㈠ 磷酸化蛋白的转录情况能用PCR检测吗
首先，磷酸化形式的蛋白属于蛋白质，蛋白质不能用pcr检测，pcr只能检测dna；其次，蛋白需要用wb检测，磷酸化蛋白有专用的wb检测方法。
㈡ 蛋白磷酸化的位点确定方法，质谱有什么缺点
质谱中出现的离子有分子离子、同位素离子、碎片离子、重排离子、多电荷离子、亚稳离子、负离子和离子－分子相互作用产生的离子。综合分析这些离子，可以获得化合物的分子量、化学结构、裂解规律和由单分子分解形成的某些离子间存在的某种相互关系等信息。
质谱法特别是它与色谱仪及计算机联用的方法，已广泛应用在有机化学、生化、药物代谢、临床、毒物学、农药测定、环境保护、石油化学、地球化学、食品化学、植物化学、宇宙化学和国防化学等领域。近年的仪器都具有单离子和多离子检测的功能，提高了灵敏度及专一性，灵敏度可提高到10(克水平。用质谱计作多离子检测，可用于定性分析，例如，在药理生物学研究中能以药物及其代谢产物在气相色谱图上的保留时间和相应质量碎片图为基础，确定药物和代谢产物的存在；也可用于定量分析，用被检化合物的稳定性同位素异构物作为内标，以取得更准确的结果。
在无机化学和核化学方面，许多挥发性低的物质可采用高频火花源由质谱法测定。该电离方式需要一根纯样品电极。如果待测样品呈粉末状，可和镍粉混合压成电极。此法对合金、矿物、原子能和半导体等工艺中高纯物质的分析尤其有价值，有可能检测出含量为亿分之一的杂质。
利用存在寿命较长的放射性同位素的衰变来确定物体存在的时间,在考古学和地理学上极有意义。例如,某种放射性矿物中有放射性铀及其衰变产物铅的存在，铀238和铀235的衰变速率是已知的，则由质谱测出铀和由于衰变产生的铅的同位素相对丰度，就可估计该轴矿物生成的年代。
㈢ 如何用western来检测基因的磷酸化水平
应该是蛋白质的磷酸化水平吧。用特异性识别磷酸化位点的抗体来做western blot，再用普通的不识别磷酸化位点的抗体做一遍，比较一下强度比值即可。但很多磷酸化位点的抗体不好买或者识别效果不好，还有磷酸化水平很低，难以检测到。这时可能需要先用TiO2等方法富集磷酸化蛋白，再按上面的方法用两种抗体来做western blot。
㈣ 分子生物学 蛋白质磷酸化分析技术
在所 有 的 翻译后修饰中，可逆的磷酸化，几乎调节着生命活动的整个过程，包括细胞的增殖、发育和分化，神
经活动，肌肉收缩，新陈代谢，肿瘤发生等。据统计，哺乳动物细胞内有三分之一以上的蛋白质可以被磷酸化川，蛋白质的可逆磷酸化使得蛋白质组学研究更为复杂。 真核 生 物 细胞蛋白质中主要的磷酸化氨基酸为
丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸，其比例大概为1800:200:11 21。大多数磷酸化蛋白质都有多个磷酸化位点，并且其磷酸化位点是可变的。因此，一种蛋白可能有多种磷酸化形式。虽然对磷酸化蛋白质组学分析已有很大进步，但依然存在多个难点19待解决包括磷酸化蛋白和肤段的富集，可逆性磷酸化位点的鉴定以及磷酸化位点的定量等。1 磷酸化蛋白的识别
磷 酸 化 蛋白在细胞中含量甚微。在质谱分析中，磷酸化肚段的信号往往被非磷酸化肤段的信号所抑制。因而磷酸化蛋白和肤段的富集在提高磷酸化 位点的检测中占有非常重要的地位。
1. 1 磷酸化蛋白的富集
过 去 关 于 磷 酸化蛋白富集的方法主要应用针对特 定蛋白的抗体进行免疫沉淀。但该法需要首先对
蛋 白有所了解，且不适合大规模研究。虽然，近来关 于针对磷酸化基团的抗体已经出现，但只有抗磷
酸化酪氨酸的抗体效果较好[41。而抗磷酸化丝氨酸 、苏氨酸的抗体特异性均不强。近来，商品化的
磷 酸化蛋白提纯和富集试剂盒，在酵母中已成功应用，但在其它组织的应用还未见报道川。
1.2 磷酸化蛋白胶染色
检测 蛋 白 混合物中磷酸化蛋白的经典方法是先
行电泳分离蛋白质，然后用放射自显影术或针对磷
酸化蛋白的免疫印记方法来检测。近来，Pro-Q Diaround
磷酸化蛋白胶染色是一项重大的技术突
。破b]。这种特殊的荧光染料可以直接在胶内检测
针对磷酸化丝氨酸、苏氮酸和酪氨酸的蛋白，而不
