对大肠杆菌常用的固定方法

1. 微生物实验中为什么细菌在染色前需要固定

微生物实验中细菌在染色前需要固定的原因：
一：杀死细胞，是染料易于着色。
二：使细菌附着于玻片上，不易被水冲掉。
在固定时，是要慢慢晾干，如果得确要加快速度，可以处于酒精灯火焰上部远处稍微烘几下，切忌烘得玻片升温，否则有可能会破坏细菌生命形态
细菌的革兰氏染色与显微观察
一、 实验原理
革兰氏染色原理：细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结，当用乙醇处理时，由于脱水而引发网状结构的孔径变小，通透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌的细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇(或丙酮)溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。 显微镜成像原理：现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常 被称为复式显微镜。显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，油镜的放大倍数最大，对微生物学研究最为重要。在载玻片与镜头之间加滴镜油主要是为了增加照明亮度和增加显微镜的分辨率。以油代替空气作为光的传播介质，减少光线的折射或全反射，使观察到的像更加清晰。
二、 实验器材
1. 菌落：
大肠杆菌24h营养琼脂斜面培养物、
金黄色葡萄球菌约24h营养琼脂斜面培养物、 枯草芽孢杆菌12～18h营养琼脂斜面培养物。
2. 溶液或试剂：
蒸馏水、碘液、结晶紫染色液、95%酒精、番红染色液、香柏油。 3. 仪器：
显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、镊子、擦镜纸。
三、 实验步骤
革兰氏染色：
1. 涂片
取出载玻片，点燃载玻片，燃尽载玻片上的酒精和灭菌，在中间轻轻点一小滴蒸馏水，用接种环在试管的斜面培养基上，轻轻挑取少量菌体，整个过程试管口都要处在酒精灯的上方，而且速度要快，以防污染培养基。然后在载玻片的小水滴以转圈的动作涂片，待水滴混浊后停住，等其干燥、固定。
2. 初染
滴加结晶紫(以刚好将菌膜覆盖为宜)于菌落上，染色1～2min ，倾去染色液，有细水从载玻片上方向下冲洗，至洗出液为无色，将载玻片上水甩净。
3. 媒染
滴加碘液冲去残水，并覆盖约1min，水洗。
4. 脱色
将载玻片上面的水甩净，将载玻片倾斜，在白色背景下，用滴管加95%的酒精脱色，直至流出的酒精刚好不出现蓝色，立即用水冲净酒精，将载玻片上水甩净。
5. 复染
用番红液复染约1～2min，水洗，然后再吸水纸吸干
6. 镜检：

在低倍镜下寻找要观察的细菌菌落（在不停地移动载玻片，若感觉到有红色阴影，立刻停止，调整倍数，若不是菌落，继续找），将镜筒升高，然后转换到油镜。在样品区域加滴香柏油，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在镜油中并几乎与标本相接。将聚光器升至最高位置并开足光圈，用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野中出现物像并用细调节器使其清晰准焦为止。

2. 养大肠杆菌的具体步骤

大肠杆菌（Escherichia coli），又叫大肠埃希氏菌，Escherich在1885年发现的。

养大肠杆菌的方法和具体步骤：

1、发酵法，这种方法主要是在44.5℃下的培养基上进行大肠杆菌的培养，该培养基含有荧光底物，需要培养 24 h。

然后对荧光底物进行释放，需要采用葡萄糖醛酸进行，让培养基能够在紫外光的照射下发出荧光。主要步骤包括发酵、分离培养、二次发酵、显微镜观察等。

2、滤膜法主要过程：加入 10 mL 左右的无菌水于滤器中，然后掺入一些无菌水进行清洁滤器的内壁，再进行过滤，将滤膜放在 M-FC 培养基中，两者之间不能够有气泡，然后进行密封，存放温度为 44.5℃，存放时间约 24 h，直到大肠杆菌的菌群变成蓝色或蓝绿色。

(2)对大肠杆菌常用的固定方法扩展阅读：

大肠杆菌是动物肠道中的正常寄居菌，其中很小一部分在一定条件下引起疾病 。

大肠杆菌的血清型能够引起人体或动物胃肠道感染，主要是由特定的菌毛抗原、致病性毒素等感染引起的，除胃肠道感染以外，还会引起尿道感染、关节炎、脑膜炎以及败血型感染等大肠杆菌是短杆菌，两端呈钝圆形，革兰阴性。

