯提高目的基因的表達水平，降低不同轉基因植株之間目的基因表達水平的差異，減少位置效應。例如， A l l e n 等人研究了異源 M A R （來自酵母）和同源 M A R （來自煙草）對 G u s 基因在煙草中表達的影響，發現酵母的 M A R 能使轉基因表達水平平均提高 1 2 倍，而煙草本身的 M A R 能使轉基因的表達水平平均提高 6 0 倍。使用來源於雞溶菌酶基因的 M A R 也可起到同樣作用。另一可行的途徑是採用定點整合技術，這一技術的主要原理是，當轉化載體含有與寄主染色體同源的 D N A 片段時，外源基因可以通過同源重組定點整合於染色體的特定部位。實際操作時首先要分離染色體轉錄活性區域的 D N A 片段，然後構建植物表達載體。在微生物的遺傳操作中，同源重組定點整合已成為一項常規技術，在動物中外源基因的定點整合已獲得成功，而在植物中除了葉綠體表達載體可實現定點整合以外，細胞核轉化中還很少有成功的報道。 4 構建葉綠體表達載體為了克服細胞核轉化中經常出現的外源基因表達效率低，位置效應及由於核基因隨花粉擴散而帶來的不安全性等問題，近幾年出現的一種新興的遺傳轉化技術 - - 葉綠體轉化，正以它的優越性和發展前景日益為人們所認識並受到重視。到目前為止，已在煙草、水稻、擬南芥、馬鈴薯和油菜（侯丙凱等，等發表） 5 種植物中相繼實現了葉綠體轉化，使得這一轉化技術開始成為植物基因工程中新的生長點。由於目前多種植物的葉綠體基因組全序列已被測定，這就為外源基因通過同源重組機制定點整合進葉綠體基因組奠定了基礎，目前構建的葉綠體表達載體基本上都屬於定點整合載體。構建葉綠體表達載體基本上都屬於定點事例載體。構建葉綠體表達載體時，一般都在外源基因表達盒的兩側各連接一段葉綠體的 D N A 序列，稱為同源重組片段或定位片段（ T a r g e t i n g f r a g m e n t ）。當載體被導入葉綠體後，通過這兩個片段與葉綠體基因組上的相同片段發生同源重組，就可能將外源基因整合到葉綠體基因組的特定位點。在以作物改良為目的的葉綠體轉化中，要求同源重組發生以後，外源基因的插入既不引起葉綠體基因原有序列丟失，又不致於破壞插入點處原有基因的功能。為滿足這一要求，已有的工作都選用了相鄰的兩個基因作為同源重組片段，例如 r b c L / a c c D ， 1 6 S t r n V / r p s l 2 r p s 7 , p s b A / t r n K , r p s 7 / n d h B 。當同源重組發生以後，外源基因定點插入在兩個相鄰基因的間隔區，保證了原有基因的功能不受影響。最近， D a n i e l 等利用煙草葉綠體基因 t r n A 和 t r n I 作為同源重組片段，構建了一種通用載體（ u n i v e r s a l v e c t o r ）。由於 t r n A 和 t r n I 的 D N A 序列在高等植物中是高度保守的，作者認為這種載體可用於多種不同植物的葉綠體轉化。如果這種載體的通用性得到證實，那麼這項工作無疑為構建方便而實用的新型葉綠體表達載體提供了一個好的思路。 由於葉綠體基因組的高拷貝性，定點整合進葉綠體基因組的外源基因往往會得到高效率表達，例如 M c B r i d e 等人首次將 B t C r y I A ( c ) 毒素基因轉入煙草葉綠體， B t 毒素蛋白的表達量高達葉子總蛋白的 3 % ～ 5 % ，而通常的核轉化技術只能達到 0 . 0 0 1 % ～ 0 . 6 % 。最近， K o t a 等將 B t C r y 2 A a 2 蛋白 基因轉入煙草轉入煙草葉綠體，也發現毒蛋白在煙草葉子中的表達量很高，占可溶性蛋白的 2 % ～ 3 % ，比細胞核轉化高出 2 0 ～ 3 0 倍，轉基因煙草不僅能抗敏感昆蟲，而且能夠百分之百地殺死那些產生了高抗性的昆蟲。 S t a u b 等最近報道，將人的生長激素基因轉入煙草葉綠體，其表達量竟高達葉片總蛋白的 7 % ，比細胞核轉化高出 3 0 0 倍。