转录后调控的研究方法

❶ 如何研究一个转录因子对目的基因的调控

1.双荧光报告实验! 2.敲低转录因子基因,靶基因表达下调! 3.设计转录因子结合区突变体, Gel-shifting实验!

❷ 植物转录因子调控网络该怎么研究

我们以玉米为例，介绍构建TF调控网络的详细方法。

真核细胞内的转录调控网络，是由 转录因子（TFs）的组合作用所决定的 。但是， 植物中的TF结合研究的数量太少 ，无法给出这个复杂网络的全貌。

本研究 以玉米为模型，对玉米叶片中表达的104种TF进行ChIP-seq，重建其转录调控网络 ，并训练机器学习模型来预测TF结合和共定位。

作者开发了一种高效的玉米原生质体分离和转化系统（图1a），成功 对104个在玉米叶片发育切片上表达的TFs进行了ChIP-seq实验 。然后应用 ENCODE2统一pipeline来处理 ，总共得到了217个ChIP-seq数据，2,147,346个可重复的TF结合peak。

验证发现， TF结合形成密集的cluster并定位在开放的染色质区域 （图1b-d）。使用 GO-term和MAPMAN功能类别富集分析 ，来根据靶基因对其进行分类（图1e）。 大部分的TFs被分为信号传导、激素、光合作用和代谢类 ，这些都是叶子的核心生物功能。

此外，作者观察到尽管一半以上的TF结合位点位于基因5'的近端区域，但远侧的TF结合位点（如 Vgt1 ）也显示出相似的染色质特征，并可能在调节转录中发挥重要作用（图2）。

接下来，使用 ENCODE TIP概率框架 构建了一个基因调控网络，使用该TIP模型，生成了一个具有272,627条边和20,179个节点的网络图（约45％的注释基因和约77％的叶子表达基因）（图3a）。

生物网络通常表现出拓扑和/或功能模块化。应用分区算法（Gephi version 0.92）来确定网络元素子集之间的关系，发现网络可以被划分为七个模块（分辨率1.0）。每个模块包含约27 - 5%的节点。这些模块并不是孤立的，大约40%的边缘出现在每个模块内，说明TFs可以调节自身模块外的基因，模块之间存在大量的信息流。接下来，对每个模块中的基因进行GOterm和MapMan功能富集分析，发现它们确实针对特定功能富集。

然而，每个模块包含数千个具有不同功能的基因，而且太大而不能作为一个整体进行评估。 假设：由于该网络已经能够在这个尺度上提供生物学功能的线索，因此可以根据局部规模的连通性来确定更小通路的潜在调控因子 。

首先， 在保守的叶绿素生物合成通路中测试了这一点 。已知该通路受GLK TFs的调控，因为它们的突变会破坏光合作用基因的表达。为了推断每个TF对给定通路的贡献， 用ENCODE TIP概率模型为每个TFtarget相互作用计算了对数转换后的p值的总和 （图4a）。发现，叶绿素生物合成通路的主要转录因子确实是 两个GLKs和一个未知的MYBR26 。尽管尚未在玉米中研究MYBR26的功能，但其拟南芥同源物参与了昼夜节律调节，进一步证实了假设。

接下来， 使用这种策略来检查缺乏预先定义调控子的玉米C4光合作用通路 。结果表明，**连通性排名前5位的TFs均为constant -

like（COL）TFs**（图5b，c）。之前其他植物的研究表明，COLs在花期和光周期的调节中发挥着重要作用。纯合突变体具有浅绿色和幼苗致死性表型，支持作者的假设，即COL TF对光合作用很重要（图5d）。

有趣的是，对于在叶肉或束鞘细胞中特异性表达的关键C4光合作用基因，作者发现， 它们的基因位点与细胞特异性H3K27me3标记相关 。这表明， 它们不仅受到复杂的TF网络的调控，而且在表观基因组水平上也受到调控 （图5e）。

