1. PCR,RT-PCR,实时荧光定量PCR的区别与联系
1、所说的PCR应该就是最常规的PCR，以DNA为模板，通过上下游引物，实现DNA的扩增。
2、RT-PCR一般情况下是指反转录PCR（reverse transcription），尽管有些资料上说实时荧光定量PCR也（realtime fluores-cence quantitative PCR）也简称RT-PCR，但是这是不对的，不推荐。
基本操作过程是将所提取的RNA进行反转录，然后将所获得的cDNA作为模板，设计引物进行扩增，是一种检测基因表达的常用方法。
3、实时荧光定量PCR也就是Real-Time PCR，其最大的作用是检测样品中的初始DNA浓度。
至于三者的关系，RT-PCR和实时定量PCR应该都属于PCR，在RNA实验中，这二者都会应用到。
例如你要比较2个组织中的某基因的表达差异，首先你要提取2个组织的总RNA，然后通过RT-PCR检测该基因是否在2个组织中有表达，然后通过实时定量PCR测定该基因在2个组织中的表达量是否具有显着性差异。
(1)荧光ptpcr检测方法是什么扩展阅读：
PCR原理
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。
在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。
耐热DNA聚合酶-Taq酶的发现对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
③引物的延伸：DNA模板-引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，
而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
2. RT-PCR，QRT-PCR，real-timePCR之间什么区别
PCR：一种快速的DNA复制方法,由变性--退火(复性）--延伸三个基本反应步骤构成。
RT-PCR：反转录PCR(reverse transcription-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA（cDNA），再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。
QRT-PCR在RT-PCR体系中同时加入内参标基因的引物，使目的基因和内参基因在同一条件下同时扩增。在扩增反映结束之后，可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行半定量分析，但分析的是PCR终产物，不能准确分析未经PCR信号放大之前的起始模板量。
real-time PCR：实时PCR(real-time PCR)属于定量PCR（Q-PCR）的一种，以一定时间内DNA的增幅量为基础进行DNA的定量分析。
Real-timePCR与reverse transcription PCR相结合，能用微量的RNA来找出特定时间细胞组织内的特别表达的遗传基因。这两种RT PCR的组合又被称之为定量RT-PCR（QRT-PCR）。
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聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。
PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。
3. RT-PCR的原理是什么有何用途
原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。
RT- PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）即逆转录PCR，是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。
首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。
作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。
用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。
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反转录酶的选择
1、Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。
2、禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。
3、Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。
4、MMLV反转录酶的RNase H突变体：商品名为SuperScript 和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。
4. RT-PCR是什么
RT-PCR简介
RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。使用天为时代公司的总RNA提取系统（如目录号 DP405和DP406），所获得的RNA的纯度高，基因组DNA污染少，用于RT-PCR系统可得到满意结果。用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。
5. rt pcr的原理及步骤
原理：RT-PCR 为反转录RCR（reverse transcription PCR）和实时PCR（real timePCR）共同的缩写.逆转录PCR,或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR),是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形.在RT-PCR中,一条RNA链被逆转录成为互补DNA,再以此为模板通过PCR进行DNA扩增.
步骤：（一）预变性：
破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构.使DNA充分变性,减少DNA 复杂结构对扩增的影响,以利于引物更好的和模板结合,特别是对于基因组来源的DNA模板,最好不要吝啬这个步骤.此外,在一些使用热启动Taq酶的反应中,还可激活Taq酶,从而使PCR反应得以顺利进行.