這些實驗充分說明，葉綠體表達載體的構建和轉化，是實現外源基因高效表達的重要途徑之一。 5 定位信號的應用上述幾種載體優化策略主要目的是提高外源基因的轉錄和翻譯效率，然而，高水平表達的外源蛋白能否在植物細胞內穩定存在以及積累量的多少是植物遺傳轉化中需要考慮的另一重要問題。近幾年的研究發現，如果某些外源基因連接上適當的定位信號序列，使外源蛋白產生後定向運輸到細胞內的特定部位，例如：葉綠體、內質網、液泡等，則可明顯提高外源蛋白的穩定性和累積量。這是因為內質網等特定區域為某些外源蛋白提供了一個相對穩定的內環境，有效防止了外源蛋白的降解。例如， W o n g 等將擬南芥 r b c S 亞基的轉運肽序列連接於殺蟲蛋白基因之前，發現殺蟲蛋白能夠特異性地積累在轉基因煙草的葉綠體內，外源蛋白總的積累量比對照提高了 1 0 ～ 2 0 倍。最近，葉梁、宋艷茹等也將 r b c S 亞基的轉運肽序列連接於 P H B 合成相關基因之前，試圖使基因表達產物在轉基因油菜種子的質體中積累，從而提高外源蛋白含量。另外， W a n d e l t 等和 S c h o u t e n 等將內質網定位序列（四肽 K D E L 的編碼序列）與外源蛋白基因相連接，發現外源蛋白在轉基因植物中的含量有了顯著提高。顯然，定位信號對於促進蛋白質積累有積極作用，但同一種定位信號是否適用於所有的蛋白還有待於進一步確定。 6 內含子在增強基因表達方面的應用內含子增強基因表達的作用最初是由 C a l l i s 等在轉基因玉米中發現的，玉米乙醇脫氫酶基因（ A d h l ）的第一個內含子（ i n t r o n 1 ）對外源基因表達有明顯增強作用，該基因的其他內含子（例如 i n t r o n 8 , i n t r o n 9 ）也有一定的增強作用。後來， V a s i l 等也發現玉米的果糖合成酶基因的第一個內含子能使 C A T 表達水平提高 1 0 倍。水稻肌動蛋白基因的第三個內含子也能使報道基因的表達水平提高 2 ～ 6 倍。至今對內含子增強基因表達的機制不不清楚，但一般認為可能是內含子的存在增強了 m R N A 的加工效率和 m R N A 穩定性。 T a n a k a 等人的多項研究表明，內含子對基因表達的增強作用主要發生在單子葉植物，在雙子葉植物中不明顯。由於內含子對基因表達有增強作用， M c e l r o y 等在構建單子葉植物表達載體時，特意將水稻的肌動蛋白基因的第一個內含子保留在該基因啟動子的下游。同樣， C h r i s t e n s e n 等在構建載體時將玉米 U b i q u i t i n 基因的第一個內含子置於啟動子下游，以增強外源基因在單子葉植物中的表達。然而，有研究指出，特定內含子對基因表達的促進作用取決於啟動子強度、細胞類型、目的基因序列等多種因素，甚至有時會取決於內含子在載體上的位置。例如，玉米 A d h l 基因的內含子 9 置於 G u s 基因的 5 ｀端，在 C a M V 3 5 S 啟動子調控下， G u s 基因的表達未見增強；當把內含子置於 G u s 基因 3 端，在同樣的啟動子控制下， G u s 基因的表達水平卻增加了大約 3 倍。由此可見，內含子對基因表達的作用機制可能是很復雜的，如何利用內含子構建高效植物表達載體，目前還缺乏一個固定的模式，值得進一步探討。 7 多基因策略迄今為止，多數的遺傳轉化研究都是將單一的外源基因轉入受體植物。但有時由於單基因表達強度不夠或作用機制單一，尚不能獲得理想的轉基因植物。如果把兩個或兩個以上的能起協同作用的基因同時轉入植物，將會獲得比單基因轉化更為理想的結果。這一策略在培育抗病、抗蟲等抗逆性轉基因植物方面已得到應用。例如，根據抗蟲基因的抗蟲譜及作用機制的不同，可選擇兩個功能互補的基因進行載體構建，並通過一定方式將兩個抗蟲基因同時轉入一個植物中去。王偉 等將外源凝集素基因和蛋白酶抑制劑基因同時轉入棉花，得到了含雙價抗蟲基因的轉化植株。 