利用来自于共定位模型的规则，在给定背景下作者对每个partner TF的相对重要性进行了评分，以反映peak集的联合分布（图6 d）。

为了从模型结果中获得全局视图，作者计算了 所有focus-TF的TF的平均RI 。观察到，整个集合显示出一个平均RI值趋于中低（即≤60RI，上下文相关性更高）的趋势， 较少的TF可以预测大量的focus-TF （即> 60 RI，高组合潜力）。例如，在104个TFs中， LATE ELONGATED HYPOCOTYL （LHY） 在分化叶截面中表达最高。LHY编码一个MYB TF，它是植物生物钟中的中心振子，基于RI预测的前三位伙伴TFs是ZIM18、bHLH172和COL7（图6e）。

尽管它们的功能尚未在玉米中鉴定，但它们的拟南芥同源物分别与茉莉酸信号，铁稳态和开花时间调节有关，所有这些都与昼夜节律紧密相关。

作者的发现证实， 共结合 可能是解释具 有相似序列偏好的TF如何靶向不同基因并控制不同生物学功能的关键 。共定位模型还揭示了TF结合位点的组合空间很大，这可能有利于特定组合的出现，从而促进了物种形成过程中调控网络的快速多样化。

接下来，作者研究 禾本科的转录调控网络是如何进化的 。作者在 高粱和水稻中进行了ATAC-seq ，并获得了 其同系玉米基因的开放染色质序列 。然后， 根据玉米TF的模型是否可以预测高粱和水稻中共同目标基因的开放染色质中的结合 ，来推断网络边缘保守性（图7a）。例如，作者在高粱中68％的同系开放染色质区域中发现了预测的TF结合事件。从同系TF到同系基因的预测网络边缘来看，作者推断玉米网络中约28％的边缘在高粱中是保守的，而约19％在水稻中是保守的（图7b）。

为了在植物中测试同源TF识别位点之间的强相关性，作者计算了玉米，高粱和水稻的开放染色质区域中每个TF模型的匹配数，发现它们确实相关（图7d）。此外，每个玉米TF在水稻和高粱中发现的保守靶点数量也存在相关性（图7e），表明在动植物进化过程中存在相似的选择压力。

❸ 转录因子实验研究方法有哪些

1.什么是转录因子

转录因子（Transcription factor，TF）的调控决定着基因的调控网络以及表达水平。基因的表达驱动着一系列的细胞活动，这些表达的调控需要通过转录因子（蛋白）和转录因子结合位点（DNA元件）的相互作用实现。转录水平的调控不是一个简单的独立过程，它是由上百个转录因子，目标序列以及共调控因子所组成的高度互作的基因调控网络。

2.为什么研究转录因子

一个课题最开始往往是研究某个基因的序列信息以及基因所行驶的功能作用，这些是属于基因的下游研究。但在下游研究累积到一定经验之后，老师往往开始着手于研究基因的上游调控机理，即不单关注基因A如何影响细胞活动，更关注哪些因素影响基因A的功能发挥。调控机理研究理论上会涉及多个层面的因素，例如：转录因子、蛋白激酶、miRNA、DNA甲基化、组蛋白修饰、lncRNA……

转录因子成为调控机理的研究大户是最正常不过的事情。因为一个转录因子能同时控制多个基因的表达，同时转录因子的功能作用也可能受多个共作用因子的影响。如果能阐明如此复杂的调控网络，这可是很有科研成就感的。

3.研究方法

现有主流的转录因子鉴别方法可分为两种：传统实验鉴别（experimental methods）以及通过计算机进行的生物信息学鉴别（computational methods）。简单来说，实验方法主要用于寻找不同类型目标，即通过已知TF寻找未知TFBS，或通过已知TFBS找出其对应TF。而生物信息学方法更多是用于同类型的预测，即通过序列保守性分析，通过已知TF预测未知TF，或通过已知TFBS预测未知TFBS。这些研究思路的关系如图1.