（二）变性--退火--延伸循环：
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备；
②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链.（三）PCR仪扩增循环后72度延伸10分钟。
6. rtpcr和实时荧光定量pcr区别是什么
所说的PCR应该就是最常规的PCR，以DNA为模板，通过上下游引物，实现DNA的扩增。RTPCR一般情况下是指反转录PCRreverse，transcription，尽管有些资料上说实时荧光定量PCR也realtime，fluores，cencequantitativePCR也简称RTPCR，但是这是不对的，不推荐。
rtpcr和实时荧光定量pcr区别
基本操作过程是将所提取的RNA进行反转录，然后将所获得的cDNA作为模板，设计引物进行扩增，是一种检测基因表达的常用方法实时荧光定量PCR也就是RealTimePCR，其最大的作用是检测样品中的初始DNA浓度至于三者的关系，RTPCR和实时定量PCR应该都属于PCR，在RNA实验中，这二者都会应用到。
例如你要比较2个组织中的某基因的表达差异，首先你要提取2个组织的总RNA，然后通过RT-PCR检测该基因是否在2个组织中有表达，然后通过实时定量PCR测定该基因在2个组织中的表达量是否具有显着性差异。
7. RT-PCR检测方法的具体步骤
RT-PCR检测方法的具体步骤如下：
（一）RNA提取
1、根据标本数量分装RLT液：从Kit中取出RLT液，用1.5mL离心管分装，每管500μL（在体系配制区操作）。
2、在生物安全柜内将采样液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培养物（鸡胚尿囊液或细胞培养液）取100μL加入RLT液管中，充分混匀。 3、每管分别加入5μL β-巯基乙醇，混匀后依次加入600μL 70%的乙醇，充分混匀。
4、从Kit中取出带滤柱的2mL收集管，打开包装将其做好标记。取步骤（3）中的混合液600μL加入滤柱中，12000rpm，离心15s，弃收集管中的离心液。
5、滤柱仍放回收集管上，将步骤（3）剩余的混合液全部吸入滤柱中，12000rpm，离心15s，弃离心液。
6、于滤柱中加入700μL Wash Buffer RW1液，12000rpm，离心15s。
7、从QIAGEN RNeasy Mini Kit中取一支干净的2mL收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，于滤柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，12000rpm，离心15s。
8、弃收集管中的离心液，再于滤柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，13000~14000rpm，离心2min。
9、将滤柱移到一个干净的1.5mL eppendorf管上，向滤柱中加入30~50μL的Rnase-free Water，室温静置1~3min。
10、12000rpm，离心1min，收集离心液即为提取的病毒RNA，立即做实验或-20℃以下保存。
注意：Buffer RPE使用之间加44mL无水乙醇。
（二）反应体系配制
1、实验设计： 检测标本RNA
阴性对照：无菌水（标本RNA提取时，跟标本同时提取无菌水。） 阳性对照：已知病毒RNA
2、PCR反应体系配制（在体系配制区配反应液） 1）按下表加入试剂： PCR反应体系
对每一个建立的反应确定反应数（n=拟进行的PCR管数，包括阴性，阳性对）。考虑到阴性无模板对照，阳性对照，误差，制备过量的反应混合物是必要的。具体如下：
（1）如果包括对照，样品的数量（n）为1到14，那么N=n+1；
（2）如果包括对照，样品的数量（n）大于15，那么N=n+2。
2）将上述反应液混匀，分装到0.2mL PCR小管中，每管20μL，分别做好标记。
3）加RNA模板（在核酸提取区）
将上述分装好的PCR小管分别加入模板。首先加入阴性对照管（5μL无菌水），然后分别加标本RNA（每管5μL），最后加入阳性对照RNA（每管5μL）。
3、RT-PCR反应
将上述加好模板的反应管混匀，短暂离心后放入PCR仪进行RT-PCR 扩增。
4、RT-PCR产物检测
1）2.0％琼脂糖凝胶制备：称取2.0g Agarose，倒入耐热玻璃瓶内，再加入电泳液（1×TBE）100mL，轻轻混匀后加热，使Agarose完全熔化。待Agarose胶温度降至50～60℃左右，加入核酸染料，轻轻混匀（不要产生气泡）。待胶温度降至50℃左右时，将其倒入制胶板，插好电泳梳子。待胶完全凝固（约30～60min）之后，将梳子拔出。