B a r t o n 等將 B t 殺蟲蛋白基因和蠍毒素基因同時轉入煙草，其抗蟲性和防止害蟲產生抗性的能力大為提高（專利）。在抗病方面，本實驗室藍海燕等構建了包含β - 1 ， 3 - 葡聚糖酶基因及幾丁質酶基因的雙價植物表達載體，並將其導入油菜和棉花，結果表明，轉基因植株均產生了明顯的抗病性。最近，馮道榮、李寶健等將 2 ～ 3 個抗真菌病基因和 h p t 基因連在一個載體上，兩個抗蟲基因與 b a r 基因連在另一個載體上，用基因槍將它們共同導入水稻植株中，結果表明， 7 0 % 的 R 。代植株含有導入的全部外源基因（ 6 ～ 7 個），且導入的多個外源基因趨向於整合在基因組的一個或兩個位點。一般常規的轉化，尚不能將大於 2 5 k b 的外源 D N A 片段導入植物細胞。而一些功能相關的基因，比如植物中的數量性狀基因、抗病基因等，大多成 " 基因簇 " 的形式存在。如果將某些大於 1 0 0 k b 的大片段 D N A ，如植物染色體中自然存在的基因簇或並不相連鎖的一系列外源基因導入植物基因組的同一位點，那麼將有可能出現由多基因控制的優良性狀或產生廣譜的抗蟲性、抗病性等，還可以賦予受體細胞一種全新的代謝途徑，產生新的生物分子。不僅如此，大片段基因群或基因簇的同步插入還可以在一定程度上克服轉基因帶來的位置效應，減少基因沉默等不良現象的發生。最近，美國的 H a m i l t o n 和中國的劉耀光分別開發出了新一代載體系統，即具有克隆大片段 D N A 和藉助於農桿菌介導直接將其轉化植物的 B I B A C 和 T A C 。這兩種載體不僅可以加速基因的圖位克隆，而且對於實現多基因控制的品種改良也會有潛在的應用價值。目前，關於 B I B A C 和 T A C 載體在多基因轉化方面的應用研究還剛剛開始。 8 篩選標記基因的利用和刪除篩選標記基因是指在遺傳轉化中能夠使轉化細胞（或個體）從眾多的非轉化細胞中篩選出來的標記基因。它們通常可以使轉基因細胞產生對某種選擇劑具有抗性的產物，從而使轉基因細胞在添加這種選擇的培養基上正常生長，而非轉基因細胞由於缺乏抗性則表現出對此選擇劑的敏感性，不能生長、發育和分化。在構建載體時，篩選標記基因連接在目的基因一旁，兩者各有自己的基因調控序列（如啟動子、終止子等）。目前常用的篩選標記基因主要有兩大類：抗生素抗性酶基因和除草劑抗性酶基因。前者可產生對某種抗生素的抗性，後者可產生對除草劑的抗性。使用最多的抗生素抗性酶基因包括 N P T I I 基因（產生新黴素磷酸轉移酶，抗卡那黴素）、 H P T 基因（產生潮黴素磷酸轉移酶，抗潮黴素）和 G e n t 基因（抗慶大黴素）等。常用的抗除草劑基因包括 E P S P 基因（產生 5 - 烯醇式丙酮酸莽草酸 - 3 - 磷酸合酶，抗草甘磷）、 G O X 基因（產生草甘膦氧化酶、降解草甘膦）、 b a r 基因（產生 P P T 乙醯轉移酶，抗 B i a l a p h o s 或 g l u f o s i n a t e ）等。上面這些當中 1 、 2 、 3 、 5 、 6 都是值得注意的，特別是 5 ，因為你要向細胞外分泌。骨架載體可以選擇 P B I 1 2 1 ，然後你可以在上面改動基因型。後面的就是克隆的步驟了，相對簡單。 1 首先獲得目的基因加酶切位點，連入改好的載體中。 2 將質粒轉入大腸桿菌 D H 5 a 擴增 3 將擴增好的質粒轉入植物細胞內進行表達 4 收集根細胞外培養基檢測是否有該蛋白的表達和分泌。至於改造載體那幾個步驟要是答題的話簡單說說就可以了，畢竟如果真的做出一個好載體都可以自己開公司了。 簡單給你說一下步驟： 1 選擇合適酶切位點，主要參考你所用的載體的多克隆位點，一般建議用雙酶切，這樣就不存在方向驗證的問題； 2 根據你所選用的酶切位點設計引物克隆基因； 3 分別酶切載體和基因的 P C R 產物 ，然後回收。可以選擇切膠回收，也可以用無水乙醇沉澱； 4 連接酶鏈接 5 轉化 6 提質粒驗證。要進行 P C R 驗證和酶切驗證。 7 測序