图1. 转录因子研究方式

3.1生物信息学预测（computational methods）

无论是TF还是TFBS的同类预测，生物信息的研究手段主要依赖于蛋白质或者DNA的序列保守性进行。具体算法和软件有隐马尔可夫模型,Gibbs抽样,贪婪算法等，但这次重点在于介绍研究转录因子的实验方法，因此不过于叙述这部分信息。

3.2实验方法筛选（experimentalmethods）

实验方法主要有两种思路：1. 通过已知TF寻找未知TFBS；2.通过已知TFBS寻找未知TF。无论哪种手段，前提都是基于蛋白与DNA之间的结合关系寻找，即交叉寻找目标，这有别于计算机技术的同类型寻找。

3.2.1通过已知TF寻找未知TFBS

如果已经锁定了一个感兴趣的TF，那常用思路是确定其TFBS，然后得知道它控制的下游基因。从已知TF定位到未知TFBS的过程，主要的实验方法包括ChIP-seq、DNaseI-seq、DamID-seq等体内实验，以及DIP-seq、SELEX(-seq)、PBM等体外实验。

这些研究的通量与应用范围如图2所示，其中，纵坐标表示可以从多大范围检测TFBS（检测通量），横坐标表示TF-TFBS的结合细节（检测精细程度）。以ChIP-seq为例，它可以在全基因组水平一次发现超过20万个结合位点信息，但只能确定到TFBS的序列信息（是ATTCG还是ACTCG），却难以了解到目标TF与TFBS之间的结合程度（TFBS能与TF结合多久，结合多牢固等信息）。

图2.多种转录因子研究方法的比较。 （CS：ConsensusSite，PWM: Position WeightMatrices）

3.2.1.1SELEX技术

Systematicevolution of ligands by exponential enrichment (SELEX) 是其中最早的一种体外检测转录因子结合位点技术，这项技术在20多年前已被科学家们利用，而且它不需要已知序列信息就可以检测到新的结合位点。它的原理是（图3a)：1.提取并纯化转录因子；2.随机打断的DNA文库与目标转录因子孵育；3.提取与TF结合的DNA，进一步PCR扩增片段；4.把PCR扩增的片段重复与TF孵育，最终筛选出高结合率的DNA。SELEX技术不需要已知的DNA片段信息就可以检测新TFBS，但不足之处在于它只能找出结合率高的TFBS，因此鉴定效率较低。

为了解决鉴定效率较低的问题，高通量测序技术可以联合SELEX筛选TFBS。关联高通量技术后，SELEX-seq只需要一轮筛选而不像之前需要多轮筛选，但它的问题在需要大量的高质量纯化蛋白以及前期实验操作复杂。

3.2.1.2Protein-binding Microarrays （PBM）技术

PBM技术（图3b）首先固定双链dna列阵在芯片当中，然后加入感兴趣的目标蛋白，孵育洗脱非结合蛋白后，加入带有荧光标记的抗体靶向目标蛋白，最后通过荧光信号鉴别蛋白-DNA结合关系。荧光强度会最终换算为PositionWeight Matrices（PWM），从而计算DNA的结合序列。

3.2.1.3DIP-seq

DIP-seq（图3c）是另外一种体外检测转录因子与dna关系的技术。与PBM不同，这种技术不需要预先固定DNA，它是通过检测染色质DNA来实现目标鉴定。大体的实验流程可分为：1.利用甲醛交联转录因子与DNA片段；2.切断DNA为100到500bp的片段；3.通过转录因子特异性抗体，富集与TF结合的DNA；4.去交联后，富集DNA进行芯片或高通量测序。

3.2.1.4ChIP-seq

ChIP-seq的实验过程与之间介绍的DIP-seq非常类似，唯一不同是，ChIP-seq可以通过甲醛原位交联TF与DNA，而DIP-seq只能在体外交联。ChIP-seq的优点是更高的分辨率，更低的噪音等。但它的弊端在于1.过于依赖蛋白数量，2.依赖于交联效率，3.抗体特异性及获取可能性。4.难以分辨直接结合还是间接结合的TF。