2）将制备好的电泳胶放入电泳槽（带梳子孔的一端在阴极），倒入电泳液（1×TBE）浸过胶面即可。
3）PCR产物各取10μL，加入2μL上样缓冲液（6×Loading Buffer），混匀后加入电泳胶孔内（先加Marker（DL－2000）5μL，然后依次加标本PCR产物，再加阴性对照，最后加阳性对照产物）。 4）电泳电压100V，约30～40min后看结果。 5）将电泳胶放入凝胶成像系统观察结果并照相。
5、结果判断。
8. 与其他分子生物学方法相比,用荧光探针RT-PCR法检测诺如病毒有什么优势
方法包括等温核酸扩增（NASBA）、逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、荧光染料RT-PCR、荧光探针RT-PCR、多重RT-PCR等，是目前检测诺如病毒应用最广泛的方法，被称为检测诺如病毒的“金标准”。
NASBA直接扩增RNA来进行检测，仪器相对简便，通过琼脂糖凝胶电泳、印迹杂交或者荧光检测来鉴定结果，灵敏度低于RT-PCR；RT-PCR通过逆转录RNA模板、PCR扩增特异性产物，使用琼脂糖凝胶电泳来鉴定结果；荧光染料RT-PCR通过向RT-PCR反应体系中添加非特异性的荧光染料，可以在反应过程中监测扩增产物的生成量，但需要做熔解曲线分析来确定反应的特异性；荧光探针RT-PCR通过特异性的荧光探针与引物，可实时监控反应过程中特异性产物的变化，并且可以实现同一管中多个基因的检测（多重），特异性较好，假阳性率低，检测灵敏度可达10-100拷贝/反应，可用于取代普通RT-PCR。
9. 实时荧光定量PCR——RT-QPCR
目前实时荧光定量PCR已得到广泛应用，如：扩增特异性分析、基因定量分析、基因分型、SNP分析等......荧光定量PCR最常用的方法是DNA结合染料SYBR Green I 的非特异性方法和Taqman水解探针的特异性方法
SYBR Green I 的非特异性方法(试剂盒：LightCycler 480 SYBR Green I Master）
SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA 双螺旋 小沟区域的具有绿色 激发波长 的染料。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。
一、实验前准备：
实验试剂及耗材：
试剂：特异性PCR引物，新鲜提取备用的总RNA
试剂盒:Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit、LightCycler 480 SYBR Green I Master
1号管包含：
热启动Taq DNA Polymerase、反应缓冲液、dNTP mix、SYBR Green I染料、MgCI2
仪器及耗材：
罗氏LightCycler 480全自动实时定量PCR仪以及配套使用的48或96孔板；Thermo Scientific Arktik PCR仪、F1单道移液器、冰盒、QSP盒装吸头等
正式实验开始前，冰上解冻各个试剂【注意：SYBR Green I Master 需要避光放置】
二、反转录
实验操作时注意：所有RNA相关的操作均需要佩戴手套，防止RNase污染。严格按照试剂盒使用说明进行相关操作。
按照体系配方在冰上的Rnasefree的灭菌PCR管中配置Templateprimer mix，总体系13ul。本实验是联合使用anchored oligo dT引物和随机六聚体引物进行的反转录。
(1)配制NTC对照：（总13ul）
水——10ul
oligo dT引物 ——1ul
随机六聚体引物——2ul
混匀
（2）配制1、2、3、4号管：（总13ul）
总RNA（s1、s2、s3、s4）——1ul
oligo dT引物——1ul
随机六聚体引物——2ul
水——9ul
混匀
【Note：可将总RNA的模板量适当调整至10ng—5ug，mRNA调整至1—100ng。若RNA样品浓度较低，则可加入10ug/ml的MS2 RNA 来稳定模板RNA】
（3）将配好的反应mix在PCR仪中65℃变性10min，可有效减少RNA的二级结构。加热后，迅速置于冰上制冷，放置5min
（4）在反应Templateprimer mix中分别加入以下试剂：
配制总mix（除了RNA模板和引物）
5X反转录酶buffer——24ul（4ulX6管）
dNTP mix ——12ul（2ulX6管）
40U/ul RNase抑制剂——3ul（0.5ulX6管）
20U/ul反转录酶——3ul（0.5ulX6管）
mix总体积——42ul（7ulX6管）
若样品数量多，先配制反应mix再分装到各个反应管，小心吹打混匀，切勿涡旋震荡。混匀后于微型离心机上离心，使样品和离心管落至管底。