有时因环境不同，个别菌体出现近似球杆状或长丝状
；大肠杆菌多是单一或两个存在，但不会排列呈长链形状；大多数的大肠杆菌菌株具有荚膜或微荚膜结构，但是不能形成芽孢。

多数大肠杆菌菌株生长有菌毛，其中一些菌毛是针对宿主及其他的一些组织或细胞具有黏附作用的宿主特异性菌毛。

3. 大肠杆菌的防治方法

大肠杆菌是人和动物肠道中最主要和数量最多的一种细菌,主要寄生于大肠内。大肠杆菌的危害有哪些呢？本文是我整理的大肠杆菌的危害，欢迎阅读。

大肠杆菌的危害

大肠杆菌是原核生物,构造相对简单,遗传背景清晰,培养操作容易,因此也常常被作为基因工程的对象加以利用:研究者常常将外源基因导入质粒,将质粒整合入大肠杆菌基因,这样,大肠杆菌就能够表达基因重组后的蛋白。此外,大肠杆菌还常常作为模型生物参与细胞学实验。虽然绝大多数大肠杆菌与人类有着良好合作,但是仍有少部分特殊类型的大肠杆菌具有相当强的毒力,一旦感染,将造成严重疫情。其中最具代表性的就是代号为O157:H7的大肠杆菌,它是EHEC(肠出血性大肠杆菌)家族中的一员。

大肠杆菌的防治方法

保持地方及厨房器皿清洁,并把垃圾妥为弃置;保持双手清洁,经常修剪指甲;进食或处理食物前,应用肥皂及清水洗净双手,如厕或更换尿片后亦应洗手;食水应采用自来水,并最好煮沸后才饮用;应从可靠的地方购买新鲜食物,不要光顾无牌小贩;避免进食高危食物,例如未经低温消毒法处理的牛奶,以及未熟透的汉堡扒、碎牛肉和其它肉类食品;烹调食物时,应穿清洁、可洗涤的围裙,并戴上帽子;食物应彻底清洗;易腐坏食物应用盖盖好,存放于雪柜中;生的食物及熟食,尤其是牛肉及牛的内脏,应分开处理和存放(雪柜上层存放熟食,下层存放生的食物),避免交叉污染。

大肠杆菌的特点

周身鞭毛,能运动,无芽孢。能发酵多种糖类产酸、产气,是人和动物肠道中的正常栖居菌,婴儿出生后即随哺乳进入肠道,与人终身相伴,其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长,减少蛋白质分解产物对人体的危害,还能合成维生素B和K,以及有杀菌作用的大肠杆菌素。正常栖居条件下不致病。但若进入胆囊、膀胱等处可引起炎症。在肠道中大量繁殖,几占粪便干重的1/3。在环境卫生不良的情况下,常随粪便散布在周围环境中。若在水和食品中检出此菌,可认为是被粪便污染的指标,从而可能有肠道病原菌的存在。

大肠杆菌的致病物质

定居因子:也称粘附素,即大肠杆菌的菌毛。致病大肠杆菌须先粘附于宿主肠壁,以免被肠蠕动和肠分泌液清除;大肠杆菌具有很多毒力因子,包括内毒素,荚膜,〣型分泌系统,黏附素和外毒素等;黏附素 能使细菌紧密黏着在泌尿道和肠道的细胞上,避免因排尿时尿液的冲刷和肠道的蠕动作用而被排除;外毒素大肠杆菌能产多种的外毒素,包括:志贺毒素〡和〢;耐热肠毒素〡和〢;不耐热肠毒素〡和〢。此外,溶血素A在尿路致病性大肠杆菌所致疾病中有重要作用;肠毒素:是肠产毒性大肠杆菌在生长繁殖过程中释放的外毒素,分为耐热和不耐热两种。肠产毒性大肠杆菌的有些菌株只产生一种肠毒素,即LT或ST;有些则两种均可可产生。有些致病大肠杆菌还可产生vero毒素。

大肠杆菌超标的危害

1、大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。

2、大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在(如沙门氏菌、志贺氏菌等)，因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。

3、如果食品的菌落总数严重超标，说明其产品的卫生状况达不到基本的卫生要求，将会破坏食品的营养成分，加速食品的腐败变质，使食品失去食用价值。消费者食用微生物超标严重的食品，很容易患痢疾等肠道疾病，可能引起呕吐、腹泻等症状，危害人体健康安全。而大肠菌群超标，也同样会引起腹泻、肠胃感染等。

大肠杆菌怎样传播

1、肠出血性大肠杆菌主要通过被污染的食物传播，目前尚未发现人与人之间的接触导致广泛传播的证据。

2、大肠杆菌O157:H7主要通过食用污染的食物向人类传播，例如生的或未煮熟的碎肉制品和生鲜奶。受粪便污染的水和其它食物以及食物制备期间的交叉污染(与牛肉和其它肉制品、受污染的板面和厨房用具)也将导致感染。导致O157:H7大肠杆菌疫情的食物包括未煮熟的汉堡包、风干肠、未施行巴氏消毒的新鲜压榨苹果酒、酸奶、由生鲜奶制作的奶酪。推荐阅读：警惕食物传播大肠杆菌