图3. 多种主流TF鉴定技术的操作流程

3.2.1.5.mechanically inced trapping of molecular interactions（****MITOMI）

MITOMI是少数可以测量TF与DNA解离系数Kd的实验技术，它具有中等通量，但却不适合用于de novo的TFBS鉴定。MITOMI具体流程图4：

1.将感兴趣的tf固定在玻璃上，接通微流管，倒入DNA；

2.DNA结合到固定的tf上；

3.富集结合的DNA，并洗脱未结合的片段；

4.通过富集的DNA数量计算蛋白-DNA解离系数Kd。

图4. MITOMI原理示意图

3.2.2.通过已知TFBS寻找未知****TF

比较常见的实验研究方法是酵母单杂交（Yeast one Hybrid，Y1H）及被称为反向ChIP实验 的PICh（Proteomicsof Isolated Chromatin segments）。

3.2.2.1酵母单杂交 （Y1H）

酵母单杂交能筛选到与DNA结合的蛋白质，并可直接从基因文库中得到编码该蛋白质的核苷酸序列，而无需复杂的蛋白质分离纯化操作，故在蛋白研究中，具有一定的优势；而且，酵母属真核细胞，通过酵母系统得到的结果，比其他体外技术获得的结果，更能体现真核细胞内基因表达调控的真实情况。

主要实验过程为：

1.把感兴趣的TFBS序列（Bait）插入报告基因上游，并将带有TFBS与报告基因的质粒整合到酵母基因组中，构建含有报告基因的酵母；

2.提取mRNA构建转录因子cDNA文库，并将文库与酵母激活因子融合相连，构建“Prey”文库。把带有文库的质粒转入到步骤1的酵母中。

3.条件筛选生长酵母，如果TF与TFBS有结合，即报告基因可以顺利表达。

图5.酵母单杂交技术原理

3.2.2.2PICh实验

PICh，又被称为反向ChIP实验，实际是通过分离的感兴趣DNA片段富集转录因子，最终利用质谱技术鉴定所富集的蛋白质。PICh所分离的TF难以被识别为直接还是间接结合因子，同时，现阶段来说，这项技术的通量相对较低，不适合大批量筛选TF。

注意事项

1.体外实验虽然可以鉴别很多蛋白-DNA相互作用，但由于生物体复杂性（共调控因子，竞争性转录因子等），这些体外识别的相互作用难以在体内重复或发现。

2.体内实验比较真实地还原转录因子-DNA之间的作用，却难以鉴别出直接还是间接作用关系。

3.利用PBM方法可以完成de novo TFBS鉴别。

4.检测通量一般受限于蛋白质的纯化质量及数量。

5.大多数方法难以分析解离系数，因此对DNA或蛋白质的洗脱难以把握。

6.除了实验方法，通过计算机技术鉴别结合位点的保守性从而预测新的转录因子目标区域已经被大量使用。但无论何种算法，这些预测都过于简单化TF-DNA之间的作用关系，从而造成极高的预测假阳性率。

7.(i)ChIP, HT-SELEX, 或PBM方法的目的在于发现结合序列或PWM。 (ii) MITOMI分析可用于进一步分析定量信息。(iii) ChIP实验可用于分析体内结合信息。