『貳』 什麼是構建載體

基因表達載體的構建（即目的基因與運載體結合）是實施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。
將目的基因與運載體結合的過程，實際上是不同來源的DNA重新組合的過程。如果以質粒作為運載體，
首先要用一定的限制酶切割質粒，使質粒出現一個缺口，露出黏性末端。然後用同
一種限制酶切斷目的基因，使其產生相同的黏性末端（部分限制性內切酶可切割出平末端，擁有相同效果）。將切下的目的基因的片段插入質粒的切口處，首先鹼基互補配對結合，兩個黏性末端吻合在一起，鹼基之間形成氫鍵，再加入適量DNA連接酶，催化兩條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵，從而將相鄰的脫氧核糖核酸連接起來，形成一個重組DNA分子。如人的胰島素基因就是通過這種方法與大腸桿菌中的質粒DNA分子結合，形成重組DNA分子（也叫重組質粒）的。
農桿菌可以做質粒載體的宿主細胞，但有些條件，比如必須是雙子葉植物，或者是裸子植物~具體看鏈接吧，還有不懂的，追問吧

『叄』 載體構建的步驟

你的問題真的不知如何回答。
超表達載體的構建：
設計引物加接頭，擴增目的基因，連接到t載體上測序。正確無誤，切下來，酶切載體質粒與目的基因連接，陽性克隆鑒定，測序無誤後構建完畢

『肆』 如何進行植物基因工程中的載體構建

基因表達載體的構建過程：

①啟動子：是一段有特殊結構的DNA片段，位於基因的首端，是RNA聚合酶識別和結合的部位，能驅動基因轉錄出mRNA，最終獲得所需的蛋白質。

②終止子：也是一段有特殊結構的DNA片段，位於基因的尾端。

③標記基因的作用：是為了鑒定受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來。常用的標記基因是抗生素基因。

『伍』 如何構建RNA干擾載體

「酶切-連接」方法是通常構建RNA干擾載體最常用的方法,被廣泛應用於各種生物之中。其構建過程是：通過PCR方法得到目的基因的片段(添加了合適的酶切位點)，使之正反相連形成順式片段和反式片段。

然後在順反式片段之間插人一段中間間隔序列以增強基因沉默效果，最後將表達載體和RNA干擾片段相連接，形成可用於遺傳轉化的RNA干擾表達載體。

RNA干擾載體主要用來研究基因表達調控，RNA干擾技術已已被廣泛用於基因結構功能研究和傳染性疾病及基因治療領域。

(5)如何構建載體的方法擴展閱讀：

在RNA干擾實驗中，RNA干擾序列的選擇會顯著影響RNA干擾效果。按照以下幾點指導原則選擇RNA干擾序列:

1、推薦長度為19 nt採用21 nt序列也可以取得良好效果。

2、RNA干擾序列中不包含大於3 nt的連續相同鹼基。

3、RNA干擾序列的GC含量為低到中等水平(推薦GC含量在35%到50%之間)。

4、不要將RNA干擾序列設計在已知的RNA-蛋白質結合位置附近。

5、確保RNA干擾序列與其它基因沒有較高的同源性。

6、方向：在編碼mRNA的正義鏈上選擇RNA干擾序列。

『陸』 如何構建一個基因的過表達載體

當拿到一個基因的DNA片段後，就需要把它導入一個載體，一方面長期保存。另一方面也需要以載體為媒介將基因導入受體細胞中。基因表達載體的構建是基因工程的核心。

常用的載體有細菌質粒，噬菌體和動植物病毒。其中質粒載體最常用。所謂載就是一個很長的環狀DNA，攜帶一些基因，可以導入細菌中自我復制，也可以從細菌中提取出來改造。

現在我們就需要把SUN片段連到一個載體，用VectorNTI打開，研究一下用哪個酶處理，這個載體需要用Sma1這個酶切開，然後用SUN連上，替換切下來的ccdb，這里要用到兩個酶，一個Sma1限制性內切酶切開，一個DNA連接酶把新片段連上，植物轉基因載體和這些酶都是非常常用的試劑。

載體構建好之後需要把它們導入大腸桿菌中復制，這里就要用到大腸桿菌的感受態了，十把構建好的載體和感受態混合，然後放到42度熱水處理個1分鍾，再冰上放個3分鍾。

這時需要一些培養細菌的培養基來培養菌們，大腸桿菌這種菌很好養活，唯一需要注意的是，滅菌過後的培養基要小心保存。把在冰上處理過的大腸桿菌放到培養基中培養一天，為了防止沒有轉入載體的菌也混進來，我們在載體上加入了一個抵抗抗生素的基因。