3、越来越多的疫情与食用水果和蔬菜(芽苗菜、菠菜、莴苣、酸卷心菜丝、生菜)有关，由于种植或处理期间的某一阶段接触到家畜或野生动物的粪便而可能造成污染。也从水体(池塘、溪水)、井和水槽中分离出肠出血性大肠杆菌，并发现该菌在粪便和水槽沉淀物中能够存活数月。来自被污染的饮用水和游憩用水的水源性传播均有报告。

4. 有谁知道大肠杆菌的详细培养方法

培养大肠杆菌用LB培养基。
LB培养基是一种培养基的名称,生化分子实验中一般用该培养基来预培养菌种,使菌种成倍扩增,达到使用要求.培养的菌种一般是经过改造的无法在外界环境单独存活和扩增的工程菌.通过培养工程菌,我们可以表达大量的外源蛋白,也可以拿到带有外源基因的质粒,工程菌的有效扩增是生化分子实验的基础.
LB培养基的配方如下:
胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L
酵母提取物(Yeast extract) 5g/L
氯化钠(NaCl) 5g/L
另外根据经验值用NaOH调节该培养基的pH,使其达到7.4(该pH适合目前使用最广的原核表达菌种E.coli的生长)
E.Coli就是大肠杆菌
最好用去离子水配制，不过要求不是很严格的话纯净水也可以。

5. 大肠杆菌检测方法国标是用什么方法检测的

大肠杆菌检测方法分为三种：

1、细菌分离鉴定法

分离培养与鉴定：粪便标本直接接种肠道杆菌选择性培养基。血液先经肉汤增菌，然后转种血琼脂平板。其他标本同时接种血琼脂平板和肠道杆菌选择性培养基。

37℃孵育18～24小时后，观察菌落涂片染色镜检。肠致病性大肠杆菌须先作血清学定型试验。必要的时候检定肠霉毒素。

2、卫生细菌学检查法

大肠杆菌会不断随粪便排出体外，污染周围环境水源、食品等。取样检查时，样品中大肠杆菌越多，则表示样品被粪便污染的越严重，表明样品中存在肠道致病菌的可能性也就越大。

大肠菌数指数：指每立升中大肠菌群数，采用乳糖发酵法检测。中国卫生标准是每1000ml饮水中不得超过3个大肠菌群，瓶装汽水和果汁中每100ml大肠菌群不能超过5个。

3、全自动微生物定量分析仪（TEMPO）检测法

全自动微生物定量分析（TEMPO）仪大肠杆菌群计数检测有TEMPOTC和TEMPOCC两种方法。

TEMPOTC的开发是为获得NF ISO4832标准相当性能水平。

TEMPOCC法是TEMPO仪器上根据BAM方法专门用于24h计数食品中大肠杆菌群方法。

(5)对大肠杆菌常用的固定方法扩展阅读：

大肠杆菌在生物技术中的应用

这些菌株由于失去了细胞壁等重要组分，所以在自然条件下已无法生长。甚至普通的清洁剂都可以轻易地杀灭这类菌株。即便由于操作不慎导致活菌从实验室流出，也不易导致生化危机。

生物工程用的菌株基因组都被优化过，使之带有不同基因型（例如β半乳糖苷酶缺陷型），可以更好的用于分子克隆实验。

真核基因在大肠杆菌中表达，必须有合适的表达载体(Vector),常用载体：pBV220,pET系统。

目的基因在大肠杆菌中表达的情况：

大肠杆菌更适合原核基因的表达，外源基因表达产量与单位体积产量是正相相关的，外源基因拷贝数和表达 产物产量之间存在动态平衡，单个细胞的产量又与外源基因拷贝数，基因表达效率，表达产物的稳定性和细胞代谢负荷等因素有关。

6. 大肠杆菌保存

以实验室要求来说，斜面培养基上的菌，还有菌液，都不是保存菌株的方法，那都是培养、扩增菌株用的，在4度放着，几天就不行了。

要保存菌株，应该采取甘油管的方式：取出一点发酵得到的菌液，按3:1加入甘油，搅匀，液氮速冻，然后放入-70度超低温冰箱，可保2年活力，需要使用时，冰上解冻，沾一点加到新培养基里活化培养。

如果你是想保存一大瓶菌液，比如说今天培养了一瓶或者一管，想放到冰箱等想用的时候再用……那我告诉你快算了吧，菌液只能现培养现用，细菌也是活的，怎么都放不住的，只能存个种，需要的时候再培养。

回答你的补充：原则上是现养现用，如果你实在懒，那可以把菌液放在4度冰箱，能用个1,2天。

7. 大肠杆菌与黑曲霉分别采用什么保藏方法为好,为什么

大肠杆菌适宜冷冻保藏，有条件的话按比例加入甘油做保护剂在－70℃低温冰箱保存，也可以在－30～－20℃普通冰箱