附录

多种体内外TF鉴定方法的对比：

method：方法；

synomyms：实验名称；

throughput：检测通量；

materialsneeds：所需实验材料，其中P代表protein，D代表DNA，“＋”到“＋＋＋＋”分别代表数据可用于定性，半定量，定量及动力学分析；

Datatype：实验所产生的数据类型；

resolution：分辨率（可检测碱基程度）。

❹ 如何研究基因调控

基因表达的主要过程是基因的转录和信使核糖核酸(mRNA）的翻译。基因调控主要发生在三个水平上，即①DNA水平上的调控、转录控制和翻译控制；②微生物通过基因调控可以改变代谢方式以适应环境的变化，
基因调控
这类基因调控一般是短暂的和可逆的；③多细胞生物的基因调控是细胞分化、形态发生和个体发育的基础，这类调控一般是长期的，而且往往是不可逆的。基因调控的研究有广泛的生物学意义，是发生遗传学和分子遗传学的重要研究领域。
通过基因调控，微生物可以避免过多地合成氨基酸、核苷酸之类物质。如果使它们的调节基因发生突变，就可以得到大量合成这些物质的菌种，把这些菌种用在发酵工业上，使产量大幅度增长。在遗传工程的研究中应用基因调控的原理可使外源基因表达(见重组DNA技术），所以基因调控的理论探讨还具有生产实践意义

❺ 转录因子相关调控研究案例（二）

本期解读文献 内容“ 在含氧量正常的情况下，三阴乳腺癌的LncRNA LINK-A激活HIF1α信号通路 ”

LncRNA LINK-A在细胞质中与蛋白BRK、LRRK2结合，当有胞外因子刺激时，LINK-A与蛋白复合物接收EGFR/GPNMB信号然后与转录因子HIF1结合，BRK将HIF1的Tyr 565磷酸化，LRRK2将HIF1的Ser 797磷酸化，HIF1磷酸化后进入细胞核与P300共同作用于癌相关基因的启动子促进基因转录表达。

作者首先通过检测三阴乳腺癌细胞和正常细胞的LINK-A表达验证在三阴乳腺癌中LINK-A高表达确定本文的主角；为了验证LINK-A与蛋白BRK和LRRK2结合，作者分别进行RNA pull-down、RIP、dot-blot验证并找出了与这两种蛋白结合的RNA位点；EGFR/GPNMB信号通路的激活：作者分别用RNA pull-down、co-IP、纯化标签融合蛋白的co-IP等实验验证了胞外因子HB-EGF刺激信号通路使HIF1磷酸化；用FISH、RIP和胞外激酶实验验证HB-EGF刺激使细胞中EGFR/GPNMB与LINK-A、BRK/LRRK2互作；用体外激酶实验和各种WB实验检测HIF1的磷酸化位点；作者先用co-IP验证HIF1与P300的互作，再通过对LINK-A进行BRK、LRRK2结合位点的突变检测HIF1的磷酸化和P300的结合来说明磷酸化的HIF1与P300互作是通过LINK-A与BRK、LRRK2结合后介导的；最后作者通过CHIP实验验证磷酸化的HIF1结合到靶标基因启动子上促进基因的表达。

Figure1说明的是LINK-A与蛋白BRK和LRRK2结合，并找到的与蛋白结合的RNA位点。

A、RNA pull-down，用LncRNALink-A探针钓取细胞内与之结合的蛋白，联用质谱分析。

B、RIP实验，用BRK和LRRK2蛋白抗体钓取与蛋白结合的RNA，然后进行Q-PCR检测验证Link-A与这两种蛋白高度结合。

C-D、RNA pull-down，用LINK-A探针分别与纯化的带FLAG标签融合蛋白BRK和带MYC标签的融合蛋白LRRK2孵育钓取结合蛋白，然后进行WB检测表明LINK-A直接与BRK以及LRRK2蛋白结合。

E、斑点印迹杂交，体外将生物素标记的LINK-A与标签融合蛋白结合然后进行斑点杂交检测LINK-A与蛋白的结合位点区段。

F、RNA pull-down，用LINK-A全长和去除斑点印迹法检测到的与蛋白结合位点的突变探针钓取蛋白，然后进行WB验证LINK-A与蛋白的结合区段。

Figure2说明的是HB-EGF诱导LINK-A-蛋白复合体与信号通路蛋白EGFR/GPNMB结合，并促使HIF1磷酸化。

A、RNApull-down，细胞经HB-EGF诱导后，用LINK-A探针钓取RNA结合蛋白，然后进行质谱检测，表明HB-EGF刺激使LINK-A结合蛋白GPNMB、BRK、HIF1等。