需特殊的抗体或同位素标记。这种染色适用于
SDS-聚丙烯酸胺凝胶和二维聚丙烯酞胺凝胶，并旦
这种染色和后续的质谱鉴定是完全兼容的。SYPRO
Ruby染色是针对总蛋白的染色。通过每条泳带或
每个点的Pro-Q Diamond染色和SYPRO Ruby染色
的比值，可以了解磷酸化蛋白在总蛋白中的比值。
两种蛋白染色结合使用，可以将高丰度蛋白的低磷
酸化状态与低丰度蛋白的高磷酸化状态区分开
2 磷酸化肤段的富集
磷酸 化 位 点的检测往往不是直接从蛋白水平检
测，而是从肤段水平检测。但由于L述提到的抑制
现象的存在，在分析之前应首先对磷酸化肤段进行
富集。
2.1 固定金属亲和色谱
目前 使 用 最广泛的分离和富集磷酸化肚段的方
法是固定金属亲合色谱(immobilized metal affinity
chromatography, IMAC)。此方法中，键合在鳌合
底物上的金属离子(如Fe3. , Gas. , Cue'等)选
择性地与磷酸化脸中的磷酸基团结合，在高pH值
或磷酸盐缓冲液中磷酸化肤可以释放出来。洗脱下
来的溶液经脱盐处理后可直接用于质谱分析。
IMAC通常可富集到磷酸化的酪氨酸、丝氮酸和苏
氨酸残基。但这种方法的局限性在于:可熊会丢失
掉一些低丰度的没有结合到IMAC柱上的磷酸化肤
段;具有多磷酸化位点的肤由于其较强的亲和力很
难被洗脱下来;某些酸性基团(如天冬氨酸和谷氨
酸)、电子供体文如组氨酸)也会结合到柱上·，造
成非磷酸化肤的污染。所以用IMAC方法富集磷酸
化肤的效果如何，绝大部分依赖于所选择的金属离
子、填充柱的材料、及洗脱的程序。最近，Ficarro
等[C1在IMAC富集以前，将肤的酸性残基进行酷化
处理，使其特异性大大提高，预期对大范围磷酸化
分析具有广阔的前景。
2.2 磷酸化肚段的化学修饰
近来 ， O da等[1-1将肤或蛋白混合物置于碱性硫
代二乙醇溶液中，通过P2消除从磷酸化丝氨酸或
苏氨酸中去掉磷酸基团H3P0 ,，形成的双键受到硫
代二乙醇的作用，琉基取代磷酸根。生物素与琉基
相连，被标记的肤或蛋白质上样于固定有亲和素的
层析柱，通过生物素与亲和素的高亲和力作用而达
到磷酸化肤或蛋白质富集的目的。这一方法的主要
缺点在于它不能富集酪氨酸磷酸化的蛋白质和肤。
Zhou等I〕用另外一种方法修饰磷酸化肮，用碳二
亚胺浓缩反应将半胧氨酸加在磷酸盐部分，修饰过
的肤段以共价键与碘乙酞胺树脂结合，酸洗涤释
放。此方法既可用于富集磷酸化酪氨酸也可用于富
集磷酸化丝氨酸和磷酸化苏氨酸，但需要许多步化
学反应和柱纯化过程。
㈤ 想检测磷酸化的蛋白，这个磷酸的位点，怎么选择
每个蛋白质磷酸化的位点各异，有的不止有一个磷酸化位点，有的在不同位点磷酸化以后获得的功能也会不同。楼主要选择的，大概是检测时所用的抗体能够识别哪个磷酸化位点的epitope。如果有相关文献表示某个磷酸化位点同楼主所感兴趣的该蛋白功能相关的话，可以据此选择。如果这些信息仍然未知，楼主只好使用较为常见的抗体。
㈥ 蛋白质的检测方法及原理
1
磷酸化检测可以用二级质谱啊，在正离子模式下，经过collision
cell后中性丢失了98dalton（ser和thr）或216dalton（tyr）的肽段就可能是含一个磷酸化位点的磷酸化肽段。
2
基本原理就是设计个t将目的蛋白留在柱子上或沉淀下来。
㈦ 如何用western来检测基因的磷酸化水平
那个不是去磷酸化的，是总的蛋白，包括磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白。因为普遍意义上认为，蛋白的磷酸化激活是体内磷酸化蛋白占有总的该蛋白的百分比上升，所以在做WB时，通常除了做一个磷酸化蛋白的含量表达变化外，还做一个总的蛋白，用以说明，这个磷酸化蛋白的改变并不是因为总的该蛋白表达的变化而引起的，而是因为激酶对它活化，磷酸化蛋白百分比增加而引起的
㈧ 如何检测蛋白是否发生磷酸化
做对比检测实验
例如
AKT蛋白磷酸化后P-AKT
做western blot检测，看看AKT和p-AKT表达量又没有相关性。
或者做elisa实验，毛细管电泳或者HPLC也可检测相关性。