這樣我們在培養基中加入這種抗生素，在裡面就只有需要的大腸桿菌能生長了。最後得到了上億個攜帶著含有我們的SUN基因的載體的大腸桿菌，這時就需要把質粒再提出來。

實驗室里提質粒需要用專門的試劑盒，也可以簡化一下，先把菌液離心讓菌沉澱，然後再用水把菌打散，然後煮沸1分鍾再離心，取上清，上清中加乙醇讓DNA析出，再離心讓DNA沉澱，最後用水把DNA溶解。這樣提出來的DNA會有很多雜質以及細菌的基因組DNA。

(6)如何構建載體的方法擴展閱讀：

目的基因與運載體結合：

將目的基因與運載體結合的過程，實際上是不同來源的DNA重新組合的過程。如果以質粒作為運載體，

要用一定的限制酶切割質粒，使質粒出現一個缺口，露出黏性末端。然後用同一種限制酶切斷目的基因，使其產生相同的黏性末端（部分限制性內切酶可切割出平末端，擁有相同效果）。將切下的目的基因的片段插入質粒的切口處。

首先鹼基互補配對結合，兩個黏性末端吻合在一起，鹼基之間形成氫鍵，再加入適量DNA連接酶，催化兩條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵，從而將相鄰的脫氧核糖核酸連接起來。

形成一個重組DNA分子。如人的胰島素基因就是通過這種方法與大腸桿菌中的質粒DNA分子結合，形成重組DNA分子（也叫重組質粒）的。

參考資料來源：網路-基因表達載體

『柒』 構建質粒載體的大體步驟是什麼

（1）根據你已知的序列設計帶有酶切位點的引物。
（2）PCR，跑膠，看看你的目的條帶大小對不。
（3）條帶對的話再重新跑個大孔膠，然後切膠回收。（具體步驟根據你們所用試劑盒上的說明書進行），切膠回收後還需電泳，看你回收後怎麼樣。
（4）拿著你的回收液與你的TA載體進行連接（具體操作見載體試劑盒說明書）
（5）連接後要轉化進大腸桿菌感受態中。37℃ 200rpm 搖菌一個小時。
（6）之後塗布至固體培養基上。（培養基是帶有抗生素的，這個抗生素的選擇要根據你的載體來選）
（7）37℃倒置培養一夜
（8）第二天早上，挑取單菌落，進行菌落PCR，檢測是否為假陽性。
（9）PCR之後如果條帶正確，則搖菌，搖的就是你檢測之後的那個單菌落。
（10）可以直接拿菌落測序，或者提取質粒測序。（記住要保存菌種）
（11）如果測序得到的序列確實為你最初設定的那個序列，則再搖你保存的那個菌種。
（12）提取質粒，做酶切。酶切的體系要看你所用的酶。
（13）酶切後還是需要進行回收。
（14）將回收的片段與你已經酶切好的表達載體的片段連接。
（15）再轉化至大腸桿菌擴增。
（16）PCR檢菌，酶切檢菌。
（17）檢菌正確，則你的表達載體構建完成。

因為我不知道你是否要構建到表達載體中，還是構建到克隆載體就可以，所以後面說的不是很詳細，但是大體的步驟就是這樣，只要你會構建克隆載體了，後面的表達載體基本也沒有問題了，只是多下些功夫就可以了。
我上面說的都是很簡單的語言，只供參考，不能作為書面語。有什麼問題可以再交流。

『捌』 將目的基因構建在表達載體上的方法有哪些

有兩種常用的方法。第一種是直接將PCR擴增的基因片段酶切，然後連接到酶切過的表達載體上。第二種是先把PCR產物連到過度載體上，再從過度載體搶切下目的基因，最後再連接到酶切過的表達載體上。

『玖』 怎樣構建植物的表達載體，例舉所用的目的基因以及構建的載體類型

構建基因表達載體的步驟不論動植物都是一樣的。

首先需要用工具酶剪切運載體上的DNA分子，然後用DNA連接酶將目的基因與被被切割的DNA分子連接。在這里的運載體有一定的要求，倘若不清楚可以追問。

但是基因表達載體導入植物，動物，細菌的方法就不一樣了。導入植物的方法有，鳥槍法，農桿菌轉化法，基因槍法。導入動物的方法有，顯微注射法；導入細菌的方法有，鈣離子處理法。

如有問題可以追問，望採納，謝謝！

『拾』 如何構建過表達載體（分子生物學）

第一種方式即將基因和可以表達的載體如PET，PGEX等酶切後直接連接，再轉化入感受態細胞
第二種即將基因先和克隆載體如PMD連接，再將構建成功的克隆載體和PET等表達載體，酶切後連接，轉化入感受態細胞，這種情況針對，直接PCR產物連不上的情況