B、WB，分别用EGFR和GPNMB抗体检测经生长因子处理后的细胞蛋白，结果表明HB-EGF处理后，EGFR与GPNMB结合。

C、Co-IP，用EGFR钓取经各种胞外因子处理后细胞中与之结合的蛋白，然后进行WB检测，表明经HB-EGF处理后，EGFR与GPNMB结合。

D-E、分别用纯化的带标签融合蛋白EGFR和GPNMB钓取经HB-EGF处理后细胞中的结合蛋白，然后进行WB验证表明EGFR与GPNMB直接结合。

F、Co-IP，分别用BRK、GPNMB和HIF1蛋白抗体钓取经胞外因子处理后细胞中的结合蛋白，然后用HIF1磷酸化抗体进行WB检测，结果表明HB-EGF诱导HIF1磷酸化。

G、体外激酶实验，表明GPNMB被磷酸化。

H、用纯化的GPNMB带钓取经HB-EGF处理后中与之结合的蛋白，然后进行WB检测，表明HB-EGF处理后BRK与GPNMB结合并被磷酸化。

Figure3说明的是HB-EGF诱导细胞EGFR/GPNMB与BRK、LRRK2互作。

A、FISH，分别对LINK-A敲低细胞经HB-EGF处理后的细胞中EGFR和BRK进行定位，表明HB-EGF处理使这两种代表有互作。

B、LINK-A与蛋白BRF、LRRK2结合位点信息。

C、RIP，分别用LINK-A全长和去除蛋白结合位点的探针钓取细胞中与之结合的蛋白，然后用磷酸化的蛋白抗体进行WB验证，表明GPNMB和BRK磷酸化并验证了B图所示的结合位点。

D、FISH，表明HB-EGF处理后的细胞中EGFR和磷酸化的BRK互作。

E-F、体外激酶实验。

G、体外RNA-蛋白结合实验，用完整蛋白和去除部分组分的蛋白与LINK-A全长和去除蛋白结合位点的RNA进行结合实验。

Figure4说明的是HB-EGF激活信号通路BRK促进HIF1 Tyr565位点磷酸化，HIF1 Tyr565的磷酸化使Pro564羟基化。

A、体外激酶实验，表明HIF1的磷酸化位点为Tyr565和Ser797。

B、体外激酶实验，BRK促进HIF1 Tyr565位点磷酸化。

C、WB检测HB-EGF诱导各种蛋白磷酸化情况。

D-F、LINK-A敲低后经HB-EGF诱导的各种蛋白磷酸化情况。

G、HB-EGF处理细胞不同时间后检测HIF1 Tyr565和Ser797位点的磷酸化Pro564羟基化。

H、LINK-A敲低后经HB-EGF诱导的HIF1Tyr565和Ser797位点的磷酸化Pro564羟基化。

I、各种蛋白敲低后经HB-EGF诱导的HIF1 Tyr565和Ser797位点的磷酸化Pro564羟基

化。

Figure5说明的是LINK-A促进HIF1磷酸化，磷酸化的转录因子HIF1与P300互作促进靶标基因的转录。

A、co-IP，用HIF1抗体钓取LINK-A和LRRK2敲低后经HB-EGF诱导细胞中的结合蛋白，然后用WB验证，表明磷酸化的HIF1与P300结合。

B、co-IP，用纯化的带标签融合HIF1和Ser797位点突变的HIF1与细胞总蛋白孵育，然后用标签抗体钓取结合蛋白进行WB验证，表明Ser797位点突变的HIF1不能与P300结合。

C、将LINK-A全长和BRK、LRRK2结合位点突变的表达载体导入细胞，然后检测经HB-EGF诱导后的磷酸化的HIF1，表明LINK-A的BRK、LRRK2结合位点突变后，HIF1不能磷酸化。