将离心管放置PCR仪中，根据使用的引物和目标RNA的长度进行程序设置：
25℃ 10min
55℃ 30min
85℃ 5min
最后置于冰上停止反应。
此反应产物可于2℃—8℃存放1—2h，或在﹣15℃至﹣25℃下存放更长时间。cDNA产物无需进行纯化即可用于后续的PCR反应。20ul的PCR反应体系可取2—5ulcDNA反应产物进行扩增。此试剂盒中的反转录酶具有RNase H 活性，可以在cDNA合成之后去除RNA模板，减少其对后续PCR的影响
SYBR Green 反应体系的配制：
使用LightCycler 480 SYBR Green I Master使用进行基础的绝对定量分析。
实验设计：5个标准样品（包含1个空白对照）
5个反转录样品（包含1个NTC对照【Negative Template Control缩写】）
由于样本数较多，如下配置：
不含模板的总体系（594ul）—分装为10管（每管55ul）—每管加入各自的模板（6ul）—每个样分装为3个复管（每管20ul）
按照体系配方配制：
2x Master mix （绿色盖）——330ul（10ulX33）
10x Primer mix —— 66ul（2ulX33）
PCR级别水（无色盖）——198ul（6ulX33 ）
总体积 ——594ul
用移液枪轻柔吹打混匀，然后分装为10管，每管55ul。
标准对照组:在各个管中分别加入各个样品对应的调整好浓度的cDNA，空白对照加入6ul水代替模板，其余加入6ul已经逐级稀释好的标量模板。
反转录样品组:分别加入6ul浓度调整好的模板DNA，包含NTC。
混匀后将每个样按照20ul/孔分装至96孔板中，用封口膜盖好96孔板。将多孔板置于合适的离心机中室温1500g配平离心2min，然后将准备好的96孔板放入罗氏LightCycler 480中
PCR程序设置与运行：
（1）双击打开LightCycler 480 Software release1.5.0SP4中登录，自动进入软件界面。
（2）点击New Experiment
（3）设置反应体积（对于96孔板，反应体积为10ul—100ul）此次设置20ul
（4）在Program中输入反应名称preincubation，预备性设置一个循环，无需进行荧光收集
（5）点击增加按钮，输入amplification，定义扩增循环的次数为445次，选择荧光的收集功能Quantification
（6）设定PCR扩增循环的温度与时间为95℃10s
（7）点击增加按钮，设定退火温度为60℃10s
【6.7两步 Analysis Mode默认None】
（8）设置延伸温度和时间为72℃20s Acquisition Mode选择Single
（9）设置溶解曲线，在program新的一行中输入Melting curve，Acquisition Mode选择Melting Curves 95℃ 5s，新增设置温度，再点击增加按钮，65℃ 1min 以上两步Acquisition Mode默认选择None
（10）点击增加按钮，95℃ Acquisition Mode选择Continuous ，其他设置无需改动
（11）设置保温的过程cooling，1个循环，无需荧光，40℃ 1min
（12）设置完成后，点击右方保存按钮，保存设置的程序
（13）点击start run，开始运行PCR反应，此时可在软件上实时监测样品扩增情况。
样品编辑
（1）实验结束，点击Sample editor，进入样本编辑程序
（2）在select Workflow中选择ABs Quant进行绝对定量，根据样本在板中的排布方式进行样本编辑，设置阴性对照、空白对照、标准品等，在SELECT Sample中选择样品孔
（3）在Sample Name中输入被选择样品名称
（4）最后点击make replicates设置复孔
（5）标准品设置时，需填写拷贝数、稀释倍数、初始浓度即可
（6）编辑好样品后，可进行数据分析，如有需要，也可进行组间分析
结果分析
（1）点击左下方的SUM，将显示出所有信息，包括设置的反应程序、实验结果分析等。
（2）点击Analysis，可对已有的数据进行细致的分析
（3）点击Abs Quant/2nd DerivativeMax，弹出Create new analysis窗口
（4）在Subset中选择分析样品的区域即可出现分析图，相应样品的扩增曲线
（5）Standard Curve是根据标准品得出的标准曲线，左侧有扩增效率、斜率、截距、线性关系以及错误率 （一般error值越小，说明实验准确率越高，扩增效率如果越接近“2”，说明这次的扩增反应越好）
（6）在数据表格，可显示样本的Cp值，以及相应的样本浓度值，按复孔进行数据统计，显示Cp平均值、方差，浓度的平均值以及方差