D-E、CHIP-seq，HIF1抗体钓取HB-EGF处理后的细胞中与之结合的DNA片段，然后进行高通量测序，C为HIF1结合的DNA富集motif，D为结合的靶标。

F、CHIP-q-pcr，HIF1抗体钓取HB-EGF处理后的细胞中与之结合的DNA片段然后进行Q-PCR验证，表明HB-EGF促进HIF1与靶标基因启动子结合。

❻ 一个蛋白质编码基因实现其功能需要经历那些阶段通过哪些方式调控其功能的实现

经历的阶段：

1：经过转录形成了信使RNA信使RNA通过核孔，进入到细胞纸当中的内质网上的核糖体。

2：信使RNA又通过碱基互补配对，将一个个转运RNA连接在一起，此时就得到了初期的蛋白质。

3：内质网用膜把这些蛋白质包被起来，运送到高而基体，进行进部分加工，也是最终的加工。

方式调控：

1：转录前调控，主要有转录因子的调控和表观调控。转录因子调控就包括起始子，增强子之类的。

2：转录后调控主要是RNA的剪切。MRNA的寿命及稳定性和小RNA干扰，翻译后调控就是蛋白质的多种修饰了。

(6)转录后调控的研究方法扩展阅读：

1：早期发现的基因多数是编码蛋白质的基因，即DNA序列通过一定的规则指导蛋白的合成。蛋白质是地球上大多数生物体的必要组成成分，参与了细胞生命活动的每一个进程。

2：终产物是RNA的基因，是不指导生成蛋白质，而是以RNA的形式起作用，常被称为非编码基因。

3：以疾病防治为目标的基因检测通常针对蛋白编码基因，但随着对非编码基因研究的深入，针对它们的基因检测也会越来越多。

❼ 基因表达调控的方式有哪些

基因表达调控分为很多水平：
1.DNA、染色体水平调控：基因丢失、基因修饰、基因重排、基因扩增、染色体结构变化。
2.转录水平调控（主要调控方式）：转录起始、延伸、终止均有影响。原核生物借助于操纵子，真核生物通过顺式作用元件和反式作用因子相互作用进行调控。
3.转录后水平调控：主要指真核生物原初转录产物经过加工成为成熟的mRNA，包括加帽、加尾、甲基化修饰等。
4.翻译水平调控：对mRNA稳定性的调控、反义RNA对翻译水平的调控等。
5.翻译后水平调控：蛋白质的剪切、化学修饰（磷酸化、乙酰化、糖基化等）、转运等。
6.mRNA降解的调控。

❽ 通过什么方法，想要研究某个过程是否影响一些基因的转录后调节

控制其他过程不变，只改变这个过程，通过pcr测定转录产物的量是否变化，可以知道是否影响了转录量。通过测序的方法可以知道这一过程是否影响到了转录后的修饰。

❾ 转录因子相关调控研究案例（一）

由8q24基因编码产生的一种新型LncRNA CCAT2促进癌细胞的转移进程和增强染色体的稳定性 。

LncRNA CCAT2由rs69x3267snp基因转录产生，CCAT2的表达结合转录因子TCF7L2并将其结合到靶标基因启动子上促进基因转录为RNA，这些靶标基因编码与细胞增殖相关的蛋白，同时转录的RNA经剪切加工后可产生miR-17-5p。

作者首先用Q-PCR检测结肠癌病人样本中结肠癌细胞和癌旁组织细胞的LncRNA表达，表明LncRNA CCAT2在结肠癌细胞中高表达，然后用原位杂交验证LncRNA在结肠癌细胞中的高表达从而确定了本文的主角LncRNA CCAT2。随后作者对CCAT2分别进行功能研究和作用机制研究。

（1）功能研究：作者建立CCAT2的过表达稳定细胞株进行小鼠体内成瘤试验和细胞迁移试验，建立CCAT2敲低稳定株进行细胞侵袭实验和基因不稳定性检测说明CCAT2对肿瘤细胞增殖的作用。

（2）机制研究：机制研究可分为两个方面，一是在较大的方向上说明CCAT2促进MYC和miR-17-5p的表达，二是说明CCAT2通过招募转录因子促进MYC和miR-17-5p表达。作者首先用Q-PCR和WB检测CCAT2过表达/敲低细胞的MYC的表达说明CCAT促进MYC基因转录为mRNA，用q-pcr检测CCAT2过表达后microRNA的表达说明CCAT2促进miR-17-5p的表达，通过添加microRNA的反向互补序列检测细胞的迁移，说明miR-17-5a促进细胞迁移。作者用Q-PCR检测细胞核质分离后的CCAT2表明CCAT2在细胞核内，随后通过CHIP和RIP实验验证CCAT2和转录因子TCF7L2与Myc启动子结合，然后用FISH检测CCAT2过表达细胞的MYC表达等一系列实验说明CCAT2通过招募转录因子激活基因转录促进蛋白表达。最后作者检测CCAT2过表达后的CD44和vim mRNA说明CCAT2促进这两种基因转录。

Figure1.说明的是LncRNA CCAT2促进MYC、miR-17-5p、miR-20a的表达，促进细胞增殖转移 。

A、 分别用WB和Q-PCR检测CCAT2过表达后的MYC表达，表明CCAT2过表达促使MYC表达升高。

B、 Q-pcr检测CCAT2过表达后的microRNA的表达，结果表明CCAT2过表达使miR-17-5p和miR-20a表达升高，miR-146a表达下降。

C、 别用WB和Q-PCR检测CCAT2敲低后的MYC表达，表明CCAT2敲低促使MYC表达下降。

D、 通过添加microRNA的反向互补序列检测细胞的迁移，表明miR-17-5a和miR-20a的互补序列使细胞迁移能力下降。说明miR-17-5a和miR-20a促进细胞迁移。

Figure2.说明的是CCAT2结合转录因子TCF7L2到MYC等基因启动子上促进表达。

A、 核质分离后，q-pcr检测CCAT2，表明CCRT2在细胞核内。

B、 CHIP实验，用转录因子蛋白TCF7L2抗体钓取与之结合的DNA片段，然后进行q-pcr检测，表明TCF7L2与MYC启动子结合。

C、 RIP实验，用转录因子蛋白TCF7L2抗体钓取与之结合的RNA片段，然后进行q-pcr检测，表明TCF7L2与lncRNA CCAT2结合。

D、 蛋白FISH，用荧光免疫原位杂交检测CCAT2过表达细胞的波形蛋白，表明CCAT2过表达细胞的波形蛋白信号很强。

E、 Q-PCR检测CCAT2过表达后的CD44和波形蛋白mRNA的表达。

❿ 真核生物基因表达调控有哪些环节

可分为三种主要途径环节：

1、遗传调控（转录因子与靶标基因的直接相互作用）；

2、调控转录因子与转录机制相互作用，

3、表观遗传调控（影响转录的DNA结构的非序列变化）。

转录调控

通过转录因子直接调控靶标DNA表达是最简单和最直接的转录调控改变转录水平的方法。基因的编码区周围通常都具有几个蛋白质结合位点，具有调节转录的特定功能。常见的调控蛋白质与DNA结合的位点有增强子、绝缘子和沉默子。调节转录的机制非常多样，可以阻断DNA上与RNA聚合酶结合的关键位点，也可以充当激活剂辅助RNA聚合酶结合来促进转录。

转录因子的活性进一步受到细胞内信号的调节，引起蛋白质翻译后修饰，包括磷酸化乙酰化或糖基化。这些变化影响转录因子直接或间接转录因子与启动子DNA的 结合、RNA聚合酶的募集以及新合成RNA分子的延伸。

真核生物中的核膜通过允许这些转录因子在细胞核中存在的持续时间来进一步调控转录环境刺激或内分泌信号可能导致调节蛋白的修饰，引发细胞内信号的级联，导致基因表达的调节。